CN104195173B - 具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体 - Google Patents

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本发明涉及一种可扩增的同时具有两个表达盒的谷氨酰胺合成酶表达载体,该表达载体主要元件由6大部分组成:第一表达盒元件、第二表达盒元件、f1复制子、谷氨酰胺合成酶表达盒元件、氨苄青霉素β内酰胺酶水解表达盒元件和ColE1复制子,其中第一表达盒元件、第二表达盒元件中采用的是强的增强/启动子CMV立早增强子/启动子;谷氨酰胺合成酶表达盒元件中采用弱的启动子/增强子SV40,降低谷氨酰胺合成酶的表达,有利于高表达克隆的筛选。表达蛋白编码基因分别通过多克隆位点A和多克隆位点B克隆至表达载体。该载体适于在哺乳动物细胞中同时高效表达1‑2种蛋白,特别适用于抗体蛋白的表达。

Description

具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体
技术领域:
本发明涉及生物制药基因工程表达技术,具体涉及一种用于高表达细胞株开发的载体的构建及应用。
背景技术
诞生于70年代末的生物制药因其具有其他药物无法比拟的优点,已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。生物技术的主要应用领域是我国改善民生的重要组成部分,我国庞大的人口基数和巨大的药物消费增长潜力,为我国生物技术的发展提供了比国外更为广阔的市场需求和发展潜力。生物制药的应用主要在这几个领域:各种肿瘤、自身免疫性疾病(如红斑狼疮、哮喘、多发性硬化症、风湿性关节炎等)、糖尿病、心血管疾病等多发病、常见病的诊断和治疗。近年来,生物制药全球生物技术药物增长率为15%~33%,远高于年增长率为7%~10%的传统制药业,其总销售额占药物市场总额的比例从2000年的9%上升至2014年的23%。生物技术药物2014年销售总额估计可达1690亿美元,其中单抗药物至少占一半。
生物制药研究与开发的主要环节包括:基因的克隆和基因工程菌的构造;重组细胞获得和筛选;目的产物的分离纯化等技术环节。目前已有多种表达系统用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质药物,主要的表达系统有原核表达系统(大肠杆菌,E.coli)、酵母、昆虫和哺乳动物细胞系统。其中哺乳动物细胞表达系统因哺乳动物细胞内有蛋白折叠形成正确立体空间构象所需要的分子伴侣,表达的糖基化蛋白药物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子,因而越来越受到重视。哺乳动物细胞表达体系主要由宿主细胞和表达载体两部分组成。表达细胞以中国卵巢癌细胞(CHO)表达体系最具代表性。蛋白在哺乳动物细胞表达的过程是重组表达载体与宿主细胞之间相互作用的一个复杂过程,包括5个相对独立的环节:重组表达载体在宿主细胞染色体上的定位,主要指整合位点和基因拷贝数;蛋白mRNA的转录,包括转录效率和稳定性;蛋白药物基因的翻译;蛋白药物的翻译后加工、组装;蛋白药物的分泌等。
表达载体系统是获得高效表达细胞株的关键,在确定宿主细胞后,蛋白药物的表达量很大程度上由其表达载体的各表达调控元件及组成方式决定。一般来讲,表达载体包括以下几种基本元件:骨架序列、选择性标志基因、表达盒以及一些调控序列。根据基因拷贝数是否扩增,表达载体可分为2类:可扩增和不可扩增表达的载体系统。可扩增载体系统具有特殊的选择标志基因在外加的选择压力下实现宿主细胞染色体上的基因拷贝数的扩增,并可以连带两侧的序列一同扩增,从而提高目的蛋白基因在宿主细胞染色体上的基因拷贝数。不可扩增的表达载体系统则在选择压力下不具备基因拷贝数的扩增。虽然目的基因低拷贝的载体也能达到较高水平的蛋白表达量,但若使用可扩增表达载体可转录出更多的目的蛋白的mRNA,更易获得目的蛋白的高效表达。实现蛋白药物产业化绝大多数采用可扩增表达载体。
在哺乳动物细胞大规模生产中,常用的可扩增选择标志基因最常用的基因筛选扩增系统有二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)系统和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)系统。二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤(methotrexate,MTX)所抑制,含有的目的基因及与之相连的DHFR基因的重组质粒转化CHODHFR-细胞,利用浓度不断提高的MTX选择出抗MTX的高表达细胞系,DHFR基因及与之相连的目的基因一起扩增500-2000倍,从而使目的基因表达水平提高数百倍。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)系统是近年来新发展的一种基因筛选扩增系统。谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量时,利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺,在缺乏外加谷氨酰胺的培养条件下,加入谷氨酰胺合成酶的抑制剂蛋氨酸磺酰胺(methionine sulphoximine,MSX),可使GS基因及与之相连的目的基因扩增,达到提高目的基因表达水平的目的。GS较DHFR系统有明显的优越性:该系统不需要基因缺陷型的CHO细胞株作为宿主细胞,使该系统较DHFR系统更具有通用性;CHO细胞较易于培养,更强壮;在转染、筛选和工程细胞驯化中的优越性更为突出,筛选得到高表达量工程细胞株的概率高、周期短。二氢叶酸还原酶系统为逐渐提高MTX的浓度需要多轮筛选,GS系统仅需一轮筛选就可得到高表达细胞株;GS系统大规模发酵时培养基中无需添加谷氨酰胺,可利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺,避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨浓度过高,造成对培养细胞的损伤,降低了工艺控制的难度。因此,GS表达系统在构建一种适用于哺乳动物细胞,尤其是CHO细胞的高效表达载体在工业生产中意义重大。
同时对两个感兴趣的基因进行表达的系统常见的有Clontech的pIRES系统和Lonza公司的pEE系统(比如,pEE6.4载体和pEE12.4载体)。pIRES是在两个感兴趣的基因间插入一个内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),转录出的一条成熟mRNA可同时翻译出两条蛋白序列。该系统的特点或缺点是第2条蛋白表达水平较第1条蛋白的要低很多。pIRES系统的缺点是所表达的两蛋白表达水平差异较大,不适于表达水平均一性的两种蛋白,更为重要的是pIRES系统为NEO筛选系统,为不可扩增表达的载体系统,不适于蛋白的高效表达。pEE系统构建比较繁琐,完成一个同时表达两种蛋白的表达体系需3个步骤:将两目标蛋白编码基因分别构建到pEE6.4载体和pEE12.4载体中,然后通过双酶切(NotI和BamHI或NotI和SalI)的方法将两个独立的表达载体构建成一个可扩增的谷氨酰胺合成酶表达载体。pEE表达系统目前已广泛用于科研和产业化方面。
发明内容
为克服pIRES系统和pEE系统的各自缺点,本发明构建的p327.7表达载体系统不仅是一种可扩增表达的载体系统(GS表达系统),适用于蛋白的高效表达,而且操作简便,所要表达的两种蛋白编码基因分别构建至第一表达盒和第二表达盒即可完成表达两种蛋白表达载体的构建。
本发明涉及一种可扩增的同时具有两个表达盒的谷氨酰胺合成酶p327.7表达载体,该表达载体主要元件由6大部分组成:第一表达盒元件、第二表达盒元件、f1复制子、谷氨酰胺合成酶表达盒元件、氨苄青霉素β内酰胺酶水解表达盒元件和ColE1复制子,其中第一表达盒元件、第二表达盒元件中采用的是强的增强/启动子CMV立早增强子/启动子,有利于目标蛋白的表达;表达蛋白编码基因分别通过多克隆位点A和多克隆位点B克隆至表达载体;谷氨酰胺合成酶表达盒元件中采用弱的启动子/增强子SV40,降低谷氨酰胺合成酶的表达,有利于高表达克隆的筛选。为便于测序在多克隆位点A和多克隆位点B的5’端和3’端分别设计了T7RNA聚合酶启动子和T3RNA聚合酶启动子序列。该载体适于在哺乳动物细胞中同时高效表达1-2种蛋白,特别适用于抗体的表达。
附图说明
图1:p327.7表达载体结构示意图
图2:BY01抗体非还原SDS-PAGE电泳
图3:BY01抗体还原SDS-PAGE电泳
具体实施方式
实施例1、p327.7表达载体全基因合成及功能元件
委托上海捷瑞生物工程有限公司全合成p327.7表达载体全基因,8066bp,其载体结构示意图如图1所示,序列如SEQ ID NO:1所示。
一、第一表达盒元件
1、CMV立早增强子(1-659bp),如SEQ ID NO:2所示。
2、CMV启动子(669-750bp),如SEQ ID NO:3所示。
3、T7RNA聚合酶启动子(1067-1085bp)
TAATACGACTCACTATAGG
4、多克隆位点A(1091-1125):XhoI-EcoRI-MluI,
CTCGAGTCTTGATAGCACCTATTGAATTCACGCGT
5、SV40多聚A信号1(1150-1353bp),如SEQ ID NO:4所示。
二、第二表达盒元件
1、CMV立早增强子2(1664-2322bp),如SEQ ID NO:5所示。
2、CMV立早启动子2(2325-2405bp),如SEQ ID NO:6所示。
3、多克隆位点B(3374-3402bp):XbaI-BglII-SalI,
TCTAGACTTAGGCAGATCTCTGCGTCGAC
4、T3RNA聚合酶启动子3(3430-3451bp),
GTTAATGCTTCGAGCAGACATG
5、SV40多聚A信号2(3462-3682),如SEQ ID NO:7所示。
三、fi复制子(3777-4232),如SEQ ID NO:8所示。
四、谷氨酰胺合成酶表达盒
1、SV40增强启动子(4296-4701bp),如SEQ ID NO:9所示。
2、谷氨酰胺合成酶结构基因(4730-5851bp),如SEQ ID NO:10所示。
a.起始密码子(4730-4732bp)
b.终止密码子TAA(5849-5851bp)
c.谷氨酰胺合成酶表达基因
五、氨苄青霉素β内酰胺酶水解基因(6374-7234bp)如SEQ ID NO:11所示。
a.起始密码子ATG(6374-6376)
b.终止密码子TAA(7232-7234)
c.氨苄青霉素β内酰胺酶水解基因
六、ColE1复制子(7389-8009bp),如SEQ ID NO:12所示。
实施例2、抗Her2/neu人源化抗体BY01表达载体构建
委托上海捷瑞生物工程有限公司合成抗Her2/neu人源化抗体L链编码基因,如SEQID NO:13所示。经XhoI和EcoRI双酶切克隆至p327.7表达载体,命名为p327.7/L:
其中下划线部分分别为XhoI和EcoRI的酶切位点,分别为起始和终止密码子。
同样委托上海捷瑞生物工程有限公司合成抗Her2/neu人源化抗体H链编码基因,如SEQ ID NO:14所示。在经XbaI-和SalI双酶切克隆至p327.7/L表达载体,命名为p327.7/HER2表达载体。
其中下划线部分分别为XbaI和SalI的酶切位点,分别为起始和终止密码子
实施例2、抗Her2/neu人源化BY01抗体高表达细胞株的筛选
1、CHO-K1(中科院上海细胞库)细胞在10%D-FBS,4mM谷氨酰胺的DMEM/F12(Invitrogen产品)中适应并贴壁生长;胰酶消化后调节细胞浓度,加入96孔细胞培养板中,细胞数大约为1.5×104/孔;24小时后,按Lipofectin 2000操作说明转染96孔板。用无血清无抗生素的IMDM培养基洗2次,每次加入IMDM 100μl/孔。取质粒与IMDM培养基混均,取Lipofectin 2000CD与IMDM培养基混均。静置5分钟后,将Lipofectin 2000CD和质粒混匀。室温静置15分钟后,按每孔50μl加入已含50μl/孔IMDM的96孔板中。5小时后,换成完全培养基(10%透析血清,1×HT,4mM谷氨酰胺的CD OptiCHO)。转染48小时后刮取96孔板生长细胞,收集培养物;1000转/分,5分钟离心;按2×104/孔铺板,并置含25μML-蛋氨酸砜亚胺(L-Methionine sulfoximine,MSX)但不含谷氨酰胺的10%D-FBS CD OptiCHO培养基中培养;每5天更换一次新鲜培养基;形成克隆后,取50μl样品双抗体夹心法ELISA方法半定量检测培养液中蛋白含量,初步筛选出蛋白表达量相对较高克隆;蛋白表达量相对较高克隆转入24孔板中悬浮培养,培养基换为不含D-FBS的CD OptiCHO培养基(MSX50μM/ml)。数天后,同样采用ELISA方法检测24孔板中的相对蛋白表达量。进一步经6孔板、75cm2培养瓶和250ml摇瓶悬浮培养。结合ELISA半定量结果和细胞生长状态,筛选表达量较高、生长均匀者进一步扩大培养制成稳定细胞。
实施例3、人源化BY01抗体的表达和初步纯化
将高表达人源化抗体BY01细胞置无血清的CD OptiCHO中培养,一定时间后收集培养上清。用pH7.4的PBS溶液平衡HiTrapMabSelectSuRe 1ml柱(GEHealthcare LifeSciences产品,Cat.No:11-0034-93)10个床体积,流速为0.5ml/min;培养上清液用0.45μm滤膜过滤上样,流速为0.5ml/min。用pH 7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积,流速为0.5ml/min;用100mM柠檬酸缓冲液(pH 3.6)洗脱,流速为0.5ml/min,收集洗脱峰。
经ELISA和蛋白A-HPLC检测抗体在上清中的表达量为600mg/L。
纯化人源化抗体BY01非还原SDS-PAGE电泳和还原SDS-PAGE电泳见图2和图3,非还原电泳免疫融合蛋白表观分子量大约220kDa;还原SDS-PAGE电泳重链约50kDa,轻链约25kDa,因此全抗体分子量约为150kDa。在非还原电泳条件下,蛋白受到无规卷曲的影响通常不能真实反映蛋白分子量大小,还原电泳彻底打开二硫键,更能真实地反映蛋白分子量。表达人源化抗体BY01理论分子量约150kDa,实测值均与理论预期一致。

Claims (6)

1.一种具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶表达载体,该载体包括两个表达盒,分别为第一表达盒元件和第二表达盒元件,还包含如下4种元件:f1复制子、谷氨酰胺合成酶表达盒元件、氨苄青霉素β内酰胺酶水解表达盒元件和ColE1复制子,该载体被命名为p327.7,该载体序列如SEQ ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶表达载体,所述的第一表达盒元件、第二表达盒元件中采用的是强的增强子和启动子;表达蛋白编码基因分别通过多克隆位点A和多克隆位点B克隆至表达载体,所述的多克隆位点A具有XhoI、EcoRI和MluI 3个限制性内切酶位点;所述的多克隆位点B具有XbaI、BglII和SalI 3个限制性内切酶位点;谷氨酰胺合成酶表达盒元件中采用弱的启动子和增强子;在多克隆位点A的5’端设计了T7 RNA聚合酶启动子,在多克隆位点B的3’端设计了T3 RNA聚合酶启动子序列。
3.根据权利要求2所述的一种具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶表达载体,所述第一表达盒的强的增强子和启动子是CMV立早增强子和CMV启动子,其序列分别如SEQ ID NO:2和3所示,所述第二表达盒的强的增强子和启动子是CMV立早增强子和CMV启动子,其序列分别如SEQ ID NO:5和6所示;所述的弱的启动子和增强子是SV40,其序列如SEQ ID NO:9所示;所述的T7 RNA聚合酶启动子的序列为TAATACGACTCACTATAGG;所述的T3 RNA聚合酶启动子的序列为GTTAATGCTTCGAGCAGACATG。
4.根据权利要求1所述的具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶表达载体的构建方法,其特征在于,所述的表达载体是通过全基因合成方法构建的。
5.根据权利要求1-3任一所述的表达载体用于瞬时和稳定高效表达1-2种蛋白的用途。
6.根据权利要求1-3任一所述的表达载体用于抗体的表达中的用途。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957578A (zh) * 2017-12-22 2019-07-02 拜西欧斯(北京)生物技术有限公司 双基因表达载体及其制备方法和应用
CN111423512B (zh) 2019-01-10 2024-01-05 北京比洋生物技术有限公司 阻断血管内皮细胞生长且活化t细胞的多靶向融合蛋白和包含其的药物组合物
CN113005140B (zh) * 2019-12-19 2024-03-15 鲁南制药集团股份有限公司 一种具有双表达盒的gs表达载体及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0216648D0 (en) * 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
GB0508154D0 (en) * 2005-04-22 2005-06-01 Lonza Biologics Plc Mammalian expression vector comprising the mCMV promoter and first intron of hCMV major immediate early gene
AU2006237193B2 (en) * 2005-04-22 2012-02-02 Lonza Biologics Plc. Mammalian expression vector comprising the mCMV promoter and first intron of hCMV major immediate early gene
GB0510277D0 (en) * 2005-05-20 2005-06-29 Lonza Biologics Plc High-level expression of recombinant antibody in a mammalian host cell
CN102409060B (zh) * 2010-09-26 2013-05-08 北京华安科创生物技术有限公司 Gs-dhfr双基因筛选表达载体及其构建方法与应用
HRP20240230T1 (hr) * 2011-10-11 2024-04-26 F. Hoffmann - La Roche Ag Poboljšani sklop bispecifičnih protutijela

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