CN108148870B - 一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，属于体外siRNA转运的技术领域。包括以下步骤：1)采用直接混合的方法制备壳聚糖/siRNA复合物；2)将步骤1)中形成的壳聚糖/siRNA复合物在含钙镁的汉克缓冲盐溶液(HBSS)中转染细胞。同时，本发明方法还提出“一步法”转染，即不采用预混合的方式，直接将壳聚糖溶液和siRNA同样按比例用量加入到含钙镁HBSS中转染细胞。该方法操作简单，实用性强，通过该方法能实现壳聚糖在多种细胞系中对siRNA的高效转运，大大降低了体外siRNA转运载体的成本。
Description
技术领域
本发明属于体外siRNA转运技术领域，涉及优化壳聚糖体外转运方法，具体涉及一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法。
背景技术
RNA干扰技术是目前最为广泛应用的基因负向干预方法，不仅可以用于实验室基因沉默工具，同时也广泛的应用于siRNA相关治疗药物的研发。在RNA干扰技术的研究中，开发高效、安全、经济的siRNA转运载体是研究的主要方向。目前体外商品化的siRNA转运载体较多，包括lipofectamine 2000、RNAiMAX、N-TER Nanoparticle siRNA TransfectionSystem、MagicTMsiRNA Transfection Reagent、jetPEI等，但具有价格昂贵、操作繁琐等缺点。因此，大量的研究集中于研发更为廉价的载体，其中壳聚糖具有潜在的应用价值。
然而虽然壳聚糖/siRNA被证实具有一定的基因沉默效果，但总体而言效率不佳。大部分学者因此抛弃了壳聚糖，也有学者尝试对壳聚糖进行化学修饰以提高其转染效率，但这些修饰无形中增加了经济成本。因此有必要转换思路，从其他方面进行思考尝试。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，该方法操作简便、提升效率显著、经济成本极低，具有很强的实用性，通过该方法进行细胞转染，可以实现高效、简便、廉价地转染细胞的目的。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开了一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，包括以下步骤：
1)分别配制壳聚糖溶液和siRNA溶液，将壳聚糖溶液和siRNA溶液按10：1的体积比混合均匀，形成壳聚糖/siRNA复合物；
2)将步骤1)形成的壳聚糖/siRNA复合物在含钙镁的汉克缓冲盐溶液中转染细胞。
优选地，壳聚糖溶液的浓度为0.8～1mg/ml，siRNA溶液的浓度为20μM。
优选地，所用壳聚糖的分子量为30～150kDa，脱乙酰度在85％～95％之间。
更进一步优选地，选用的壳聚糖的分子量(kDa)/脱乙酰度(％)分别为30/85、30/95、150/85、150/95；
优选地，溶解壳聚糖采用pH为5.5且浓度为0.2M的醋酸钠缓冲液；溶解siRNA采用RNase-free水。
优选地，步骤1)中，利用带正电的壳聚糖分子和带负电的siRNA分子静电作用力，采用直接混合形成转染复合物，具体是将壳聚糖溶液和siRNA溶液采用直接混合静电相互作用的方法，震荡30s，形成壳聚糖/siRNA复合物。
优选地，步骤2)中，在含钙镁的汉克缓冲盐溶液中转染细胞，具体操作为：
将细胞提前一天接种于24孔板内，在转染当天将培养液换成含钙镁的HBSS，随后加入壳聚糖/siRNA复合物，具体的用量以转染使用的培养液体积计算，使得siRNA的终浓度为40nM，转染4小时后换成普通培养液。
更进一步优选地，本发明将稳定表达绿色荧光蛋白GFP的Hela细胞、H1299细胞以及人间充质干细胞hMSC提前一天接种到24孔板内。
本发明还公开了一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，即一步法，包括以下步骤：
1)分别配制壳聚糖溶液和siRNA溶液；
2)将壳聚糖溶液和siRNA溶液按10：1的体积比加入含钙镁的汉克缓冲盐溶液中转染细胞。
优选地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.8～1mg/ml，溶解壳聚糖采用pH为5.5且浓度为0.2M的醋酸钠缓冲液；所述siRNA溶液的浓度为20μM，溶解siRNA采用RNase-free水。
优选地，所用壳聚糖的分子量为30～150kDa，脱乙酰度在85％～95％之间。
优选地，步骤2)中，在含钙镁的汉克缓冲盐溶液中转染细胞，具体操作为：
将细胞提前一天接种于24孔板内，在转染当天将培养液换成含钙镁的HBSS，将壳聚糖溶液与siRNA溶液分别加入HBSS中，使得siRNA终浓度为40nM，转染4小时后换成普通培养液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，首先配制壳聚糖溶液和siRNA溶液；然后直接在含钙镁的HBSS中进行细胞转染，可以显著提升靶基因沉默效率。本发明公开的方法不依赖与壳聚糖与siRNA预混合形成复合物，直接按比例加入HBSS中进行转染，同样可以获得高效的转染效率。本发明显著改善并简化了壳聚糖转运siRNA的方法，操作简单，实用性强，通过该方法能实现壳聚糖在多种细胞系中对siRNA的高效转运，大大降低了体外siRNA转运载体的成本，为开发廉价的siRNA转运体系提供了新思路。
附图说明
图1为不同参数壳聚糖/siRNA在不同转染条件下对Hela细胞靶基因的沉默效率；
图2为不同参数壳聚糖/siRNA在不同转染条件下对H1299细胞靶基因的沉默效率；
图3为不同参数壳聚糖/siRNA在不同转染条件下对hMSC细胞靶基因的沉默效率；
图4为在倒置荧光显微镜下观察细胞采用“一步法”对hMSC转染效率结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明公开的提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，包括以下步骤：
(1)配制壳聚糖和siRNA溶液
①、分别配制0.2M醋酸和0.2M醋酸钠，将二者按照1：10比例混合，形成pH 5.5的缓冲液；称取适量的壳聚糖用缓冲液溶解，使得浓度为1mg/ml，壳聚糖的分子量(kDa)/脱乙酰度(％)分别为30/85、30/95、150/85、150/95；采用孔径0.22μm的一次性针状滤器过滤除菌；
②、实验采用的靶向绿色荧光蛋白GFP的siRNA(siGFP)序列
正义序列：
5’-GACGUAAACGGCCACAAGUUC-3’；
反义序列：
5’-ACUUGUGGCCGUUUACGUCGC-3’；
阴性对照(siNC)序列
正义序列：
5’-UCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
反义序列：
5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
溶解siRNA采用RNase-free的水，浓度为20μM。
(2)制备壳聚糖/siRNA复合物
取1000μl壳聚糖溶液与100μl siRNA溶液混合，震荡30s，形成壳聚糖/siRNA复合物备用。
(3)细胞转染与基因沉默效率检测
具体方法:
①、在提前1天接种稳定表达GFP的细胞于24孔板内，包括Hela，H299和hMSC，密度为2×104每孔；
②、将步骤(2)制备的壳聚糖/siRNA复合物加入转染培养液中，使得siRNA终浓度为40nM，并使用脂质体2000作为阳性对照；转染培养基分别采用含钙镁的HBSS；
③、转染4小时后换成正常培养液，48小时后流式细胞仪检测GFP沉默效率。
本发明还公开了采用“一步法”转染，具体包括以下步骤：
①、在提前1天接种稳定表达GFP的hMSC细胞于24孔板内，密度为2×104每孔；
②、将培养液换成HBSS，壳聚糖与siRNA分别按照步骤(2)的比例加入HBSS中，使得siRNA终浓度为40nM；
③、转染4小时后换成正常培养液，48小时后流式细胞仪检测GFP沉默效率。
实验方法：
1、细胞培养与接种
具体步骤如下：
(1)稳定表达GFP的Hela细胞和H1299细胞培养在RPMI 1640+10％胎牛血清+1％双抗中；稳定表达GFP的hMSC细胞培养在MEM+10％胎牛血清+1％双抗中；培养液每周换2次。
(2)待细胞密度长至80％左右时用0.25％胰蛋白酶+EDTA在37℃消化后离心，制备成20000/ml细胞悬液；在24孔板内每孔加入800μl细胞悬液进行细胞接种。
2、壳聚糖/siRNA复合物制备
具体操作为：按照24孔板每孔计算，取12μl壳聚糖溶液与1.2μl siRNA溶液混合，震荡30s，形成壳聚糖/siRNA复合物。
3、细胞转染实验
具体步骤如下：
(1)细胞接种培养24小时。
(2)吸弃培养液后用PBS漂洗细胞，加入600μl含钙镁的HBSS。
(3)在HBSS中加入壳聚糖/siRNA复合物或者直接将同样比例的壳聚糖与siRNA分别加入，转染4小时后分别换成各自的完整培养液。
4、流式细胞仪
具体步骤如下：
(1)将细胞用0.25％胰蛋白酶+EDTA消化后离心，小心吸弃上清，每孔用300μl的PBS重悬后转移至流式细胞仪分析管内。
(2)上机检测，依据SS与FS进行圈选细胞，分析GFP荧光强度和分布，计算GFP沉默效率。参见图1、2和3，分别是GFP沉默效率分别在Hela、H1299和hMSC中的结果，可以看出，具有不同参数的壳聚糖/siRNA复合物均在HBSS中的沉默效率最强，与脂质体2000具有同等效率，这提示可以用廉价的壳聚糖代替脂质体2000进行体外细胞转染。
5、荧光显微镜
具体步骤如下：
(1)在转染结束48小时后，吸弃培养液加入PBS。
(2)直接在倒置荧光显微镜下观察细胞，固定曝光时间拍摄GFP绿色荧光通道的细胞荧光强度。参见图4，为采用“一步法”转染观察，可见将壳聚糖与siRNA分别按比例加入培养液中进行细胞转染，同样可以实现高效的GFP基因沉默效率，这提示采用廉价的壳聚糖代替脂质体2000进行体外细胞转染还具有极为便捷的优势，无需先制备转染复合物。
综上所述，本发明提出了一种能够大幅度提升壳聚糖/siRNA转染细胞效率的方法，先采用常规方法制备壳聚糖/siRNA复合物；然后在含钙镁的HBSS溶液中进行细胞转染可以显著提升转染效率。同时，本发明尝试不采用预混合的方法，直接将壳聚糖与siRNA按照比例加入HBSS中进行细胞转染，获得了相似的转染效率。本发明显著改善并简化了壳聚糖转运siRNA的方法，为开发廉价的siRNA转运体系提供了新思路。
Claims (4)
1.一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别配制壳聚糖溶液和siRNA溶液，将壳聚糖溶液和siRNA溶液按10：1的体积比混合均匀，形成壳聚糖/siRNA复合物；
其中，所用壳聚糖的分子量为30kDa，脱乙酰度在85％～95％之间；壳聚糖溶液的浓度为0.8～1mg/ml，siRNA溶液的浓度为20μM；将壳聚糖溶液和siRNA溶液采用直接混合静电相互作用的方法，震荡30s，形成壳聚糖/siRNA复合物；
2)将步骤1)形成的壳聚糖/siRNA复合物在含钙镁的汉克缓冲盐溶液中转染细胞，具体操作为：
将细胞提前一天接种于24孔板内，在转染当天将培养液换成含钙镁的HBSS，随后加入壳聚糖/siRNA复合物，使得siRNA的终浓度为40nM，转染4小时后换成普通培养液。
2.根据权利要求1所述的提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，其特征在于，溶解壳聚糖采用pH为5.5且浓度为0.2M的醋酸钠缓冲液；溶解siRNA采用RNase-free水。
3.一种提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别配制壳聚糖溶液和siRNA溶液；
其中，所用壳聚糖的分子量为30kDa，脱乙酰度在85％～95％之间；所述壳聚糖溶液的浓度为0.8～1mg/ml，所述siRNA溶液的浓度为20μM；
2)将壳聚糖溶液和siRNA溶液按10：1的体积比加入含钙镁的汉克缓冲盐溶液中转染细胞，具体操作为：
将细胞提前一天接种于24孔板内，在转染当天将培养液换成含钙镁的HBSS，将壳聚糖溶液与siRNA溶液分别加入HBSS中，使得siRNA终浓度为40nM，转染4小时后换成普通培养液。
4.根据权利要求3所述的提高壳聚糖体外转运siRNA效率的方法，其特征在于，溶解壳聚糖采用pH为5.5且浓度为0.2M的醋酸钠缓冲液；溶解siRNA采用RNase-free水。
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