CN101205530B - 采用动物细胞流加培养方式高效表达重组蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用动物细胞流加培养方式高效表达重组蛋白的方法。该方法选择动物细胞流加培养方式进行重组蛋白的表达，并在流加培养的不同阶段控制不同范围的细胞培养温度和pH值，以期达到重组蛋白高效表达的目的。本发明操作简便，容易实施，在提高蛋白产量的同时不提高成本，适合于大规模的动物细胞培养，尤其是应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、融合蛋白以及各种基因重组蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及动物细胞培养领域。更具体地，本发明涉及一种采用动物细胞流加培养方式表达重组蛋白的方法。
背景技术
动物细胞大规模培养已经被广泛应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、病毒疫苗、免疫调节因子、生长因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组蛋白质药物。动物细胞同微生物相比具有转录后修饰的能力，能够高效地表达和生产各类高质量的蛋白质。
动物细胞培养无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，就操作方式而言，主要分为分批式(Batch)，流加式(Fed-batch)和灌流式(Perfusion)三种操作方式。简单的分批培养(Batch)中，随着营养物的消耗和副产物积累，细胞停止生长并开始死亡，产物也停止表达，生产效率很低。流加培养(Fed-batch)，即在培养过程中，根据细胞代谢需求，连续或间歇地向反应器内加入特定的流加培养基，补充新的营养物质，减少副产物，克服了批培养的弊端。流加培养同批培养相比，培养周期延长，能够最终获得更高的活细胞密度和产物浓度(J.B.Griffith，Animal Cell Culture and Production of Biologicals，pp.401-410，Klumer Academic Publishers，R.Sasaki and K.Ikura(eds.)，(1991)，RobbinsonDK，Seamans TC，et al.optimization of a fed-batch process for production of arecombinant antibody.Annals NY Academy Sciences，(1994)，745：185-296.)。连续灌流培养(Perfusion)是指把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将消耗过的培养基排出，同时又连续不断地灌注新的培养基的方法。目前，流加式(Fed-batch)培养是动物细胞大规模培养生产分泌型重组蛋白药物较为推崇的一种操作方式。
此外，动物细胞大规模培养的有关研究内容还包括高密度和高表达细胞的培养环境及条件，促进单个细胞的基因合成和产物表达，改进培养系统的氧传递方式，以及减少剪切力和降低生产成本的培养条件等。其中，培养温度是影响重组蛋白生产的重要因素之一，优化培养温度，可提高重组蛋白的产量，与其他方法相比，此方法操作简便，有较好的实用价值。CN 200510011774.5(发明名称为：一种高效表达目的蛋白的方法)公开了一种高效表达目的蛋白的方法，该方法通过优化稳定表达目的蛋白的工程化CHO细胞株的培养温度，并利用两阶段培养策略，使融合蛋白表达量得到显著提高。但一些研究表明，仅通过优化培养温度，并不能使重组蛋白的产量提高到理想水平(Yoon SK，Song JY，Lee GM.Effect of low culture temperature on specific productivity，transcriptionlevel，and heterogeneity of erythropoietin in Chinese hamster ovary cells.BiotechnolBioeng.2003，82(3)：289-98)，这是因为降低培养温度可提高目的蛋白的比生成率，但同时导致细胞增殖抑制，降低了细胞的相对数量，从而影响了目的蛋白产量的提高。而且温度不仅仅是影响重组蛋白表达的唯一因素。因此，结合优化培养温度综合考虑其它因素使重组蛋白高效表达一直是本领域技术人员一直期待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的申请人公开了一种采用动物细胞流加培养方式高效表达重组蛋白的方法。包括如下步骤：
(1)细胞培养温度36℃-38℃，PH值6.5-6.9，培养24-48小时，当动物细胞生长至适当密度时补加流加培养基，进行流加培养；
(2)细胞培养温度降至32.5℃-35℃，PH值7.0-7.3，进行流加培养；
(3)停止流加，细胞培养温度升至36℃-38℃，PH值7.0-7.3，进行培养。
本发明选择动物细胞流加培养方式进行重组蛋白的表达，并在流加培养的不同阶段控制不同范围的细胞培养温度和PH值，通过增加单位体积的细胞数量和单个细胞的蛋白表达量以期达到重组蛋白高效表达的目的。
培养温度是影响重组蛋白生产的重要因素之一。大多数动物细胞适宜的生长温度在37℃左右。在36℃-38℃的培养温度下，动物细胞增殖速度很快。当温度逐渐下降，细胞的增殖速度也逐渐减慢，但细胞表达重组蛋白的比生成率则显著提高。因此，细胞在36℃-38℃下处于生长期，以细胞增殖为主；而在32.5℃-35℃下，细胞增殖受到抑制，细胞处于维持期，此时以重组蛋白表达为主。
PH值的变化是培养环境及条件的另一个重要因素。一定范围的PH环境将有利于细胞的生长。大多数动物细胞的适宜pH为6.8-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。对于同一种细胞.生长期和维持期最适pH也不尽相同。对大多数细胞来说，偏酸环境更利于生长.而偏碱环境更利于维持。
本发明方法采用三段法。
第一阶段，即流加培养过程步骤(1)中，细胞培养环境温度36℃-38℃，PH值6.5-6.9。此时的细胞处于旺盛的生长期，选择偏酸的培养环境还有利于减少副产物的产生，如乳酸累积。培养24-48小时，当细胞生长至适当密度时通过补加流加培养基，让细胞继续充分生长。
第二阶段，即流加培养过程步骤(2)中，细胞培养环境温度32.5℃-35℃，PH值7.0-7.3。此时的细胞进入维持期，细胞以表达重组蛋白为主。此时选择一定的流加稀释率和流加时间，尽量使单个细胞的重组蛋白得到充分表达。
第三阶段，即流加培养过程步骤(3)中，细胞培养环境温度36℃-38℃，PH值7.0-7.3。此时的细胞接近生长末期，停止添加流加培养基，再培养一段时间使细胞在适宜的温度下继续生长，并完成蛋白表达的最后过程。
经过以上步骤，于合适的时间收集上清，经检测重组蛋白的产量得到显著提高。
本发明选择流加培养方式培养动物细胞，通过生物反应器电加热系统控制培养温度，并通过向生物反应器中通入CO2气体使PH值下降或者加入NaHCO3溶液使PH值上升。除了温度和PH值以外的其他培养条件采用本领域的常规做法。
本发明与CN 200510011774.5(发明名称为：一种高效表达目的蛋白的方法)公开的细胞两阶段培养方法相比较，在细胞大规模培养(50升及以上规模)生产重组蛋白方面，本发明三段法的蛋白表达量高于对比文献两段法的蛋白表达量30％以上，对于重组蛋白药物产业化更具有实际意义。
本发明利用动物细胞的生长特点，通过改变温度和PH值达到提高重组蛋白产量的目的。该方法的优点在于：操作简便，容易实施，在提高蛋白产量的同时不提高成本，适合于大规模的动物细胞培养，尤其是应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、融合蛋白以及各种基因重组蛋白质。
附图说明
图1为本发明“三段法”表达重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白与对比文献“两段法”培养过程中的细胞生长比较图。
图2为本发明“三段法”表达重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白与对比文献“两段法”培养过程中的蛋白产量比较图。
图3为本发明“三段法”表达人源化抗HER-2单克隆抗体与对比文献“两段法”培养过程中的细胞生长比较图。
图4为本发明“三段法”表达人源化抗HER-2单克隆抗体与对比文献“两段法”培养过程中的蛋白产量比较图。
具体实施方式
以下实施例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例1 CHO细胞“三段法”表达融合蛋白
1.材料：
稳定表达重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞株(按照专利号：01132074.5，发明名称：肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及其融合基因与产物制备)；Excell325-PF培养基(美国JRH公司生产)作为基础培养基；Excell325-PF培养基中加入葡萄糖(浓度为60-90mmol/L)和谷氨酰胺(浓度为5.0-7.8mmol/L)作为流加培养基。
2.生物反应器：
Biostat D-50生物反应器(德国贝朗公司)。
3.CHO细胞流加培养三段法：
(1)将稳定表达重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞株在第1天接种后以5.0×105cells/ml于生物反应器中。控制温度在37℃左右，上下浮动不超过1℃，PH值控制在6.5-6.9之间。培养48小时，当CHO细胞密度达到2.0-3.5×106cells/ml时添加流加培养基，控制流加稀释率为0.1-0.3/天，流加时间72小时。
(2)降低培养温度，将温度控制在32.5℃-35℃，同时控制PH值7.0-7.3。控制流加稀释率为0.1-0.2/天，流加时间120小时。
(3)升高细胞培养温度至36℃-38℃，PH值7.0-7.3。停止添加流加培养基，再培养24小时。
整个培养过程中反应器的搅拌转速为50-60rpm，溶氧为40-50％空气饱和度。
4.本发明“三段法”与对比文献“两段法”进行比较
(1)“两段法”的CHO细胞培养方法
第一阶段：将稳定表达重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的CHO细胞株在第1天接种后以5.0×105cells/ml于生物反应器中，控制温度在36.5℃-37.8℃，PH值控制在6.8-7.4，反应器的搅拌转速为50-60rpm，溶氧为40-50％空气饱和度。培养48小时后开始添加流加培养基，根据培养环境控制流加稀释率，流加时间72小时。
第二阶段：将培养温度降至25℃-32℃，继续流加培养120小时，其他培养条件不变。停止添加流加培养基，再培养24小时。
(2)本发明“三段法”与“两段法”细胞密度的测定
在用“三段法”与“两段法”分别进行细胞培养的过程中，在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12天，常规采用血球计数法检测细胞密度，结果见附图1。
(3)本发明“三段法”与“两段法”蛋白表达量的测定
在用“三段法”与“两段法”分别进行细胞培养的过程中，在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12天，常规采用ELISA法，按照人可溶性肿瘤坏死因子-a受体2(sTNF-aR2)酶免试剂盒(购自上海轩昊科技发展有限公司)说明书操作检测融合蛋白的表达量，结果见附图2。
(4)本发明“三段法”与“两段法”的比较结果
细胞密度的比较：两种细胞培养方法中，从第1天到第5天，细胞均处于旺盛的生长期；在第5天，细胞生长达到最高峰；此后，细胞生长处于维持期，细胞生长速度减慢，细胞密度曲线呈现一个平台期，但“三段法”的细胞密度明显高于“两段法”的细胞密度；在第12天，细胞密度达到最低点，见附图1。
蛋白表达量的比较：两种细胞培养方法中，从第1天到第5天，蛋白表达量处于缓慢增长期；从第5天到第9天，蛋白表达量增长迅速；从第10天开始，“两段法”的蛋白表达量增长趋于平缓，而“三段法”的蛋白表达量增长依然显著；在第12天，“三段法”的蛋白表达量达到1.02g/L，而“两段法”的蛋白表达量为0.71g/L，“三段法”的蛋白表达量提高43.66％，见附图2。
实施例2 CHO细胞“三段法”表达单克隆抗体
1.材料：
稳定表达人源化抗HER-2单克隆抗体的CHO细胞株(按照专利号：01132225.X，发明名称：人源化抗HER-2单克隆抗体及其制法和药物组合物制备)；Excell325-PF培养基(由美国JRH公司生产)作为基础培养基；Excell325-PF培养基中加入葡萄糖(浓度为60-90mmol/L)和谷氨酰胺(浓度为5.0-7.8mmol/L)作为流加培养基。。
2.生物反应器：
Biostat D-50生物反应器(德国贝朗公司)。
3.CHO细胞流加培养三段法：
(1)将稳定表达人源化抗HER-2单克隆抗体的CHO细胞株在第1天接种后以5.0×105cells/ml于生物反应器中。控制温度在37℃左右，上下浮动不超过1℃，PH值控制在6.5-6.9之间。培养48小时，当CHO细胞密度达到2.0-3.5×106cells/ml时添加流加培养基，控制流加稀释率为0.1-0.3/天，流加时间96小时。
(2)降低培养温度，将温度控制在32.5℃-35℃，同时控制PH值7.0-7.3。控制流加稀释率为0.1-0.2/天，流加时间144小时。
(3)升高细胞培养温度至36℃-38℃，PH值7.0-7.3。停止添加流加培养基，再培养24小时。
整个培养过程中反应器的搅拌转速为50-60rpm，溶氧为40-50％空气饱和度。
4.本发明“三段法”与对比文献“两段法”进行比较
(1)“两段法”的CHO细胞培养方法
第一阶段：将稳定表达人源化抗HER-2单克隆抗体的CHO细胞株在第1天接种后以5.0×105cells/ml于生物反应器中，控制温度在36.5℃-37.8℃，PH值控制在6.8-7.4，反应器的搅拌转速为50-60rpm，溶氧为40-50％空气饱和度。培养48小时后开始添加流加培养基，根据培养环境控制流加稀释率，流加时间96小时。
第二阶段：将培养温度降至25℃-32℃，继续流加培养144小时，其他培养条件不变。停止添加流加培养基，再培养24小时。
(2)本发明“三段法”与改进前“两段法”细胞密度的测定
在用“三段法”与“两段法”分别进行细胞培养的过程中，在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14天，常规采用血球计数法检测细胞密度，结果见附图3。
(3)本发明“三段法”与“两段法”蛋白表达量的测定
在用“三段法”与“两段法”分别进行细胞培养的过程中，在第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14天，常规采用双抗体夹心法(具体方法：将羊抗人IgG轻链包被于酶标板，BSA等无关蛋白封闭后，加入精确定量梯度稀释的人源化抗HER-2单克隆抗体，制备标准曲线；同时加入待检测的上清；反应后经过洗涤，再加入HRP标记的羊抗人重链的二抗；反应后经洗涤，加入HRP的显色底物TMB，室温避光显色，1M硫酸终止，酶标仪读取OD450nm，根据标准曲线计算待检测上清中人源化抗HER-2单克隆抗体的表达量。其中，羊抗人IgG轻链和HRP标记的羊抗人重链的二抗均由美国KPL公司生产。)检测单克隆抗体的表达量，结果见附图4。
(4)本发明“三段法”与“两段法”的结果比较
两种细胞培养方法中，培养结果无论是细胞密度还是蛋白表达量，“三段法”均优于“两段法”。尤其在培养第10天以后，“三段法”的蛋白表达量增长依然显著，最高可达到1.04g/L，相对于“两段法”最高蛋白表达量0.77g/L，“三段法”的蛋白表达量提高35.06％。
从两种培养方法的细胞密度和蛋白表达量的不同可以得出结论，本发明“三段法”由于在提高蛋白产量的同时不提高成本，并且操作简便、容易实施，更适合于大规模的动物细胞培养，，尤其是可以应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、融合蛋白以及各种基因重组蛋白质。
Claims (6)
1.一种采用CHO细胞流加培养方式高效表达重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)细胞培养温度36℃-38℃，PH值6.5-6.9，培养24-48小时，当动物细胞生长至适当密度时补加流加培养基，进行流加培养；
(2)细胞培养温度降至32.5℃-35℃，PH值7.0-7.3，进行流加培养；
(3)停止流加，细胞培养温度升至36℃-38℃，PH值7.0-7.3，进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的细胞适当密度为2.0-3.5×106cells/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，流加稀释率为0.1-0.3/天，流加培养时间72-96小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，流加稀释率为0.1-0.2/天，流加培养时间120-144小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的培养时间为24-48小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的流加培养基为无血清培养基。
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