CN113337452A - 一种利用高密度cho-s细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用高密度CHO‑S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，包括以下步骤：S1：首先从液氮中取出装CHO‑S细胞离心管，并在37℃水浴中快速解冻；S2：将CHO‑S细胞离心管完全解冻后，再用70％乙醇清洁CHO‑S细胞离心管的外壁，随后将CHO‑S细胞离心管内全部内容物倒入装有30ml预热的CHO‑S表达培养基的一次性125ml无菌锥形摇瓶中；S3：随后再将一次性125ml无菌锥形摇瓶放入细胞培培养箱养内进行培养，同时每天计算培养的总细胞数和活细胞数。本发明利用CHO‑S高密度无血清培养的方法表达和制备双特特异性抗体优化，通过对转染细胞使用的抗体重链和轻链质粒进行质粒提取、去内毒素、浓度定量和轻重配比的方法优化，从而获得获得更高的表达产物。
Description
技术领域
本发明涉及一种退热药浴包，具体是一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法。
背景技术
哺乳动物细胞具有和人类相似的复杂翻译后修饰，常被用来表达具有活性的生物大分子蛋白，而这些生物大分子的功能发挥在一定程度上依赖于这些翻译后修饰。3T3，BHK，293，CHO，NS0，Hela等细胞均被研究并用作生物大分子蛋白的表达，但是有近70％已经上市的治疗性蛋白是由CHO细胞表达生产的，CHO细胞已经成为需要复杂翻译后修饰的治疗性蛋白生产的主要工具。
现有的CHO-S细胞在进行制备时，补液条件较为苛刻，同时培养时间也较长。因此，一种能对传染后细胞的补液条件进行优化，能对培养时间进行优化，还能对纯化条件进行优化，并可以获得更高表达产物的制备双因子抗体方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
包括以下步骤：
S1：首先从液氮中取出装CHO-S细胞离心管，并在37℃水浴中快速解冻；
S2：将CHO-S细胞离心管完全解冻后，再用70％-75％乙醇清洁 CHO-S细胞离心管的外壁，随后将CHO-S细胞离心管内全部内容物倒入装有30ml预热的CHO-S表达培养基的一次性125ml无菌锥形摇瓶中；
S3：随后再将一次性125ml无菌锥形摇瓶放入细胞培培养箱养内进行培养，同时每天计算培养的总细胞数和活细胞数；
S4：当培养浓度不超过5×106个活细胞/ml时，转移细胞悬液到更大体积的一次性无菌锥形瓶中，并放置到细胞培培养箱内继续培养，在CHO-S培养基通过两次以上不间断对数生长的细胞培养后即可进行下一步骤；
S5：活细胞密度达到1.0×106细胞/ml且细胞活力≥96％的范围内，最终用于可用于抗体基因的转染，完成转染细胞准备；
S6：使用质粒大提试剂盒，提取DNA，并向过滤后的细菌裂解液中加入除内毒素溶液增加1倍，达到到5ml，冰上孵育时间增加1倍，到60min，直到处理上清澄清；
S7：随后再使用内毒素检测试剂盒对提取的DNA进行内毒素检测，确认抗体重链和轻链的质粒DNA内毒素较低时，即可进行下一步骤；
S8：对提取的抗体重链和轻链的质粒进行琼脂糖电泳，确认超螺旋的DNA分子比例不低于90％；
S9：按照抗体DNA重链和轻链用量2:3比例混合与OPT培养基中，并且等量OPT培养基稀释转染试剂后，将转染试剂DNA混合，轻轻混合均匀再加入CHO细胞中混匀，并放回摇床培养进行进行CHO-S细胞的转染。
优选的，所述S3中的细胞培培养箱的CO2含量为为8％，所述S3 中的细胞培培养箱的温度为37℃，所述S3中的细胞培培养箱的转数为130rpm。
优选的，所述S4中的细胞培培养箱的转数为125rpm，在S4步骤中，如果需要维持或扩大细胞数目，可重复S4中的步骤，并密切监测培养细胞的聚集程度。
优选的，所述S9中的轻轻混合均匀后，静置10分钟再加入CHO 细胞中混匀。
优选的，所述S7中的内毒素检测试剂盒应为全新的无内毒素的内毒素检测试剂盒。
优选的，在S4中提到的更大体积的一次性无菌锥形瓶的容量≥ 140ml。
优选的，所述S7中的质粒DNA内毒素应当低于0.1EU才可进行下一步骤。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，利用CHO-S高密度无血清培养的方法表达和制备双特特异性抗体优化，具体是通过对转染细胞使用的抗体重链和轻链质粒进行质粒提取、去内毒素、浓度定量和轻重配比的方法优化，再对传染后细胞的补液条件进行优化、对培养时间进行优化、对纯化条件进行优化等，从而获得获得更高的表达产物，创新性较强，相比于现有技术，进步明显。
附图说明
图1为本发明中的细胞密度差别表格图；
图2为本发明中的PH差别表格图；
图3为本发明中的细胞活力差别表格图；
图4为本发明中上清特异性检测抗体信号的差别表格图；
图5为本发明中为抗体蛋白电泳结果表格图(图中数字含义为1：7D5单抗；2：iMabH-7D5双抗；3：iMab单抗；4：iMabH-7D5双抗)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例一，一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，包括以下步骤：
S1：首先从液氮中取出装CHO-S细胞离心管，并在37℃水浴中快速解冻；
S2：将CHO-S细胞离心管完全解冻后，再用70％乙醇清洁CHO-S 细胞离心管的外壁，随后将CHO-S细胞离心管内全部内容物倒入装有 30ml预热的CHO-S表达培养基的一次性125ml无菌锥形摇瓶中；
S3：随后再将一次性125ml无菌锥形摇瓶放入细胞培培养箱养内进行培养，同时每天计算培养的总细胞数和活细胞数；
S4：当培养浓度不超过5×106个活细胞/ml时，转移细胞悬液到更大体积的一次性无菌锥形瓶中，并放置到细胞培培养箱内继续培养，在CHO-S培养基通过两次以上不间断对数生长的细胞培养后即可进行下一步骤；
S5：活细胞密度达到1.0×106细胞/ml且细胞活力等于97％的范围内，最终用于可用于抗体基因的转染，完成转染细胞准备；
S6：使用质粒大提试剂盒，提取DNA，并向过滤后的细菌裂解液中加入除内毒素溶液增加1倍，达到到5ml，冰上孵育时间增加1倍，到60min，直到处理上清澄清；
S7：随后再使用内毒素检测试剂盒对提取的DNA进行内毒素检测，确认抗体重链和轻链的质粒DNA内毒素较低时，即可进行下一步骤；
S8：对提取的抗体重链和轻链的质粒进行琼脂糖电泳，确认超螺旋的DNA分子比例不低于90％；
S9：按照抗体DNA重链和轻链用量2:3比例混合与OPT培养基中，并且等量OPT培养基稀释转染试剂后，将转染试剂DNA混合，轻轻混合均匀再加入CHO细胞中混匀，并放回摇床培养进行进行CHO-S细胞的转染。
进一步的，所述S3中的细胞培培养箱的CO2含量为为8％，所述 S3中的细胞培培养箱的温度为37℃，所述S3中的细胞培培养箱的转数为130rpm。
进一步的，所述S4中的细胞培培养箱的转数为125rpm，在S4 步骤中，如果需要维持或扩大细胞数目，可重复S4中的步骤，并密切监测培养细胞的聚集程度。
进一步的，所述S9中的轻轻混合均匀后，静置10分钟再加入 CHO细胞中混匀。
进一步的，所述S7中的内毒素检测试剂盒应为全新的无内毒素的内毒素检测试剂盒。
进一步的，在S4中提到的更大体积的一次性无菌锥形瓶的容量为140ml。
进一步的，所述S7中的质粒DNA内毒素应当低于0.1EU才可进行下一步骤。
本发明实施例二，一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，包括以下步骤：
S1：首先从液氮中取出装CHO-S细胞离心管，并在37℃水浴中快速解冻；
S2：将CHO-S细胞离心管完全解冻后，再用72％乙醇清洁CHO-S 细胞离心管的外壁，随后将CHO-S细胞离心管内全部内容物倒入装有30ml预热的CHO-S表达培养基的一次性125ml无菌锥形摇瓶中；
S3：随后再将一次性125ml无菌锥形摇瓶放入细胞培培养箱养内进行培养，同时每天计算培养的总细胞数和活细胞数；
S4：当培养浓度不超过5×106个活细胞/ml时，转移细胞悬液到更大体积的一次性无菌锥形瓶中，并放置到细胞培培养箱内继续培养，在CHO-S培养基通过两次以上不间断对数生长的细胞培养后即可进行下一步骤；
S5：活细胞密度达到1.0×106细胞/ml且细胞活力等于99％的范围内，最终用于可用于抗体基因的转染，完成转染细胞准备；
S6：使用质粒大提试剂盒，提取DNA，并向过滤后的细菌裂解液中加入除内毒素溶液增加1倍，达到到5ml，冰上孵育时间增加1倍，到60min，直到处理上清澄清；
S7：随后再使用内毒素检测试剂盒对提取的DNA进行内毒素检测，确认抗体重链和轻链的质粒DNA内毒素较低时，即可进行下一步骤；
S8：对提取的抗体重链和轻链的质粒进行琼脂糖电泳，确认超螺旋的DNA分子比例不低于90％；
S9：按照抗体DNA重链和轻链用量2:3比例混合与OPT培养基中，并且等量OPT培养基稀释转染试剂后，将转染试剂DNA混合，轻轻混合均匀再加入CHO细胞中混匀，并放回摇床培养进行进行CHO-S细胞的转染。
进一步的，所述S3中的细胞培培养箱的CO2含量为为8％，所述 S3中的细胞培培养箱的温度为37℃，所述S3中的细胞培培养箱的转数为130rpm。
进一步的，所述S4中的细胞培培养箱的转数为125rpm，在S4 步骤中，如果需要维持或扩大细胞数目，可重复S4中的步骤，并密切监测培养细胞的聚集程度。
进一步的，所述S9中的轻轻混合均匀后，静置10分钟再加入 CHO细胞中混匀。
进一步的，所述S7中的内毒素检测试剂盒应为全新的无内毒素的内毒素检测试剂盒。
进一步的，在S4中提到的更大体积的一次性无菌锥形瓶的容量为160ml。
进一步的，所述S7中的质粒DNA内毒素应当低于0.1EU才可进行下一步骤。
本发明实施例三，一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，包括以下步骤：
S1：首先从液氮中取出装CHO-S细胞离心管，并在37℃水浴中快速解冻；
S2：将CHO-S细胞离心管完全解冻后，再用74％乙醇清洁CHO-S 细胞离心管的外壁，随后将CHO-S细胞离心管内全部内容物倒入装有 30ml预热的CHO-S表达培养基的一次性125ml无菌锥形摇瓶中；
S3：随后再将一次性125ml无菌锥形摇瓶放入细胞培培养箱养内进行培养，同时每天计算培养的总细胞数和活细胞数；
S4：当培养浓度不超过5×106个活细胞/ml时，转移细胞悬液到更大体积的一次性无菌锥形瓶中，并放置到细胞培培养箱内继续培养，在CHO-S培养基通过两次以上不间断对数生长的细胞培养后即可进行下一步骤；
S5：活细胞密度达到1.0×106细胞/ml且细胞活力等于98％的范围内，最终用于可用于抗体基因的转染，完成转染细胞准备；
S6：使用质粒大提试剂盒，提取DNA，并向过滤后的细菌裂解液中加入除内毒素溶液增加1倍，达到到5ml，冰上孵育时间增加1倍，到60min，直到处理上清澄清；
S7：随后再使用内毒素检测试剂盒对提取的DNA进行内毒素检测，确认抗体重链和轻链的质粒DNA内毒素较低时，即可进行下一步骤；
S8：对提取的抗体重链和轻链的质粒进行琼脂糖电泳，确认超螺旋的DNA分子比例不低于90％；
S9：按照抗体DNA重链和轻链用量2:3比例混合与OPT培养基中，并且等量OPT培养基稀释转染试剂后，将转染试剂DNA混合，轻轻混合均匀再加入CHO细胞中混匀，并放回摇床培养进行进行CHO-S细胞的转染。
进一步的，所述S3中的细胞培培养箱的CO2含量为为8％，所述 S3中的细胞培培养箱的温度为37℃，所述S3中的细胞培培养箱的转数为130rpm。
进一步的，所述S4中的细胞培培养箱的转数为125rpm，在S4 步骤中，如果需要维持或扩大细胞数目，可重复S4中的步骤，并密切监测培养细胞的聚集程度。
进一步的，所述S9中的轻轻混合均匀后，静置10分钟再加入 CHO细胞中混匀。
进一步的，所述S7中的内毒素检测试剂盒应为全新的无内毒素的内毒素检测试剂盒。
进一步的，在S4中提到的更大体积的一次性无菌锥形瓶的容量为166ml。
进一步的，所述S7中的质粒DNA内毒素应当低于0.1EU才可进行下一步骤。
取上述实施例，并在转染后第4天，5天，6天，7天，8天，每天取4mL上清测PH值、细胞密度、细胞活力和上清特异性检测抗体信号，并在取样后向摇瓶里补4mL培养基。
其中1号瓶为常规培养，2号瓶为第4天取样完，除补上4mL培养基后，额外补加8mL培养基20％，3号瓶为第6天取样完，并将细胞离心，上清保存在4度，细胞用40mL培养基重悬。
由图1-5的数据可知，D4补液的培养基pH最稳定，其细胞活性状态最好，利用ELISA进行表达检测，确认2号摇瓶表达量持续上升，到D8基本为最高表达，纯化后的得率最高。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：首先从液氮中取出装CHO-S细胞离心管，并在37℃水浴中快速解冻；
S2：将CHO-S细胞离心管完全解冻后，再用70％-75％乙醇清洁CHO-S细胞离心管的外壁，随后将CHO-S细胞离心管内全部内容物倒入装有30ml预热的CHO-S表达培养基的一次性125ml无菌锥形摇瓶中；
S3：随后再将一次性125ml无菌锥形摇瓶放入细胞培培养箱养内进行培养，同时每天计算培养的总细胞数和活细胞数；
S4：当培养浓度不超过5×106个活细胞/ml时，转移细胞悬液到更大体积的一次性无菌锥形瓶中，并放置到细胞培培养箱内继续培养，在CHO-S培养基通过两次以上不间断对数生长的细胞培养后即可进行下一步骤；
S5：活细胞密度达到1.0×106细胞/ml且细胞活力≥96％的范围内，最终用于可用于抗体基因的转染，完成转染细胞准备；
S6：使用质粒大提试剂盒，提取DNA，并向过滤后的细菌裂解液中加入除内毒素溶液增加1倍，达到到5ml，冰上孵育时间增加1倍，到60min，直到处理上清澄清；
S7：随后再使用内毒素检测试剂盒对提取的DNA进行内毒素检测，确认抗体重链和轻链的质粒DNA内毒素较低时，即可进行下一步骤；
S8：对提取的抗体重链和轻链的质粒进行琼脂糖电泳，确认超螺旋的DNA分子比例不低于90％；
S9：按照抗体DNA重链和轻链用量2:3比例混合与OPT培养基中，并且等量OPT培养基稀释转染试剂后，将转染试剂DNA混合，轻轻混合均匀再加入CHO细胞中混匀，并放回摇床培养进行进行CHO-S细胞的转染。
2.根据权利要求1所述的一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，其特征在于：所述S3中的细胞培培养箱的CO2含量为为8％，所述S3中的细胞培培养箱的温度为37℃，所述S3中的细胞培培养箱的转数为130rpm。
3.根据权利要求1所述的一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，其特征在于：所述S4中的细胞培培养箱的转数为125rpm，在S4步骤中，如果需要维持或扩大细胞数目，可重复S4中的步骤，并密切监测培养细胞的聚集程度。
4.根据权利要求1所述的一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，其特征在于：所述S9中的轻轻混合均匀后，静置10分钟再加入CHO细胞中混匀。
5.根据权利要求1所述的一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，其特征在于：所述S7中的内毒素检测试剂盒应为全新的无内毒素的内毒素检测试剂盒。
6.根据权利要求1所述的一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，其特征在于：在S4中提到的更大体积的一次性无菌锥形瓶的容量≥140ml。
7.根据权利要求1所述的一种利用高密度CHO-S细胞无血清培养表达制备双因子抗体的方法，其特征在于：所述S7中的质粒DNA内毒素应当低于0.1EU才可进行下一步骤。
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2021
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