CN105189735A - 在培养期间减少乳酸累积的方法和生产多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用二价过渡金属盐降低细胞培养物中的乳酸产量的方法。本发明还涉及生产多肽的方法，所述方法通过将二价过渡金属盐添加至细胞培养基以减少乳酸累积，随后使多肽发酵并回收多肽。

Description

在培养期间减少乳酸累积的方法和生产多肽的方法
技术领域。
本发明涉及减少细胞培养物中的乳酸累积的方法，所述方法包括将二价过渡金属盐添加至细胞培养物的步骤。本发明还涉及生产多肽的方法，所述方法包括将二价过渡金属盐添加至细胞培养基以减少乳酸累积，以及使多肽发酵和回收多肽的步骤。更具体地，本发明涉及使细胞在细胞培养系统中生长的方法，所述细胞培养系统减少培养基中的乳酸累积。
背景技术
动物细胞培养技术广泛应用于生物医药研究和制药工业。评估细胞生长和代谢活动是成功控制和改进细胞培养过程的关键。最常用的两种被监测代谢产物是葡萄糖和乳酸。葡萄糖作为大部分培养基配方的主要碳源和重要的能量来源。葡萄糖进入糖酵解途径导致形成丙酮酸作为终产物。在动物细胞中，丙酮酸可以穿梭于TCA循环中或被转化成乳酸。由于葡萄糖转变为丙酮酸的高通量以及糖酵解和TCA循环之间的低效结合，导致在连续细胞培养中易于发生乳酸累积。积聚的乳酸转而导致培养环境的酸化。此外，即使在控制PH的情况下，乳酸本身也可能对哺乳动物细胞产生毒性。乳酸的积累往往是细胞培养过程的关键限制因素，特别是当细胞密度高时。
在生物制药生产中，由于简单和可靠的测量及其在培养基中的化学稳定性，监测葡萄糖和乳酸已成为日常操作。更重要的是，葡萄糖浓度用于评估能量，而乳酸作为代谢副产物累积的重要参数和培养环境恶化的指标。在生物反应器操作中，作为重要的培养参数，葡萄糖和乳酸测量通常是设计过程控制，比如进料或灌注策略，的关键部分。
在过去，对葡萄糖和乳酸代谢与细胞密度的相关性做了很大努力。葡萄糖的消耗速率和乳酸的累积速率反映培养的细胞的代谢活性。
如之前所述，有毒副产物，如乳酸，的积累对细胞生长和抗体的生产有抑制作用。过量的乳酸积聚可以导致培养基的渗透压的增加，或在不控制pH的情况下，导致培养PH下降。乳酸的主要负面影响是由乳酸分泌至培养基中引起的pH值的降低造成的。
美国专利号6156570教导用于培养细胞优选哺乳动物细胞的、使乳酸累积量最小化的方法。
美国专利号7429491教导在动物细胞培养中将有限的葡萄糖用于分批补料培养的提高蛋白质产量的方法。
在过去，已经尝试降低乳酸水平，主要通过A]补充并保持非常低水平的葡萄糖；或B]利用分子生物技术的细胞代谢工程。
本发明揭示了添加二价过渡金属盐（铜，锌）和乳酸累积之间的相关性以及减少乳酸累积的可能途径。
发明内容
因此，本发明涉及减少细胞培养物中的乳酸的累积的方法，所述方法包括将二价过渡金属盐加入细胞培养物中的步骤；以及生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤：a）将二价过渡金属盐加入细胞培养物中以减少乳酸累积；以及b）使多肽发酵并回收多肽。
附图说明
图1A展示了存在铜盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图1B展示了存在锌盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图2A展示了存在铜盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图2B展示了存在锌盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图3展示了存在锌盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图4A展示了存在铜盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图4B展示了存在锌盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图5A展示了存在铜盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图5B展示了存在锌盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图6展示了存在镁盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
图7展示了存在锌盐的情况下Vs对照的乳酸累积水平的区别。
具体实施方式
本发明涉及一种减少细胞培养物中的乳酸累积的方法，所述方法包括将二价过渡金属盐加入细胞培养物的步骤。
在本发明的实施例中，所述二价过渡金属盐具有选自铜和锌的金属。
在本发明的实施例中，铜盐为硫酸铜，并且锌盐为硫酸锌。
在本发明的另一实施例中，所述细胞从哺乳动物细胞系获得。
在本发明的另一实施例中，所述哺乳动物细胞系选自中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、NS0(非分泌型0)和BHK（幼仑鼠肾）。
在本发明的另一实施例中，添加约0.2mM至约0.4mM的浓度范围的所述二价过渡金属离子。
在本发明的另一实施例中，所述培养在选择以下的系统中进行，包括，但不限于：分批补料培养、分批培养、摇瓶和生物反应器。
在本发明的另一实施例中，乳酸水平累积量减少约5%至约40%
本发明也涉及生产多肽的方法，所述方法包括将二价过渡金属盐加入细胞培养物以减少乳酸累积，以及使多肽发酵并且回收多肽的步骤。
在本发明的另一实施例中，所述细胞从哺乳动物细胞系获得。
在本发明的另一实施例中，所述哺乳动物细胞系选择以下细胞系，包括，但不限于：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、NS0和BHK。
在本发明的另一实施例中，所述二价过渡金属盐具有选自铜和锌的金属。
在本发明的另一实施例中，铜盐为硫酸铜，并且锌盐为硫酸锌。
在本发明的另一实施例中，添加约0.2mM至约0.4mM浓度范围的所述盐。
在本发明的另一实施例中，所述多肽选自以下抗体，包括但不限于：抗VEGF-A抗体、抗Her-2抗体、抗CD6抗体，和抗TNF抗体。
在本发明的另一实施例中，所述培养过程在选择以下任一系统中进行，包括，但不限于：分批补料培养、分批培养、摇瓶和生物反应器。
在本发明的另一实施例中，本发明涉及利用改进的细胞培养方法降低乳酸累积量的方法，所述改进的细胞培养方法包括细胞生长阶段和多肽生产阶段。
因此，本发明提供一种借助例如单克隆抗体来生产多肽的方法，该方法可以减少乳酸累积量。
进一步地，本发明描述减少的乳酸累积量的范围为从约5%至约40%。
本发明涉及通过减少乳酸累积的过程来生产单克隆抗体的方法。
在本发明的实施例中，其中乳酸累积量的下低通常与标准生产程序相关。
在本发明的另一实施例中，描述了在分批补料培养系统中添加二价过渡金属盐降低乳酸累积的方法。
在本发明的实施例中，所述二价过渡金属盐包括铜盐和锌盐。
在本发明的另一实施例中，培养基中所用的锌盐和铜盐的浓度为约0.4mM。
在本发明的另一实施例中，铜的二价过渡金属盐为硫酸铜，而锌的金属盐为硫酸锌。
在本发明的另一实施例中，所述二价过渡金属盐的浓度是指该盐在培养基中的浓度。
在本发明的另一实施例中，这些锌和铜金属离子是参与糖酵解&TCA途径的酶活性所需的，因此，添加这些离子可改进使大部分葡萄糖完全氧化的细胞的总代谢效率，从而减少乳酸累积。
在本发明的另一实施例中，所述培养基为限定化学成分培养基，所述限定化学成分培养基包括，但不限于HyCloneCDM4NS0和HyCloneCDM4Mab。
在本发明的另一实施例中，所述哺乳动物细胞选自如下细胞，包括，但不限于：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、非分泌型0(NS0)和幼仑鼠肾（BHK）。
在本发明的另一实施例中，所述多肽选自以下抗体，包括但不限于：抗VEGF-A抗体、抗Her-2抗体、抗CD6抗体，和抗TNF抗体。
在本发明的另一实施例中，用设备YSI7100MBS分析仪（YSI7100MBSAnalyzer）分析培养基中的乳酸水平。
在本发明的另一实施例中，乳酸累积的减少使培养性能，如总PH维持、细胞维持，总体更好。所述二价过渡金属盐的添加，例如锌盐/铜盐，使乳酸累积减少，并且还维持培养基的PH。
在本发明的实施例中，所述二价过渡金属盐还可以限定为二价固定金属离子。
在本发明的另一实施例中，本发明还涉及改进生产蛋白质的方法，例如，蛋白质的大规模商业生产，例如，抗体生产。
在本发明的另一实施例中，本发明还涉及使细胞在细胞培养系统中生长的方法，所述细胞培养系统减少培养基中的乳酸累积。
在本发明的另一实施例中，添加二价过渡金属盐，即，锌盐/铜盐进一步使乳酸累积量减少约5%至约40%。
术语定义
在本发明的描述中，可以使用下列术语，其定义在此描述。
术语“抗体”包括抗体或抗体衍生物，或其片段，并且抗体的说明也适用于本发明的抗体的制备。在抗体的片段中，功能相当或同源的抗体包括含有免疫球蛋白结合结构域的多肽或摹拟该结合结构域，以及Fc区或与Fc区或至少部分Fc区同源的区的肽。也包括与另一多肽融合的、含有免疫球蛋白结合结构域，或等同物的嵌合分子。
典型的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有抗体决定簇的部位，包括被称为Fab、Fab'、F(ab')2、Fc和F(v)，以及N-多糖结构的这些部位。抗体描述了血清的功能成分并且通常指的是许多分子（抗体或免疫球蛋白，片段等等）或一种分子（抗体分子或免疫球蛋白分子）。抗体分子能与特定的抗原决定簇（抗原或抗原表位）结合或反应，这反过来可以诱导免疫效应机制。单独的抗体分子通常被看成是单一特异性的并且抗体分子的组合物可以是单克隆的（即，由相同的抗体分子组成）或多克隆的（即，由与相同抗原上或有差别的不同的抗原上相同或不同表位反应的不同的抗体分子组成）。组成多克隆抗体的差别的和不同的抗体分子可以称为“成员”。每种抗体分子具有能使其特异性结合至该分子相应的抗原的唯一的结构，并且所有的天然抗体分子具有两条相同的轻链和两条相同的重链的相同的整体基本结构。
在此使用的短语“多肽”或“多肽产物”与术语“蛋白质”和“蛋白质产物”分别同义，并且按本领域中通常的理解，指的是至少一条通过连续的肽键连接的氨基酸链。在一些实施例中，“感兴趣的蛋白质”或“感兴趣的多肽”或类似物为已经转化到宿主细胞中的外源核酸分子编码的蛋白质。在一些实施例中，其中已经转化到宿主细胞中的外源DNA编码“感兴趣的蛋白质”，外源DNA的核酸序列确定氨基酸的序列。在一些实施例中，“感兴趣的蛋白质”为宿主细胞的内源核酸分子编码的蛋白质。在一些实施例中，通过用可以例如，包含一条和更多条调控序列，和/或编码增强感兴趣的蛋白质的表达的蛋白质的外源核酸分子转染宿主细胞改变这种感兴趣的内源蛋白质的表达。
在此使用的“抗体变体”指的是具有与母源抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体。优选地，抗体变体包括具有在自然界中没发现的氨基酸序列的重链可变结构域或轻链可变结构域。这种变体必须与母源抗体具有低于100%序列一致性或相似性。在优选的实施例中，所述抗体变体具有这样的氨基酸序列：与母源抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有约75%至低于100%，更优选地约80%至低于100%，更优选地约85%至低于100%，更优选地约90%至低于100%，最优选地约95%至低于100%的氨基酸序列一致性或相似性。相对于该序列的一致性或相似性在此定义为候选序列中与母源抗体残基一致的氨基酸残基（即，相同的残基）的百分比，必要时，将序列与引入空隙对齐，以实现最大百分比的序列一致性。
在此使用的术语“培养基”、“细胞培养基”和“培养基”指的是含有滋养生长的动物细胞，例如，哺乳动物细胞的养分的溶液，并且也指的是与细胞结合的培养基。
优选的哺乳动物宿主为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。本领域技术人员周知通过基因工程改造的细胞和/或细胞系表达感兴趣的蛋白质的方法和载体。基因工程技术包括，但不限于表达载体、定向同源重组和基因激活。可选地，该蛋白质在异源调控元件，比如，在自然界中不引导多肽生产的启动子，的控制下表达。例如，该启动子可以为引导哺乳动物多肽表达的病毒型强启动子（例如，CMV，SV40）。该宿主细胞通常可以或不可以生产蛋白质。例如，该宿主细胞可以为CHO细胞，该CHO细胞通过基因改造产生蛋白质，意味着编码该蛋白质的核酸已经导入该CHO细胞中。
乳酸，哺乳动物细胞生长期间产生的副产物，对细胞有潜在的毒性。乳酸累积影响培养基的缓冲能力，导致PH下降。应该看到乳酸不仅对细胞生产和生产率有副作用，而且对产物总体质量也有副作用。已经尝试几种方法减少培养基中的乳酸累积。该方法包括使细胞在低葡萄糖浓度下生长、使丙酮酸脱羧酶过度表达和敲除乳酸脱氢酶-A（LDH-A）基因。
以下实施例展示了如何通过添加某些二价过渡金属盐操纵过程从而减少在过程中的乳酸累积。在整个进程中乳酸减少了近5～40%。
在本发明的实施例中，所述二价过渡金属盐还可以定义为二价过渡金属离子。
在本发明的实施例中，可以使用的从培养基分离蛋白质/抗体的已知的常规技术为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。
在本发明的另一实施例中，亲和层析技术已被用作从培养基中分离抗体的优选技术。
上文所述的本发明的具体实施例是出于描述和说明的目的。这些实施例不能视为对本发明的详尽记录或限制。可以对上述教导进行各种修改和改变。此外，可以进行许多修改以适应用于本发明的目的、本质和范围的各种情况、材料、物质的组合物、工艺、工艺步骤。所有的这些修改都在本发明的权利要求的范围内。
结合以下实施例，进一步描述本发明的技术。但是，这些实施例不构成对本发明的范围的限制。
实施例：
利用YSI7100MBS分析仪对以下实施例中的下述所有试验进行乳酸水平分析。以下实施例所列举的所有试验的PH保持在PH6.85-7.2之间。通过在摇瓶培养箱中鼓动保持氧气水平。在所有下述实施例中，添加的盐浓度为培养基中存在的盐浓度。基于所用的细胞的性质和其它相关参数，可以适当改变温度。
已经将两种二价金属过渡金属盐用于实施本发明。该两种二价过渡金属盐为五水硫酸铜和七水硫酸锌。
实施例1：
实施例1（A）
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。对CHO细胞进行基因工程改造以产生抗VEGF-A抗体。将浓度为0.4mM的五水硫酸铜盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何铜盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。以下表1公开了整个进程中减少的乳酸水平。接着，用亲和层析技术从培养基中收集产生的抗VEGF-A抗体。
表1：
对照的乳酸累积量减少约61%，而添加了盐的培养基的乳酸累积量减少约87.5%。该实施例表明在存在上述盐的情况下，乳酸累积量进一步减少约26.5%。
图1（A）展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例1（B）
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。对CHO细胞进行基因工程改造以产生抗VEGF-A抗体。将浓度为0.4mM的七水硫酸锌盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何锌盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。以下表2公开了整个进程中减少的乳酸水平。接着，用亲和层析技术从培养基中收集产生的抗VEGF-A抗体。
表2：
对照的乳酸累积量减少约61.32%，而添加了盐的培养基的乳酸累积量减少约72.89%。该实施例表明在存在上述盐的情况下，乳酸累积量进一步减少约11.57%。
图1（B）展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例2：
实施例2A:
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。对CHO细胞进行基因工程改造以产生抗Her-2抗体。将浓度为0.4mM的五水硫酸铜盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何铜盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。以下表3公开了整个进程中减少的乳酸水平。接着，用亲和层析技术从培养基中收集产生的抗Her-2抗体。
表3：
对照的乳酸累积量减少约50.5%，而添加了盐的培养基的乳酸累积量减少约65%。该实施例表明在存在上述盐的情况下，乳酸累积量进一步减少约14.5%。
图2（A）展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例2B：
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。对CHO细胞进行基因工程改造以产生抗Her-2抗体。将浓度为0.4mM的七水硫酸锌盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何锌盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。以下表4公开了整个进程中减少的乳酸水平。接着，用亲和层析技术从培养基中收集产生的抗Her-2抗体。
表4：
对照的乳酸累积量减少约34.5%，而添加了盐的培养基的乳酸累积量减少约64.88%。该实施例表明在存在上述盐的情况下，乳酸累积量进一步减少约30.38%。
图2（B）展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例3：
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。对CHO细胞进行基因工程改造以产生抗CD6抗体。将浓度为0.4mM的七水硫酸锌盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何锌盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。以下表5公开了整个进程中减少的乳酸水平。接着，用亲和层析技术从培养基中收集产生的抗CD6抗体。
表5：
对照的乳酸累积量减少约70.55%，而添加了盐的培养基的乳酸累积量减少约82.22%。该实施例表明在存在上述盐的情况下，乳酸累积量进一步减少约11.67%。
图3展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例4：
实施例4（A）
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。对CHO细胞进行基因工程改造以产生抗TNF抗体。将浓度为0.4mM的五水硫酸铜盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何铜盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。以下表6公开了整个进程中减少的乳酸水平。接着，用亲和层析技术从培养基中收集产生的抗TNF抗体。
表6：
对照的乳酸累积量减少约15.38%，而添加了盐的培养基的乳酸累积量减少约28.43%。该实施例表明在存在上述盐的情况下，乳酸累积量进一步减少约13.05%。
图4（A）展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例4（B）
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。对CHO细胞进行基因工程改造以产生抗TNF抗体。将浓度为0.4mM的七水硫酸锌盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何锌盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。以下表7公开了整个进程中减少的乳酸水平。接着，用亲和层析技术从培养基中收集产生的抗TNF抗体。
表7：
对照的乳酸累积量减少约17.37%，而添加了盐的培养基的乳酸累积量减少约23.46%。该实施例表明在存在上述盐的情况下，乳酸累积量进一步减少约6.09%。
图1（B）展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例5：
实施例5（A）
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。对CHO细胞进行基因工程改造以产生抗VEGF-A抗体。将浓度为0.2mM的五水硫酸铜盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何铜盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。以下表8公开了整个进程中减少的乳酸水平。接着，用亲和层析技术从培养基中收集产生的抗VEGF-A抗体。
表8：
对照的乳酸累积量减少约79.23%，而添加了盐的培养基的乳酸累积量减少约85.40%。该实施例表明在存在上述盐的情况下，乳酸累积量进一步减少约6.17%。
图5A展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例5（B）
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。对CHO细胞进行基因工程改造以产生抗VEGF-A抗体。将浓度为0.2mM的七水硫酸锌盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何锌盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。以下表9公开了整个进程中减少的乳酸水平。接着，用亲和层析技术从培养基中收集产生的抗VEGF-A抗体。
表9：
对照的乳酸累积量减少约79.23%，而添加了盐的培养基的乳酸累积量减少约88.41%。该实施例表明在存在上述盐的情况下，乳酸累积量进一步减少约9.18%。
图5B展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例6：
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。也将浓度为0.4mM的、用作负对照的硫酸镁盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何镁盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度降低至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。
图6展示了培养基中乳酸的下降水平。
实施例7：
以分批补料方式进行细胞培养。在该细胞培养中，所用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢（CHO）细胞并在起初提供HyCloneCDM4NS0培养基。也将浓度约0.3mM的七水硫酸锌盐加入培养基中。与之相反，在对照培养基中不添加任何硫酸锌盐。以起始细胞数量0.3-0.45x106细胞/ml，37±1oC开始生产发酵进程，前3-4天细胞在间歇期生长。在下一步骤中，温度下降至31+/-1°C并且继续进程直到第7天。
图7展示了培养基中乳酸的下降水平。

Claims (16)

1.一种减少细胞培养物中的乳酸累积的方法，所述方法包括将二价过渡金属盐加入所述细胞培养物中的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二价过渡金属盐为选自铜和锌的金属盐。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述铜盐为硫酸铜，所述锌盐为硫酸锌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞获自哺乳动物细胞系。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞系选自如下细胞系，包括，但不限于：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、NS0(非分泌型0)和BHK（幼仑鼠肾）。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，添加约0.2mM至约0.4mM浓度范围的所述二价过渡金属离子。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养在选择以下的系统中进行，包括，但不限于：分批补料培养、分批培养、摇瓶和生物反应器。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸水平累积量减少约5%至约40%。
9.一种生产多肽的方法，所述方法包括如下步骤：
a.将二价过渡金属盐加入细胞培养物中以减少乳酸累积；以及
b.使多肽发酵并回收多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞获自哺乳动物细胞系。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞系选自如下细胞系，包括，但不限于：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、NS0(非分泌型0)和BHK（幼仑鼠肾）。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述二价过渡金属离子为选自铜和锌的金属离子。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述铜盐为硫酸铜，所述锌盐为硫酸锌。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，添加约0.2mM至约0.4mM浓度范围的盐。
15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述多肽选自以下抗体，包括但不限于：抗VEGF-A抗体、抗Her-2抗体、抗CD6抗体，和抗TNF抗体。
16.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养过程在选择以下的任何系统中进行，包括，但不限于：补料分批培养、分批培养、摇瓶和生物反应器。
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