CN103320390B

CN103320390B - 一种大规模哺乳动物工程细胞培养方法

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Publication number: CN103320390B
Application number: CN201310239477.0A
Authority: CN
Inventors: 周凯松; 王庆民; 孙丽霞; 曹平; 夏庭坤; 崔午阳
Original assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2033-06-17
Also published as: CN103320390A

Abstract

本发明涉及一种大规模哺乳动物工程细胞培养方法。该方法包括（1）细胞复苏及摇床培养，（2）扩培罐培养，包括在培养基中于悬浮液中培养细胞，分三级进行；（3）生产罐培养。本发明将在生产罐中典型的15天的细胞培养缩短为8天，在扩培罐中培养生长7天，待细胞密度达到对数生长期后，再将细胞以高密度稀释到生产细胞罐中，继续生长培养8天至结束。本发明的细胞培养方法使得每一批次生产的周期缩短为典型培养的一半；该工艺使扩培罐和生产罐得到最大效率的利用，提高了设备的利用率。

Description

一种大规模哺乳动物工程细胞培养方法

技术领域

本发明涉及一种能够应用于工业化的大规模工程细胞培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

目前用于制备基因工程药物的表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统主要指大肠杆菌表达系统，它具有表达水平高、操作简单、周期短、易于大规模高密度培养、成本低等优点，往往成为表达抗体片段以及表达产物翻译后修饰的又不影响功能和活性的蛋白类药物的首选表达系统。但对于抗体和糖蛋白类生物药物来说，表达产物多肽链的折叠、二硫键的形成、糖基化的有无、以及糖基化的类型常常影响表达产物的合成、分泌、生物活性、体内稳定性以及免疫原性等特性；而原核细胞缺少内质网和高尔基体等可用于进行糖基化的结构和机制，所表达的产物是非糖基化的，且常常以包涵体的形式存在，因此大肠杆菌表达系统不适于表达全抗体和糖蛋白类药物。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫及植物、哺乳动物细胞【如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞】等真核细胞表达系统。其中酵母、昆虫及植物等真核细胞虽能进行糖基化，但其糖基化的方式与人类等哺乳动物细胞糖基化的方式是不一样的。与其它真核细胞表达系统相比，目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，并且哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到2000L以上，因此在表达这一类蛋白药物时人们往往首选哺乳动物细胞表达系统。与大肠杆菌表达系统相比，哺乳动物细胞的表达水平低、获得高表达细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高，因此建立哺乳动物细胞高效表达系统以及高表达工程细胞株的获得，是基因工程药物研究和生产的瓶颈，参见张国强等，生物技术通讯，Vol.16N0.1Jan.,2005。

近年来，为了提高蛋白质类药物的表达水平、降低生产成本，主要从表达载体的构建、宿主细胞的驯化、培养工艺的优化三方面对哺乳动物细胞表达进行优化。通过降低目的基因的位置效应、提高目的基因的转录和翻译水平以及目的基因的拷贝数等方面构建哺乳动物细胞高效表达载体，与此同时，研究者也对宿主细胞进行了多方面的改造，使之能更好地适应工业化大规模培养的要求，从而降低细胞培养和产品纯化的成本。

在细胞工艺优化方面，当前哺乳动物细胞培养工艺中占有主流优势的是悬浮细胞培养工艺。典型的悬浮细胞培养工艺包括细胞复苏、扩培和生产。一般从复苏工作细胞库细胞开始，经过不同规模的细胞培养罐逐级扩培，转入生产细胞罐，在生产罐中继续生长和表达产品。为了提高产量，通常需要在细胞罐中维持高密度和高活力的细胞。补料分批培养和灌注连续培养是经常用到的两种细胞培养工艺，补料分批培养工艺是间歇或连续向细胞罐内添加浓缩的培养基或营养成分，直至批次培养结束对产物进行收集纯化，工艺规模容易放大，操作简便，具有较高的体积产率。典型的补料分批培养工艺中，扩培罐中的培养时间一般为2-3天，生产细胞罐的培养时间一般在15天左右。生产罐中培养的15天中，扩培罐处于闲置状态，漫长的生产罐培养时间是影响设备使用率、影响生产周期的限制性步骤，同时较长的生产周期也大大增大了污染的风险，增大了生产操作的压力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种能够应用于工业化的大规模动物工程细胞培养方法，解决了细胞培养工艺过程中培养时间长、设备利用率低、易污染等技术难题。

术语说明：

本发明将进入生产罐之前的培养罐定义为扩培罐；扩培是细胞扩大培养的通用简称；

5%CO₂：是指CO₂体积浓度为5%；

溶氧（DO）%：是指体系中氧的溶量体积比；

CD Forti CHO培养基：是一种商品化的基础培养基的名称；

CD CHO培养基：是一种化学成分确定的无蛋白培养基，适合悬浮培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的生长和重组蛋白的表达；

补料培养基Feed C：是一种商品化的补料培养基的名称；

L-Gln：L-谷氨酸酰胺；MTX：氨甲喋呤；

G418：一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。

细胞对数生长期：指细胞在一定的环境下经过了短暂的适应期，进而快速生长的时期，此时期营养充足，细胞会以对数生长，N为细胞的分裂次数，细胞以2的N次方的速度生长(假如原来只有一个细胞，进入对数期以后就会变为两个，两个再变为四个)。

细胞活力%：在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。

本发明的技术方案如下：

一种大规模动物工程细胞培养方法，包括以下步骤：

（1）细胞复苏及摇床培养：

将从液氮罐中取出的细胞株，在37℃水浴中复融，待细胞化开后置于含有50ml扩培培养基的250ml摇瓶中，放置于37℃、5%CO₂培养箱中，150rpm摇床培养2-3天，使摇瓶中细胞密度生长到1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml；

所述扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/ml G418和100nM MTX的CD Forti CHO培养基。

（2）扩培罐培养，包括在培养基中于悬浮液中培养细胞，分三级进行：

2L罐扩培：将摇瓶中密度1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml的细胞，以1:4～5的体积比例稀释到含有1.6L扩培培养基的2L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速200rpm；培养2-3天，使2L罐中细胞密度生长到1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml；

10L罐扩培：将2L罐中密度1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml的细胞以1:4～5的体积比稀释到含有8L扩培培养基的10L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，同时与NaHCO₃偶联，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速120rpm；使2L罐中细胞密度生长到1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml；

其中，上述的扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/ml G418和100nM MTX的CD Forticho培养基；

100L罐扩培：将10L罐中扩培的密度为1.0×10⁶～3.0×10⁶cell/ml的细胞，以1:4～5的体积比稀释到含有35-40L完全培养基的100L扩培罐中，所述的完全培养基为含有2mML-Gln的CD Forti cho培养基；培养工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速75rpm；在细胞培养的第4、6天各补料培养基Feed C一次，补料培养基的体积为完全培养基体积的11-13%；细胞培养的第7-8天，细胞密度为17×10⁶～19×10⁶cell/ml，此阶段细胞进入对数生长期，收集处在此对数生长期的细胞作为种子细胞准备转移到生产罐中进行生产罐培养；

（3）生产罐培养：

将步骤（2）中55-60L种子细胞无菌转移到含有55-60L完全培养基的150L细胞生产培养罐中，所述的完全培养基为含有2mM L-Gln的CD Forti cho培养基；培养工艺条件为：温度33℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速50rpm；在生产细胞罐中的第1天，补料培养基Feed C10-20L，使总体积达130L，每天取样计数，生产罐培养的第7-8天时，细胞活力下降到78-82%，收集细胞上清液进行纯化，得到纯化后的原液。

根据本发明，优选的，步骤（2）的2L罐、10L罐的扩培，每一级扩培均使细胞密度生长到2.0×10⁶cell/ml。

根据本发明，优选的，步骤（2）100L罐扩培中，控制完全培养基接种后体积为50L，补料培养基Feed C一次，各5L，补料后总体积为60L；细胞培养的第7天，细胞密度为18×10⁶cell/ml，收集此时的细胞作为种子细胞准备转移到生产罐中进行生产罐培养。

根据本发明，所述工程细胞为表达重组抗HER2人源化单克隆抗体的工程细胞株，表达重组抗VEGF（血管内皮生长因子）人源化单克隆抗体的工程细胞株，或表达重组抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的工程细胞株等。这些工程细胞株均可以通过商业途径获得。也可按现有技术制备或委托生物公司加工。根据本发明，优选的，所述工程细胞为表达重组抗HER2人源化单克隆抗体的工程细胞株、表达重组抗VEGF人源化单克隆抗体的工程细胞株。可按CN102277380A的实施例1-3提供的方法构建。

本发明中细胞上清液的纯化按现有技术即可，例如将细胞培养液经过澄清过滤、Protein A亲和吸附层析、阳离子交换树脂层析和阴离子交换树脂层析、除病毒过滤和浓缩后得到产品原液。

将纯化后的原液进行质量分析，检测产品的质量及表达量，产品质量主要看影响单克隆抗体质量的电荷分布和糖型分布；从本发明附图的图3-7可以看出本发明工艺在单克隆抗体的表达和表达产品的质量上都与典型的悬浮细胞培养工艺相同。

本发明的技术特点在于：将在生产罐中典型的15天的细胞培养生产过程缩短为8天，即将典型的15天生产过程而在细胞培养生产过程的前半个阶段采用扩培在细胞扩培罐中进行，在扩培罐中培养生长7天，待细胞密度达到对数生长期后，再将细胞以高密度稀释到生产细胞罐中，继续生长培养8天至工艺周期结束。此工艺过程缩短了细胞在生产罐中的培养生产周期，使得细胞在生产细胞罐中的培养时间由原来的15天缩短到8天，提高了连续生产（所谓连续生产，即下一批次的细胞扩培过程可以与本批次的细胞生产过程在生产罐和扩培罐中同时进行）时设备的利用率和生产批次（如，典型的15天培养工艺每个生产罐每年满负荷运转只能生产24批，改进后的工艺可以生产48批）；同时由于生产细胞罐中培养时间的缩短，也降低了细胞培养过程中污染的风险。

本发明的有益效果：

本发明将细胞扩培与细胞生产的过程连贯在一起，缩短了在生产细胞罐培养的生产周期，使得每一批次生产的周期缩短为典型培养的一半；该工艺使扩培罐和生产罐得到最大效率的利用，提高了设备的利用率，使反应器在短时间内产生最大的经济效益，降低了产品的成本；同时，由于细胞在生产罐上的培养周期缩短，降低了细胞培养过程中污染的风险性，提高了每一批次生产的成功率。本发明应用于哺乳动物抗体及重组蛋白质工程细胞的大规模培养中。

附图说明

图1是现有技术实施例4典型的细胞培养工艺示意图，横坐标为培养时间，纵坐标为活细胞密度。

图2是本发明的细胞培养工艺示意图，横坐标为培养时间，纵坐标为活细胞密度。

图3是实施例4和实施例3工艺条件下单抗表达量比较图。

图4是实施例4工艺条件下所得单抗产品的糖型图谱。

图5是实施例3工艺条件下所得单抗产品的糖型图谱。

图6是实施例4条件下所得单抗产品的电荷异质性图谱。

图7是实施例3工艺条件下所得单抗产品的电荷异质性图谱。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但是，应当理解，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。在本文中，除非另外说明，所用试剂均为市售产品。

实施例中所用的基础培养基CD Forti CHO、CD CHO，补料培养基Feed C均购自Invirogen公司；所用试剂MTX、G418、L-Gln、胰酶购自上海生物工程有限公司；所用的发酵罐均购自B.Braun公司；限制性内切酶NheI、MluI购自Promaga公司；EXCELL-302培养基购自Sigma公司；DMEM培养基购自Gibco公司；dFBS透析胎牛血清购自Gibco公司；pCIneo-MWLD1和pCIneo-MWLD2载体参照CN102277380A的实施例1的方法构建。实施例中各种酶的使用方法可参见该产品的产品说明书，采用的实验方法如无特别说明，均采用本领域常规方法。所述工程细胞为表达重组抗HER2人源化单克隆抗体的工程细胞株、表达重组抗VEGF人源化单克隆抗体的工程细胞株，是按CN102277380A的实施例1-3提供的方法构建的，详细参见本申请的实施例4-5。

实施例1：

（1）细胞复苏：

从液氮罐中取出一支表达重组抗HER2人源化单克隆抗体的工程细胞株，迅速投入到37℃温水中复融；将细胞悬液移至离心管，加入37℃预热的扩培培养基9ml，800rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀中加入新鲜的预热37℃扩培培养基10ml，轻轻吹打后，移入已装有50ml培养基的250ml摇瓶中，将摇瓶转入摇床，调节转速为150rpm，于5%CO₂、37℃恒温摇床中培养3天；

（2）扩培细胞罐培养：

2L罐扩培：待摇瓶中细胞密度生长到2.0×10⁶cell/ml时，以1:5的比例将细胞稀释到2L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，，溶氧（dissolved oxygen DO）控制在40%，搅拌转速200rpm；

10L罐扩培：2L罐中培养3天后，待细胞密度长到2.0×10⁶cell/ml后，以体积比1:5的比例将细胞稀释到10L细胞罐中进行扩培，扩培工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（dissolved oxygen DO）控制在40%，搅拌转速120rpm；

其中所述的扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/ml G418和100nM MTX的CD FortiCHO培养基；

100L罐扩培：10L罐中培养2天后，待细胞密度长到2.0×10⁶cell/ml后，以体积比1:5的比例将细胞稀释到含有40L完全培养基（接种后体积为50L）的100L扩培罐中，培养工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速75rpm；在细胞培养的第4、6天各补料Feed C10L%体积（各5L，补料后总体积为60L），细胞在第7天后生长至18×10⁶cell/ml，收集处在此对数生长期的种子细胞准备转移到生产罐，其中的完全培养基为含有2mM L-Gln的CD Forti cho培养基；

（3）150L生产细胞罐培养：

将步骤（2）中60L种子细胞无菌转移到含有60L完全培养基的150L细胞生产培养罐中，所用培养工艺为：温度33℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速50rpm；在细胞培养的第8天（即生产细胞罐中的第1天）补料Feed C10L，总体积130L，每天取样计数，细胞在第15（即生产细胞罐中的第7天）天时活力下降到80%，收集所有细胞上清进行纯化，得到纯化后的原液。

实施例1的细胞培养的模式图如图2所示，发酵15天抗体的表达量结果如图3所示，所得抗体产品的糖型结果如图5所示，所得抗体产品电荷异质性结果如图7所示。

实施例2：典型的培养方式

典型单抗发酵的工艺流程包括：种子复苏、细胞扩培、细胞发酵、培养上清的离心收集和目标蛋白的纯化。具体步骤如下：

（1）细胞复苏：

从液氮罐中取一支表达重组抗HER2人源化单克隆抗体的工程细胞株，在37℃水浴中复苏，待细胞化开后置于含有50ml扩培培养基的250ml摇瓶中，放于37℃，5%CO₂培养箱中，150rpm摇床培养3天；

（2）扩培细胞罐培养：

1L扩培：待摇瓶中细胞密度生长到2.0×10⁶cell/ml后，以体积比1:5的比例将细胞稀释到2L细胞罐中进行扩培（接种后体积为1L）、扩培工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速200rpm；

5L扩培：培养3天后，待细胞密度长到2.0×10⁶cell/ml左右后，以1:5的比例将细胞稀释到5L细胞罐中进行扩培、扩培工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（dissolved oxygen DO）控制在40%，搅拌转速120rpm；

20L扩培：培养3天后，待细胞密度长到2.0×10⁶cell/ml后，以体积比1:5的比例将细胞稀释到含有15L完全培养基（接种后体积为20L）的20L扩培罐中，培养工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速150rpm。

其中所用扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/ml G418和100nM MTX的CD Forti cho培养基；

3、150L生产罐培养

将20L种子液在无菌超净台内从摇瓶移入无菌接种瓶；连接接种瓶与发酵罐接种口，通过空气正压将种子液压入发酵罐，同时将80L完全培养基通过空气正压压入发酵罐，此时细胞罐细胞接种密度为4×10⁵cell/ml，总体积为100L，发酵罐型号为B.Braun150L。同时将补料瓶、碱瓶、补糖瓶和消泡瓶无菌对接到发酵罐的；同时设定相关工艺参数。

设定反应器各项工艺参数如下：温度37℃，第4天降温到33℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速75rpm；补料策略：在细胞培养的第4、6、8天各补加10%的补料（补料后总体积为130L）；补糖策略：在第4天补糖4g/L，在第9天补糖6g/L；在细胞培养的每天无菌取样计数。

当细胞生长第7天进入平台期，细胞密度增加不再明显，并且目的蛋白保持比较高的表达水平，通过补加葡萄糖和补料策略以及pH值、温度、溶氧等培养参数的调节维持细胞培养约15天。随着细胞凋亡数量的增加，平台期平衡被打破，死亡的细胞逐渐增加，当发酵罐中的活细胞数低于80%时，蛋白表达量出现明显的下降，此时停止细胞培养进行收液。抗体表达量的检测使用Protein A柱经HPLC检测，15天蛋白表达量达到2g/L。

细胞培养的模式图如图1所示，发酵15天抗体的表达量结果如图3所示，所得产品产品的糖型结果如图4所示，所得抗体产品电荷异质性结果如图6所示。

实施例3：

（1）细胞复苏：

从液氮罐中取出一支表达重组抗VEGF人源化单克隆抗体的工程细胞株，迅速投入到37℃温水中复融；将细胞悬液移至离心管，加入37℃预热的扩培培养基9ml，800rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀中加入新鲜的预热37℃扩培培养基10ml，轻轻吹打后，移入已装有50ml培养基的250ml摇瓶中，将摇瓶转入摇床，调节转速为150rpm，于5%CO₂、37℃恒温摇床中培养2天；

（2）扩培细胞罐培养：

2L罐扩培：待摇瓶中细胞密度生长到2.0×10⁶cell/ml时，以体积比1:4的比例将细胞稀释到2L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，，溶氧（dissolved oxygen DO）控制在40%，搅拌转速200rpm；

10L罐扩培：2L罐中培养3天后，待细胞密度长到2.0×10⁶cell/ml后，以体积比1:4的比例将细胞稀释到10L细胞罐中进行扩培，扩培工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速120rpm；

100L罐扩培：10L罐中培养2天后，待细胞密度长到2.0×10⁶cell/ml后，以体积比1:4的比例将细胞稀释到含有40L完全培养基（接种后体积为50L）的100L扩培罐中，培养工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速75rpm；在细胞培养的第4、6天各补料（补料为5倍浓缩完全培养基）10L%体积（各5L，补料后总体积为60L），细胞在第7天后生长至18×106cell/ml，收集处在此对数生长期的种子细胞准备转移到生产罐，

其中所述的扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/ml G418和100nM MTX的CD CHO培养基；其中的完全培养基为含有2mM L-Gln的CD CHO培养基；

（3）150L生产细胞罐培养：

将步骤（2）中60L种子细胞无菌转移到含有60L完全培养基的150L细胞生产培养罐中，所用培养工艺为：温度33℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速50rpm；在细胞培养的第8天（即生产细胞罐中的第1天）补料10L，总体积130L，每天取样计数，细胞在第15（即生产细胞罐中的第7天）天时活力下降到60%，收集所有细胞上清进行纯化，得到纯化后的原液。发酵15天抗体的表达量为2.6g/L。

实施例4：表达重组抗HER2人源化单克隆抗体的工程细胞株的构建：

表达抗HER2人源化单克隆抗体互补载体的构建：

用限制性内切酶NheI和MluI分别双酶切编码抗EGFR2的单抗重链的基因片段（SEQ IDNO.1）和EGFR2的单抗轻链的基因片段（SEQ ID NO.2），分别插入到经限制性内切酶NheI和MluI双酶切的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD1和pCIneo-MWLD2中，构建两个互补的重组质粒pCIneo-MHWLD1和pCIneo-MLWLD2；

细胞转染、培养：

转染前一天，用胰酶消化CHO细胞并计数，CHO细胞铺板6孔板，使其在转染日密度达到90%汇合度。CHO细胞铺板在含血清，不含抗生素的DMEM培养基中。对于每孔CHO细胞，使用250μl的OPTI-MEMⅠ培养基稀释5μg的pCIneo-MHWLD1和pCIneo-MLWLD2质粒；对于每孔CHO细胞，使用250μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释10μl LIPOFECTAMINE2000试剂。30分钟内稀释的LIPOFECTAMINE2000与稀释的pCIneo-MHWLD1和pCIneo-MLWLD2质粒混合，混合液室温保温20分钟。将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀；在37℃，5％的CO2培养箱中培养4-5小时后更换DMEM培养基，保温24小时；

单克隆及亚克隆筛选：

转染后24小时取样检测表达情况，挑选表达量高，细胞状态好的转染孔用胰酶消化后合并，接种于10块96孔板中，96孔板每孔加入200ul氨甲喋呤（MTX）进行一轮加压筛选，MTX的终浓度为50uM。静置培养两至三周待克隆细胞株长出。存活的克隆细胞株生长起来后换液吸打，ELISA检测各克隆细胞株24小时表达量进行96孔粗筛。挑选表达量高的克隆细胞株移入24孔扩增传代，ELISA检测各克隆细胞株24小时表达量进行24孔粗筛。挑选24孔定量高表达克隆细胞株扩增液氮冻存保种的同时，进行亚克隆（1cells/孔）；

高表达的克隆细胞株经胰酶消化后取样计数，采用DMEM培养基进行亚克隆，每种细胞株克隆4块96孔板，每块96孔板上接种60个孔，每孔1个细胞；计数后，第一步用DMEM培养基稀释100倍；第二步用DMEM培养基稀释到5cells/ml，混匀后每个孔接种200ul细胞液；四周的孔加入无菌水。测定表达量：当孔中的细胞平铺满孔时，换入200ulDMEM培养基，24h后取样测定表达量。若测定的表达量大于3ug/ml则保留转入24孔板进行后续定量评价。定量测定表达量：24孔板中的克隆铺满孔底后，以1×105cells/ml定量传代测定表达量，根据定量结果，从中挑选高表达克隆细胞株转入6孔板进行扩增。根据细胞株定量检测结果和生长情况，选择合适的克隆细胞株进行悬浮培养驯化；

无血清悬浮驯化：

扩增高表达克隆细胞株至T175方瓶，培养体系为25%[92%DMEM+8%dFBS]培养基+75%EXCELL-302培养基（体积百分比）混合而成，待T175方瓶长满后，轻微消化扩增至两个T175方瓶中，将培养体系中[92%DMEM+8%（w/v）dFBS]培养基的比例由25%降低至10%，EXCELL-302培养基的比例提高至90%，静置培养一代。待细胞在10%[DMEM+8%（w/v）dFBS]培养基+90%EXCELL-302培养基中生长起来后收集漂浮细胞，消化贴壁细胞，以不低于3×10₅cells/ml的接种密度转入100%EXCELL-302培养基静置培养。每三至四天离心传代一次，连续传代三代至五代时，细胞以3×10₅cells/ml密度接种，三天密度达到10₆cells/ml以上时，即进行悬浮培养驯化。；

摇瓶培养：

细胞在方瓶里面完全适应无血清培养状态后收集漂浮细胞，以不低于3×10₅cells/ml的接种密度转入摇瓶培养。每三至四天离心传代一次，若出现团块可通过自然沉降的方式去除。细胞以3×10₅cells/ml密度接种，培养三天的细胞密度可达10₆cells/ml以上，连续传3代细胞能稳定生长且细胞单个均匀，收集后液氮冻存，此时得到的细胞为表达重组抗HER2人源化单克隆抗体细胞株。

实施例5：表达重组抗VEGF人源化单克隆抗体的工程细胞株的构建：

表达抗VEGF人源化单克隆抗体互补载体的构建：

用限制性内切酶NheI和MluI分别双酶切编码抗VEGF的单抗重链的基因片段（SEQ IDNO.3）和抗VEGF的单抗轻链的基因片段（SEQ ID NO.4），分别插入到经限制性内切酶NheI和MluI双酶切的共转染真核表达载体pCIneo-MWLD3和pCIneo-MWLD4中，构建两个互补的重组质粒pCIneo-MHWLD3和pCIneo-MLWLD4；

细胞转染、培养步骤，单克隆及亚克隆筛选步骤，无血清悬浮驯化步骤，摇瓶培养步骤同实施例4。

Claims

1.一种大规模动物工程细胞培养方法，包括以下步骤：

（1）细胞复苏及摇床培养：

将从液氮罐中取出的细胞株，在37℃水浴中复融，待细胞化开后置于含有50ml扩培培养基的250ml摇瓶中，放置于37℃、5% CO₂培养箱中，150rpm摇床培养2-3天，使摇瓶中细胞密度生长到1.0×10⁶~3.0×10⁶cell/mL；

所述扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/ml G418和100nM MTX的CD Forti CHO培养基；

2L罐扩培：将摇瓶中密度1.0×10⁶~3.0×10⁶cell/ml的细胞，以1:4~5的体积比例稀释到含有1.6L扩培培养基的2L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速200rpm；培养2-3天，使2L罐中细胞密度生长到2.0×10⁶cell/mL；

10L罐扩培：将2L罐中密度2.0×10⁶cell/mL的细胞以1: 4~5的体积比稀释到含有8L扩培培养基的10L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，同时与NaHCO₃偶联，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速120rpm；使10L罐中细胞密度生长到2.0×10⁶cell/mL；

其中，上述的扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/ml G418和100nM MTX的CD Forti cho培养基；

100L罐扩培：将10L罐中扩培的密度为2.0×10⁶cell/mL的细胞，以1: 4~5的体积比稀释到含有35-40L完全培养基的100L扩培罐中，所述的完全培养基为含有2mM L-Gln的CD Forti cho培养基；培养工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速75rpm；在细胞培养的第4、6天各补料培养基Feed C一次，补料培养基的体积为完全培养基体积的11-13%；细胞培养的第7-8天，细胞密度为17×10⁶~19×10⁶cell/mL，此阶段细胞进入对数生长期，收集处在此对数生长期的细胞作为种子细胞准备转移到生产罐中进行生产罐培养；

（3）生产罐培养：

将步骤（2）中55-60L种子细胞无菌转移到含有55-60L完全培养基的150L细胞生产培养罐中，所述的完全培养基为含有2mM L-Gln的CD Forti cho培养基；培养工艺条件为：温度33℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速50rpm；在生产细胞罐中的第1天，补料培养基Feed C 10-20L，使总体积达130L，每天取样计数，生产罐培养的第7-8天时，细胞活力下降到78-82%，收集细胞上清液进行纯化，得到纯化后的原液。

2.如权利要求1所述的大规模动物工程细胞培养方法，其特征在于步骤（2）100 L罐扩培中，控制完全培养基接种后体积为50L，补料培养基Feed C一次，各5L，补料后总体积为60L；细胞培养的第7天，细胞密度为18×10⁶cell/ml，收集此时的细胞作为种子细胞准备转移到生产罐中进行生产罐培养。

3.如权利要求1所述的大规模动物工程细胞培养方法，其特征在于所述工程细胞为表达重组抗HER2人源化单克隆抗体的工程细胞株，表达重组抗VEGF人源化单克隆抗体的工程细胞株或表达重组抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的工程细胞株。

4.一种大规模动物工程细胞培养方法，包括如下步骤：

（1）从液氮罐中取出一支表达重组抗HER2人源化单克隆抗体的工程细胞株，迅速投入到37℃温水中复融；将细胞悬液移至离心管，加入37℃预热的扩培培养基9mL，800rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀中加入新鲜的预热37℃扩培培养基10mL，轻轻吹打后，移入已装有50ml培养基的250ml摇瓶中，将摇瓶转入摇床，调节转速为150rpm，于5%CO₂、37℃恒温摇床中培养3天；

（2）扩培细胞罐培养：

2L罐扩培：待摇瓶中细胞密度生长到2.0×10⁶cell/mL时，以1:5的比例将细胞稀释到2L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速200rpm；

10L罐扩培：2L罐中培养3天后，待细胞密度长到2.0×10⁶cell/mL后，以体积比1:5的比例将细胞稀释到10L细胞罐中进行扩培，扩培工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速120rpm；

其中所述的扩培培养基为含有2mM L-Gln、400ng/mL G418和100nM MTX的CD Forti CHO培养基；

100L罐扩培：10L罐中培养2天后，待细胞密度长到2.0×10⁶cell/mL后，以体积比1:5的比例将细胞稀释到含有40L完全培养基的100L扩培罐中，接种后体积为50L，培养工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速75rpm；在细胞培养的第4、6天各补料Feed C 10L%体积，各5L，补料后总体积为60L，细胞在第7天后生长至18×10⁶cell/mL，收集处在此对数生长期的种子细胞准备转移到生产罐，其中的完全培养基为含有2mM L-Gln的CD Forti cho培养基；

（3）150L生产细胞罐培养：

将步骤（2）中60L种子细胞无菌转移到含有60L完全培养基的150L细胞生产培养罐中，所用培养工艺为：温度33℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速50rpm；在细胞培养的第8天补料Feed C 10L，总体积130L，每天取样计数，细胞在第15天时活力下降到80%，收集所有细胞上清进行纯化，得到纯化后的原液。

5.一种大规模动物工程细胞培养方法，包括如下步骤：

（1）从液氮罐中取出一支表达重组抗VEGF人源化单克隆抗体的工程细胞株，迅速投入到37℃温水中复融；将细胞悬液移至离心管，加入37℃预热的扩培培养基9mL，800rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀中加入新鲜的预热37℃扩培培养基10mL，轻轻吹打后，移入已装有50ml培养基的250ml摇瓶中，将摇瓶转入摇床，调节转速为150rpm，于5%CO₂、37℃恒温摇床中培养2天；

（2）扩培细胞罐培养：

2L罐扩培：待摇瓶中细胞密度生长到2.0×10⁶cell/mL时，以体积比1:4的比例将细胞稀释到2L细胞罐中进行扩培，扩培工艺条件为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速200rpm；

100L罐扩培：10L罐中培养2天后，待细胞密度长到2.0×10⁶cell/mL后，以体积比1:4的比例将细胞稀释到含有40L完全培养基的100L扩培罐中，接种后体积为50L，培养工艺为：温度37℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速75rpm；在细胞培养的第4、6天各补料10L%体积，各5L，补料后总体积为60L，所述补料为5倍浓缩完全培养基；细胞在第7天后生长至18×106cell/mL，收集处在此对数生长期的种子细胞准备转移到生产罐，

（3）150L生产细胞罐培养：

将步骤（2）中60L种子细胞无菌转移到含有60L完全培养基的150L细胞生产培养罐中，所用培养工艺为：温度33℃，pH控制范围是7.0±0.2，溶氧（DO）控制在40%，搅拌转速50rpm；在细胞培养的第8天，即生产细胞罐中的第1天，补料10L，总体积130L，每天取样计数，细胞在第15天，即生产细胞罐中的第7天时活力下降到60%，收集所有细胞上清进行纯化，得到纯化后的原液。