CN101940551B - 一种巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米粒技术领域，涉及一种巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒、其制备方法及应用。本发明的巯基化壳聚糖季胺盐由壳聚糖依次经季胺化和巯基化修饰而成。本发明的纳米粒由荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐和荷负电的蛋白质多肽药物或核酸药物经聚电解质作用生成。与现有技术相比，该纳米粒的制备过程简单易控，无需使用有机溶剂，可有效提高药物稳定性。该纳米粒促蛋白质药物小肠吸收和促核酸药物细胞转染的功效显著优于现有的壳聚糖季胺盐纳米粒。
Description
技术领域
本发明属于纳米粒技术领域，具体涉及一种巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒、其制备方法及应用。
背景技术
纳米粒是指粒径介于10-1000nm之间的固态胶体粒子。由于其可提高药物溶解性和稳定性，延长体内循环时间，且具有良好的缓控释效果，已广泛应用于蛋白质和基因药物给药系统。现有技术公开了众多制备纳米粒的方法，包括溶剂挥发法、表面聚合法、乳化法、自组装法等。荷正电的聚合物分子与荷负电的药物通过静电作用自组装形成纳米粒，制备过程无需使用有机溶剂及加热、剧烈震荡等手段，可有效保持药物活性，因此已被广泛应用(Mao et al.，J Pharm Sci 2006，95：1035-48)。
壳聚糖是自然界中唯一存在的碱性多糖，由于其无毒、可生物降解及生物相容性良好的，已被广泛应用于工业、食品、医药、水处理、化妆品等领域。但壳聚糖仅溶于少数酸性溶液，限制了其应用。壳聚糖季胺盐是壳聚糖经季胺化修饰后的产物，在中性条件下易溶。对于蛋白质多肽药物口服给药而言，壳聚糖季胺盐在中性条件下荷较强的正电，可与荷负电的小肠黏液层作用，增强黏膜黏附性；其通过与带负电荷的生物黏膜表面的类脂质作用，打开小肠上皮细胞间紧密连结，促进亲水性大分子药物经细胞旁路转运和吸收(vander Merwe et al.，Eur J Pharm Biopharm 2004，58：225-35)。此外，荷正电的壳聚糖季胺盐还可与生理条件下荷负电的蛋白质药物，如胰岛素，通过静电作用和聚电解质效应缩合形成纳米粒，从而进一步提高药物的稳定性，促进药物经胞内途径和Peyer’s结的摄取途径吸收。对于基因传释而言，荷正电的壳聚糖季胺盐与荷负电的核酸分子在一定的比例下可缩合形成表面带正电的纳米复合物。其可与带负电荷的细胞膜作用，促进核酸分子经胞吞、胞饮等途径入胞，产生基因转染。此外，纳米复合物还能有效防止细胞内外的核酸内切酶和核酸外切酶对核酸分子的降解(Kean et al.，J Control Release 2005，103：143-53.)。
巯基化聚合物(Thiomer)作为一种新型的黏膜黏附性材料，是亲水性高分子聚合物的侧链经巯基化合物修饰所得的产物。研究报道，生理条件下其可与黏膜黏液层糖蛋白中富含半胱氨酸的区域形成二硫键，以共价键紧密结合于黏膜，延长药物在体内的滞留时间，提高药物的局部浓度，促进药物吸收(Bernkop-Schnurich et al.，Adv Drug Deliv Rev 2005，57：1569-82)。目前已对壳聚糖、海藻酸、聚丙烯酸、卡波普、羧甲基纤维素钠等高分子聚合物进行了巯基化修饰，其黏膜黏附力提高了几倍至上百倍。巯基化聚合物还可通过抑制酪氨酸磷酸酶的活性和P糖蛋白促进蛋白质药物的小肠吸收。此外，巯基化壳聚糖，如壳聚糖-巯基乙酸共聚物(Lee et al.，Pharm Res 2006，24：157-67)、壳聚糖-4-巯基-丁基脒共聚物(Schmitz et al.，Biomaterials 2007，28：524-531)等，也已应用于基因传释系统。巯基化壳聚糖上的氨基质子化荷正电，与负电荷pDNA缩合形成纳米复合物，提高pDNA的稳定性，促进基因转染。然而，由于巯基化壳聚糖在中性条件下溶解度较差，因此限制了其进一步应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒、其制备方法及应用。本发明的纳米粒由荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐和荷负电的蛋白质多肽药物或核酸药物经聚电解质作用生成。
在本发明的第一方面，提供了一种巯基化壳聚糖季胺盐，所述的巯基化壳聚糖季胺盐为壳聚糖的氨基依次经季胺化修饰和巯基化修饰所得的共聚物，其中壳聚糖重均分子量为30～1,000kDa，季胺化度为15～80％(摩尔百分数)，巯基化修饰物为半胱氨酸或巯基乙酸，(根据1H NMR计算而得，方法参见Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)，游离巯基修饰率为40～400μmol/g，二硫键修饰率为60～600μmol/g。
在本发明的优选例中，所述的巯基化壳聚糖季胺盐为壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物，其具有下式结构：
在另一优选例中，所述的巯基化壳聚糖季胺盐为壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物，其具有下式结构：
在本发明的第二方面，提供了一种巯基化壳聚糖季胺盐的制备方法，步骤如下：
(1)按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成壳聚糖季胺盐，反应时间为45～240min，所得壳聚糖季胺盐以Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；其中反应45、120、180和240min所得壳聚糖季胺盐的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％；
(2)将壳聚糖季胺盐和半胱氨酸或巯基乙酸溶于水中，壳聚糖季胺盐和半胱氨酸或巯基乙酸的质量比为32∶1～1∶10，加入终浓度分别为50～500mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调节pH至3.0～5.0，室温反应2～8h，透析纯化，冷冻干燥，得壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物或壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物；
在另一优选例中，壳聚糖季胺盐和半胱氨酸或巯基乙酸的质量比为1∶4。质量比过低时半胱氨酸或巯基乙酸的修饰率较低，质量比过高时过量的半胱氨酸或巯基乙酸在透析过程中较难除去。
在另一优选例中，EDAC和NHS的终浓度分别为300mM。EDAC和NHS的终浓度过低时半胱氨酸或巯基乙酸的修饰率较低，终浓度过高时残留的EDAC和NHS在透析过程中较难除去。
在另一优选例中，壳聚糖季胺盐和半胱氨酸或巯基乙酸的反应时间为5h。时间过短反应不完全，时间过长则产物易被氧化。
在本发明的第三方面，提供了一种巯基化壳聚糖季胺盐/蛋白质多肽药物自组装纳米粒，所述纳米粒由荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐和荷负电的蛋白质多肽药物组成。
在另一优选例中，所述的蛋白质多肽药物选自下组：胰岛素、降钙素、干扰素、抗利尿激素、奥曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、依诺肝素、红细胞生长素、血红蛋白、白蛋白、细胞色素、各种生长因子白介素、集落刺激因子、抗原或抗体。
在另一优选例中，巯基化壳聚糖季胺盐与蛋白质多肽药物的质量比为1∶5～5∶1，优选的质量比为1∶3～3∶1，更优选的质量比为1∶2～2∶1。
在另一优选例中，所述纳米粒的平均粒径为20～1000nm，优选的平均粒径为50～500nm，更优选的平均粒径为80～150nm。
在另一优选例中，所述纳米粒的Zeta电势为-20～50mV，优选的Zeta电势为5～40mV，更优选的Zeta电势为10～30mV。
在另一优选例中，所述纳米粒中蛋白质多肽药物的包封率为20～95％，优选的包封率为60～90％，更优选的包封率为80～90％。
在本发明的第四方面，提供了一种巯基化壳聚糖季胺盐/核酸药物自组装纳米粒，所述纳米粒由荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐和荷负电的核酸药物组成。
在另一优选例中，所述的核酸药物选自下组：DNA、RNA、低聚核苷酸或多核苷酸。
在另一优选例中，所述的DNA为质粒DNA。
在另一优选例中，所述的质粒DNA可以表达蛋白质或转录成小分子干扰RNA。
在另一优选例中，巯基化壳聚糖季胺盐与核酸药物的质量比为1∶1～30∶1，优选的质量比为5∶1～30∶1，更优选的质量比为15∶1～25∶1。
在另一优选例中，所述纳米粒的平均粒径为20～1000nm，优选的平均粒径为50～500nm，更优选的平均粒径为80～150nm。
在另一优选例中，所述纳米粒的Zeta电势为-20～50mV，优选的Zeta电势为5～40mV，更优选的Zeta电势为10～30mV。
在另一优选例中，所述纳米粒中核酸药物的包封率为20～95％，优选的包封率为60～90％，更优选的包封率为80～90％。
在本发明的第五方面，提供了一种本发明所述的巯基化壳聚糖季胺盐/蛋白质多肽药物自组装纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)巯基化壳聚糖季胺盐溶于水，蛋白质多肽药物溶于酸性溶液中并调节pH至7.0～9.0；
(2)将蛋白质多肽药物溶液滴加至巯基化壳聚糖季胺盐溶液中，巯基化壳聚糖季胺盐与蛋白质多肽药物的质量比为1∶5～5∶1；
(3)室温搅拌15～60min，荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐与荷负电的蛋白质多肽药物经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
在本发明的第六方面，提供了一种本发明所述的巯基化壳聚糖季胺盐/核酸药物自组装纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)巯基化壳聚糖季胺盐和和核酸药物分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中；
(2)将核酸药物溶液滴加至巯基化壳聚糖季胺盐溶液中，巯基化壳聚糖季胺盐与核酸药物的质量比为1∶1～30∶1；
(3)室温搅拌15～60min，荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐与荷负电的核酸药物经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
在本发明的第七方面，提供了巯基化壳聚糖季胺盐/蛋白质多肽药物自组装纳米粒在口服给药系统中的应用。
在另一优选例中，提供了巯基化壳聚糖季胺盐/胰岛素自组装纳米粒在口服给药系统中的应用。所述的巯基化壳聚糖季胺盐/胰岛素自组装纳米粒具有良好的黏膜黏附力，且显著高于壳聚糖季胺盐/胰岛素自组装纳米粒。所述的巯基化壳聚糖季胺盐/胰岛素自组装纳米粒可显著提高胰岛素的小肠转运、Caco-2细胞对胰岛素的摄取量及Peyer’s结处胰岛素的摄取量。所述的巯基化壳聚糖季胺盐/胰岛素自组装纳米粒在大鼠体内具有显著的口服降血糖效果。
在本发明的第八方面，提供了巯基化壳聚糖季胺盐/核酸药物自组装纳米粒在基因传释系统中的应用。
在另一优选例中，提供了巯基化壳聚糖季胺盐/绿荧光蛋白表达质粒(pEGFP)自组装纳米粒在基因传释系统中的应用。所述的巯基化壳聚糖季胺盐/绿荧光蛋白表达质粒自组装纳米粒具有良好的黏膜黏附力，且显著高于壳聚糖季胺盐/绿荧光蛋白表达质粒自组装纳米粒。所述的巯基化壳聚糖季胺盐/绿荧光蛋白表达质粒自组装纳米粒可显著抑制DNase对绿荧光蛋白表达质粒的降解。所述的巯基化壳聚糖季胺盐/绿荧光蛋白表达质粒自组装纳米粒可显著提高HEK293细胞对绿荧光蛋白表达质粒的摄取。所述的巯基化壳聚糖季胺盐/绿荧光蛋白表达质粒自组装纳米粒可显著提高绿荧光蛋白表达质粒在HEK293细胞中的转染效率，且其转染效率与常用的转染试剂LipofectamineTM2000相近。
本发明的主要优点在于：
(1)巯基化修饰显著提高壳聚糖季胺盐的溶解性。低季胺化度(＜30％)壳聚糖季胺盐在pH大于8.0或离子强度高于100mM时不能溶解，而巯基化壳聚糖季胺盐则在pH2.0～10.0和离子强度10～300mM内溶解性良好。壳聚糖季胺盐在中性条件下的溶解度仅为50mg/ml，而巯基化壳聚糖季胺盐在中性条件下的溶解度大于100mg/ml。
(2)巯基化壳聚糖季胺盐结合了壳聚糖季胺盐和巯基化聚合物在蛋白质多肽口服给药系统中的优势。其中壳聚糖季胺盐的正电性和巯基化聚合物可分别通过打开小肠上皮紧密连接和抑制酪氨酸磷酸酶活性促进蛋白质多肽药物的小肠吸收。此外巯基化壳聚糖季胺盐可通过静电吸引和形成分子间二硫键的双重作用提高与荷负电且富含半胱氨酸残基的黏蛋白的亲和力，从而具有更好的黏膜黏附力。其通过延长药物在小肠中的滞留时间和提高吸收部位的药物浓度，可进一步促进药物的小肠吸收，提高口服生物利用度。
(3)巯基化壳聚糖季胺盐结合了壳聚糖季胺盐和巯基化聚合物在基因传释系统中的优势。荷正电的巯基化壳聚糖可通过静电作用与荷负电的细胞膜作用，促进核酸药物进胞；此外其也可与细胞膜上富含半胱氨酸的黏蛋白形成二硫键，提高细胞膜黏附力，进一步促进基因进胞，提高转染效率。
(4)制备本发明的自组装纳米粒的过程简便，不需要使用有机溶剂，可有效防止药物失活。
(5)药物与巯基化壳聚糖季胺盐形成自组装纳米粒后，可有效屏蔽其酶切位点，提高药物的抗酶解能力。对于巯基化壳聚糖季胺盐/蛋白质多肽自组装纳米粒来说，可有效抑制蛋白水解酶，如肠腔中的胰蛋白酶、糜蛋白酶和羧肽酶，刷状缘膜囊中的外肽酶和细胞液中的溶菌酶对药物的降解，保持药物在吸收过程中的生物活性。对于巯基化壳聚糖季胺盐/核酸药物来说，可有效抑制核酸酶，如脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)对药物的降解，保持药物在细胞外液和细胞内液中的稳定性，发挥其生物功效。
(5)本发明的自组装纳米粒粒径较小，易于被细胞摄取。对于巯基化壳聚糖季胺盐/蛋白质多肽自组装纳米粒来说，可提高正常小肠上皮细胞和Peyer’s结处M细胞对纳米粒的摄取，促进药物经胞内途径和淋巴途经的吸收。对于巯基化壳聚糖季胺盐/核酸药物来说，可提高宿主细胞对纳米粒的摄取，促进基因转染。
(6)负电荷药物可以部分抵消巯基化壳聚糖季胺盐毒性的正电荷，所得的自组装纳米粒安全性好。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，浓度为质量体积百分数(w/v)。
术语
如本文所用，术语“TMC”指壳聚糖季胺盐。
如本文所用，术语“TMC-Cys”指壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物。
如本文所用，术语“TMC-TGA”指壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物。
如本文所用，术语“TMC-Cys(m，n)”指壳聚糖分子量为m(kDa)、季胺化度为n(％)的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物。
如本文所用，术语“TMC-TGA(m，n)”指壳聚糖分子量为m(kDa)、季胺化度为n(％)的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物。
附图说明
图1为TMC-Cys(200，30)/胰岛素自组装纳米粒(实施例29)的扫描电镜图，图中的标尺为1μm。
图2为TMC-Cys(100，30)/pEGFP自组装纳米粒(实施例47)的透射电镜图，图中的标尺为200nm。
图3为TMC-Cys(200，30)/胰岛素自组装纳米粒(实施例29)在正常大鼠体内的口服降血糖效果，给药剂量按胰岛素计为50IU/kg。
图4为TMC(100，15)/pEGFP和TMC(100，30)/pEGFP自组装纳米粒(实施例47)的抗核酶作用，
其中，泳道A-E：TMC-Cys(100，15)/pEGFP质量比依次为1、2.5、5、10、15；泳道F-J:：TMC-Cys(100，30)/pEGFP质量比依次为1、2.5、5、10、15；泳道K：裸pEGFP经DNase I处理后；泳道L：裸pEGFP。
具体实施方式
实施例1壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为30kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例2壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖分子量为重均100kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至3.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例3壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至4.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例4壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为500kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例5壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为1000kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；。称取500mg TMC溶于50mL水，2g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至4.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例6壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，15mg半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例7壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，100mg半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例8壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，500mg半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至3.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例9壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，5g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例10壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为50mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例11壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为500mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例12壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应2h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例13壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g半胱氨酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应8h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例14壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为30kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例15壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为100kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至3.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例16壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至4.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例17壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为500kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例18壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为1000kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例19壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，15mg巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例20壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，100mg巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例21壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，500mg巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例22壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，5g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至4.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例23壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为50mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例24壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为500mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例25壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应2h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例26壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物的制备
按照文献报道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57：77-83)合成TMC，壳聚糖重均分子量为200kDa，反应时间分别为45min、120min、180min和240min，所得TMC的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％。Cl-型阴离子交换树脂纯化TMC，透析，冷冻干燥；称取500mg TMC溶于50mL水，2g巯基乙酸溶于20mL水，混合，加入终浓度分别为300mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应8h，反应产物以pH 5.0HCl溶液(MWCO 3500Da)4℃透析5天，冷冻干燥。空白对照除不加EDAC/NHS外，其余反应条件均相同。
实施例27壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，胰岛素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至7.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和胰岛素浓度均为2mg/ml。搅拌下将胰岛素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与胰岛素的质量比为1∶5。室温搅拌60min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的胰岛素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例28壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，胰岛素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和胰岛素浓度均为2mg/ml。搅拌下将胰岛素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与胰岛素的质量比为1∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的胰岛素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例29壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，胰岛素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至9.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和胰岛素浓度均为2mg/ml。搅拌下将胰岛素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与胰岛素的质量比为5∶1。室温搅拌15min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的胰岛素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例30壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，胰岛素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和胰岛素浓度均为2mg/ml。搅拌下将胰岛素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与胰岛素的质量比为1∶2。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的胰岛素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例31壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，胰岛素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和胰岛素浓度均为2mg/ml。搅拌下将胰岛素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与胰岛素的质量比为2∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的胰岛素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例32壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/白蛋白自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，白蛋白溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和白蛋白浓度均为2mg/ml。搅拌下将白蛋白溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与白蛋白的质量比为1∶5。室温搅拌60min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的白蛋白经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例33壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/白蛋白自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，白蛋白溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和白蛋白浓度均为2mg/ml。搅拌下将白蛋白溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与白蛋白的质量比为1∶2。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的白蛋白经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例34壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/白蛋白自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，白蛋白溶于酸性溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和白蛋白浓度均为2mg/ml。搅拌下将白蛋白溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与白蛋白的质量比为5∶1。室温搅拌15min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的白蛋白经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例35壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/依诺肝素自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，依诺肝素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和依诺肝素浓度均为2mg/ml。搅拌下将依诺肝素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与依诺肝素的质量比为1∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的依诺肝素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例36壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/依诺肝素自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，依诺肝素溶于酸性溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和依诺肝素浓度均为2mg/ml。搅拌下将依诺肝素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与依诺肝素的质量比为1∶2。室温搅拌15min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的依诺肝素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例37壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/依诺肝素自组装纳米粒的制备
实施例3的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶于水，依诺肝素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和依诺肝素浓度均为2mg/ml。搅拌状态下将依诺肝素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与依诺肝素的质量比为5∶1。室温搅拌60min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的依诺肝素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例38壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒的制备
实施例16的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶于水，胰岛素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和胰岛素浓度均为2mg/ml。搅拌下将胰岛素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与胰岛素的质量比为1∶1。室温搅拌60min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的胰岛素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例39壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒的制备
实施例16的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶于水，胰岛素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和胰岛素浓度均为2mg/ml。搅拌下将胰岛素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与胰岛素的质量比为1∶2。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的胰岛素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例40壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒的制备
实施例16的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶于水，胰岛素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和胰岛素浓度均为2mg/ml。搅拌下将胰岛素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与胰岛素的质量比为5∶1。室温搅拌15min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的胰岛素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例41壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/白蛋白自组装纳米粒的制备
实施例16的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶于水，白蛋白溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和白蛋白浓度均为2mg/ml。搅拌下将白蛋白溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与白蛋白的质量比为1∶1。室温搅拌60min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的白蛋白经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例42壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/白蛋白自组装纳米粒的制备
实施例16的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶于水，白蛋白溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和白蛋白浓度均为2mg/ml。搅拌下将白蛋白溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与白蛋白的质量比为1∶2。室温搅拌15min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的白蛋白经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例43壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/白蛋白自组装纳米粒的制备
实施例16的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶于水，白蛋白溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和白蛋白浓度均为2mg/ml。搅拌下将白蛋白溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与白蛋白的质量比为2∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的白蛋白经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例44壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/依诺肝素自组装纳米粒的制备
实施例16的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶于水，依诺肝素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和依诺肝素浓度均为2mg/ml。搅拌下将依诺肝素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与依诺肝素的质量比为1∶5。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的依诺肝素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例45壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/依诺肝素自组装纳米粒的制备
实施例16的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶于水，依诺肝素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和依诺肝素浓度均为2mg/ml。搅拌下将依诺肝素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与依诺肝素的质量比为1∶2。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的依诺肝素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例46壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/依诺肝素自组装纳米粒的制备
实施例16的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶于水，依诺肝素溶于pH 2.0HCl溶液中并调节pH至8.0，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和依诺肝素浓度均为2mg/ml。搅拌下将依诺肝素溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与依诺肝素的质量比为5∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的依诺肝素经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例47壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒的制备
实施例2的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和pEGFP分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和pEGFP浓度均为2mg/ml。搅拌下将pEGFP溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与pEGFP的质量比为1∶1。室温搅拌60min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的pEGFP经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例48壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒的制备
实施例2的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和pEGFP分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和pEGFP浓度均为2mg/ml。搅拌下将pEGFP溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与pEGFP的质量比为20∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的pEGFP经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例49壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒的制备
实施例2的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和pEGFP分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和pEGFP浓度均为2mg/ml。搅拌状态下将pEGFP溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与pEGFP的质量比为30∶1。室温搅拌15min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的pEGFP经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例50壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/Smad2特异siRNA表达质粒自组装纳米粒的制备
实施例2的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒分别溶于pH6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒浓度均为2mg/ml。搅拌下将Smad2特异siRNA表达质粒溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与Smad2特异siRNA表达质粒的质量比为1∶1。室温搅拌60min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的Smad2特异siRNA表达质粒经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例51壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/Smad2特异siRNA表达质粒自组装纳米粒的制备
实施例2的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒分别溶于pH6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒浓度均为2mg/ml。搅拌下将Smad2特异siRNA表达质粒溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与Smad2特异siRNA表达质粒的质量比为20∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的Smad2特异siRNA表达质粒经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例52壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/Smad2特异siRNA表达质粒自组装纳米粒的制备
实施例2的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒分别溶于pH6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒浓度均为2mg/ml。搅拌下将Smad2特异siRNA表达质粒溶液滴加至壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与Smad2特异siRNA表达质粒的质量比为30∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物与荷负电的Smad2特异siRNA表达质粒经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例53壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒的制备
实施例15的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和pEGFP分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和pEGFP浓度均为2mg/ml。搅拌下将pEGFP溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与pEGFP的质量比为1∶1。室温搅拌60min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的pEGFP经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例54壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒的制备
实施例15的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和pEGFP分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和pEGFP浓度均为2mg/ml。搅拌下将pEGFP溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与pEGFP的质量比为20∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的pEGFP经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例55壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒的制备
实施例15的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和pEGFP分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和pEGFP浓度均为2mg/ml。搅拌下将pEGFP溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与pEGFP的质量比为30∶1。室温搅拌15min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的pEGFP经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例56壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/Smad2特异siRNA表达质粒自组装纳米粒的制备
实施例15的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒浓度均为2mg/ml。搅拌下将Smad2特异siRNA表达质粒溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与Smad2特异siRNA表达质粒的质量比为1∶1。室温搅拌60min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的Smad2特异siRNA表达质粒经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例57壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/Smad2特异siRNA表达质粒自组装纳米粒的制备
实施例15的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒浓度均为2mg/ml。搅拌下将Smad2特异siRNA表达质粒溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与Smad2特异siRNA表达质粒的质量比为20∶1。室温搅拌30min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的Smad2特异siRNA表达质粒经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例58壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物/Smad2特异siRNA表达质粒自组装纳米粒的制备
实施例15的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒分别溶于pH 6.0磷酸缓冲液(PBS，20mM)中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物和Smad2特异siRNA表达质粒浓度均为2mg/ml。搅拌下将Smad2特异siRNA表达质粒溶液滴加至壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物溶液中，壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与Smad2特异siRNA表达质粒的质量比为30∶1。室温搅拌15min，荷正电的壳聚糖季胺盐-巯基乙酸共聚物与荷负电的Smad2特异siRNA表达质粒经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
实施例59巯基化壳聚糖季胺盐游离巯基和二硫键测定
标准曲线制作：
精密称取半胱氨酸0.1780g，溶于100mL水中，取半胱氨酸溶液2.5mL，置25mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，制得1μmol/mL贮备液。分别精密量取上述贮备液0、12.5、25、50、100、150、250、500μL，加水稀释至0.5mL，配成浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0μmol/mL的溶液。分别按下述的方法显色，以相应的空白对照，测定450nm处的吸光度。以浓度(μmol/mL)对吸光度(A)进行线性回归。
游离巯基(-SH)含量测定：
分别取100μL、250μL、500μL TMC-Cys(实施例1-5，季胺化度为15％和30％)或TMC-TGA(实施例14-18，季胺化度为15％和30％)溶液(4mg/mL)，加入0.5M磷酸盐缓冲液(PBS，pH8.0)至总体积500μL。加入0.5mL以0.5M PBS(pH 8.0)配制的0.3mg/mL DTNB溶液，室温避光反应2h，U-3000紫外可见分光光度计(Hitachi，日本)测定溶液在450nm处的吸光度。根据上述标准曲线计算游离巯基(-SH)含量，结果以每克聚合物含μmol巯基表示。如表1所示，TMC-Cys和TMC-TGA上-SH的含量为100～300μmol/g。
二硫键(-S-S-)含量测定：
0.5mLTMC-Cys(实施例1-5，季胺化度为15％和30％)或TMC-TGA(实施例14-18，季胺化度为15％和30％)溶液(4mg/mL)中加入0.5mL 0.05M PBS(pH8.0)，室温放置30min，加0.6mL 3％NaBH4溶液，37℃水浴反应2h。加入0.5mL 1M HCl溶液和0.1mL丙酮，涡旋1min。加入0.2mL以0.5M PBS(pH 8.0)配制的0.3mg/mL DTNB溶液，混合均匀。加入1mL 1M PBS(pH 8.0)，混合均匀后测定450nm处的吸光度，根据标准曲线计算二硫键(-S-S-)含量，结果以每克聚合物含μmol二硫键表示。如表1所示，TMC-Cys和TMC-TGA上-S-S-的含量为200～400μmol/g。
表1TMC-Cys和TMC-TGA上-SH和-S-S-的含量
实施例60巯基化壳聚糖季胺盐的溶解性
TMC-Cys(实施例1-5，季胺化度为15％和30％)和TMC-TGA(实施例14-18，季胺化度为15％和30％)分别以水溶解，于600nm处测定透光率，当透光率低于90％时认为样品不溶解。连续加大样品浓度，确定其在中性条件下的溶解度；调节溶液pH，确定其可溶解pH范围；调节溶液离子强度，确定其可溶解离子强度范围。由表2可见，TMC-Cys和TMC-TGA的溶解度均高于100mg/mL，且在pH 2.0～10.0、离子强度10～300mM范围内可溶。
表2TMC-Cys和TMC-TGA的溶解度
实施例61巯基化壳聚糖/胰岛素自组装纳米粒粒径、Zeta电势和包封率粒径、Zeta电势：
Nicomp TM380/ZLS型电势及粒度测定仪测定TMC-Cys/胰岛素(实施例28、30、31，季胺化度分别为15％和30％)和TMC-TGA/胰岛素(实施例38-40，季胺化度分别为15％和30％)的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下：He-Ne激光(波长633nm)，散射角θ＝90°，测定温度23℃。Zeta电势测定参数：He-Ne激光(波长635nm)，散射角θ＝14°，测定温度23℃。
胰岛素包封率：
取TMC-Cys/胰岛素(实施例28、30、31，季胺化度分别为15％和30％)和TMC-TGA/胰岛素(实施例38-40，季胺化度分别为15％和30％)纳米粒溶液1mL，13,300rpm离心30min，取上清液500μL，Lowry法测定胰岛素含量。按下式计算胰岛素包封率：
包封率(％)＝(A-B)×100/A
其中A为胰岛素投料量(mg)；B为离心后上清液中的胰岛素含量(mg)。
如表3所示，TMC-Cys/胰岛素纳米粒和TMC-TGA/胰岛素纳米粒的粒径均为80～150nm，Zeta电势均为10～30mV，胰岛素的包封率均高于90％。
表3TMC-Cys/胰岛素纳米粒和TMC-TGA/胰岛素纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
实施例62壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒黏膜黏附力
称取5mg RhB溶于pH 4.5的HCl溶液中，加入2mg EDAC和2mg NHS，避光搅拌1h，加入含500mg TMC-Cys(实施例3，季胺化度分别为15％和30％)的水溶液，室温避光搅拌24h。反应液4℃反复超滤(MWCO 10,000Da)至滤液测不出荧光(Ex 560nm，Em 590nm)。冷冻干燥，即得RhB标记的TMC-Cys(RhB-TMC-Cys)。其与胰岛素制备自组装纳米粒的方法同实施例27。
取SD大鼠，实验前禁食12小时，可自由饮水，称重，按40mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠溶液(0.4％，w/v)麻醉大鼠，沿腹中线打开腹腔，取出10cm左右的回肠肠段，以生理盐水冲洗干净，两端用丝线结扎成封闭肠环，肠环中注入1mL RhB-TMC-Cys/胰岛素纳米粒。孵育2h后处死大鼠，剪开肠环收集肠液，以生理盐水冲洗、收集并与肠液合并，Cary Eclipse型荧光分光光度计(Varian，USA)测定游离的RhB-TMC-Cys含量。按下式计算纳米粒的黏附率(％)：
黏附率(％)＝(A-B)×100/A
其中A为纳米粒的RhB-TMC-Cys总量；B为肠液中游离聚合物的含量。
RhB-TMC-Cys(200，15)/胰岛素纳米粒和RhB-TMC-Cys(200，30)/胰岛素纳米粒的黏膜黏附力分别为(81±4)％和(85±15)％，而相应的RhB-TMC(200，15)/胰岛素纳米粒和RhB-TMC(200，30)/胰岛素纳米粒的黏膜黏附力则分别为(25±8)％和(29±11)％，表明巯基化修饰显著提高了TMC的黏膜黏附力。
实施例63壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒的小肠转运
取大鼠回肠约10cm，以Kreb’s-Ringer缓冲液清洗干净，两端用丝线结扎成封闭肠段，注入0.5mL TMC-Cys/胰岛素纳米粒溶液(实施例28，季胺化度分别为15％和30％)。肠段置于10mL氧气饱和的Kreb’s-Ringer缓冲液中，37℃、100rpm孵育。分别于30、60、90、120、180、240min时取样0.2mL，同时补加37℃Kreb’s-Ringer缓冲液0.2mL。HPLC测定样品中胰岛素含量。实验结束后，结扎线剪开肠环，纵向剖开，测量其表面积，计算胰岛素的表观渗透系数Papp。
TMC-Cys(200，15)/胰岛素纳米粒和TMC-Cys(200，30)/胰岛素纳米粒中胰岛素的Papp分别为(26±5)×10-7cm/s和(42±11)×10-7cm/s，而相应的TMC(200，15)/胰岛素纳米粒和TMC(200，30)/胰岛素纳米粒中胰岛素的Papp分别为(9±2)×10-7cm/s和(16±3)×10-7cm/s，表明巯基化修饰显著提高了TMC的促渗作用。
实施例64壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒在Caco-2细胞中的摄取
取生长旺盛的Caco-2细胞，以1×105cell/孔的密度接种到24孔板上，培养24h后培养基更换为0.01M pH 7.4的Tris缓冲液(含100mM葡萄糖、1.17mM CaCl2、1.03mMMgCl2)，每孔加入200μL TMC-Cys/FITC-胰岛素纳米粒(同实施例28，季胺化度分别为15％和30％)。培养4h后吸弃液体，以PBS洗涤三次，0.2％SDS裂解细胞，荧光分光光度计测定裂解液中FITC-胰岛素的含量(Ex 488nm，Em 530nm)。Lowry法测定裂解液中的蛋白质含量，细胞摄取量以每mg蛋白含μg FITC-胰岛素表示。
TMC-Cys(200，15)/胰岛素纳米粒和TMC-Cys(200，30)/胰岛素纳米粒在Caco-2细胞中摄取量按胰岛素计分别为(69±11)μg/mg和(82±8)μg/mg，而相应的TMC(200，15)/胰岛素纳米粒和TMC(200，30)/胰岛素纳米粒在Caco-2细胞中摄取量按胰岛素计分别为(20±4)μg/mg和(31±8)μg/mg，表明巯基化修饰显著提高了TMC/胰岛素的细胞摄取能力。
实施例65
壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒在Peyer’s结处的摄取
取SD大鼠，实验前禁食12小时，可自由饮水，称重，按40mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠溶液(0.4％，w/v)麻醉大鼠，沿腹中线打开腹腔，取出10cm左右的回肠肠段(含7-8个Peyer’s结)，以生理盐水冲洗干净，两端用丝线结扎成封闭肠环，肠环中注入1mLTMC-Cys/FITC-胰岛素纳米粒(同实施例28，季胺化度分别为15％和30％)。孵育2h后处死大鼠，剪开肠环，刮去黏液层，收集肠液，以生理盐水冲洗、剪下Peyer’s结，以RIPA裂解液匀浆，荧光分光光度计(Varian，USA)测定裂解液中FITC-胰岛素的含量，Lowry法测定裂解液的蛋白质含量。细胞摄取量以每mg蛋白含μg FITC-胰岛素表示。
TMC-Cys(200，15)/胰岛素纳米粒和TMC-Cys(200，30)/胰岛素纳米粒在Peyer’s结处的摄取量按胰岛素计分别为(4.1±1.1)μg/mg和(5.3±0.5)μg/mg，而相应的TMC(200，15)/胰岛素纳米粒和TMC(200，30)/胰岛素纳米粒在Peyer’s结处的摄取量按胰岛素计分别为(1.1±0.4)μg/mg和(0.9±0.2)μg/mg，表明巯基化修饰显著提高了TMC/胰岛素在Peyer’s结处的吸收。
实施例66壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/胰岛素自组装纳米粒在正常大鼠体内的的口服降血糖效果
TMC-Cys(200，30)/胰岛素自组装纳米粒(实施例28)溶液中加入蔗糖(为胰岛素质量的20倍)，冷冻干燥后装入小动物肠溶胶囊(长3mm，直径1.5mm)。雄性SD大鼠(180-220g)禁食16h，灌胃给予载药胶囊，给药剂量按胰岛素计为50IU/kg。分别于给药前和给药后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12h自尾静脉取血0.2mL，室温放置5min后12,000rpm离心4min，取血清20μL，以葡萄糖氧化酶试剂盒测定血糖值，以给药前血糖值为100％，计算降血糖效果。
如图3可见，TMC-Cys(200，30)/胰岛素自组装纳米粒在大鼠体内具有显著的口服降血糖效果，且其降血糖效果优于对应的TMC(200，30)/胰岛素自组装纳米粒。
实施例67巯基化壳聚糖季胺盐/pEGFP纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
粒径、Zeta电势：
Nicomp TM380/ZLS型电势及粒度测定仪测定TMC-Cys/pEGFP(实施例47-49，季胺化度分别为15％和30％)和TMC-TGA/pEGFP(实施例53-55，季胺化度分别为15％和30％)纳米粒的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下：He-Ne激光(波长633nm)，散射角θ＝90°，测定温度23℃。Zeta电势测定参数：He-Ne激光(波长635nm)，散射角θ＝14°，测定温度23℃。
pEGFP包封率：
取TMC-Cys/pEGFP(实施例47-49，季胺化度分别为15％和30％)和TMC-TGA/pEGFP(实施例53-55，季胺化度分别为15％和30％)纳米粒溶液1mL，13,300rpm离心30min，取上清液500μL，Hochest 33258试剂测定pEGFP含量。按下式计算pEGFP包封率：
包封率(％)＝(A-B)×100/A
其中A为pEGFP投料量(mg)；B为离心后上清液中的pEGFP含量(mg)。
如表4所示，TMC-Cys/pEGFP纳米粒和TMC-TGA/pEGFP纳米粒的粒径均为80～150nm，Zeta电势均为10～30mV，pEGFP的包封率均高于90％。
表4TMC-Cys/pEGFP纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
实施例68壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒的抗DNase
以pH 6.5PBS稀释TMC-Cys/pEGFP纳米粒(实施例47，季胺化度分别为15％和30％)，取10μL该稀释样品(含1μg pDNA)，加入2μl 2.5U/μL DnaseI溶液，37℃水浴2h，加入5μL 100mM EDTA，室温静置10min以终止酶反应。再加入10μL 5mg/mL肝素溶液，室温静置2h使复合物解聚。所得样品中pDNA的完整性经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。不经处理的pDNA作为对照。
如图4所示，TMC-Cys与pEGFP形成纳米复合物后可显著保护其不受核酶降解，且随着TMC-Cys/pEGFP质量比的增加，保护作用增强。阳性对照中pEGFP全部被核酶降解，因此观察不到电泳条带。
实施例69壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒的黏附力
取TMC-Cys/pEGFP纳米粒(实施例47，季胺化度分别为15％和30％)400μL，加入1mL200μg/mL黏蛋白溶液(pH 7.4)，37℃、100rpm孵育8h。12,000rpm离心10min，上清液以Schiff/高碘酸试剂测定黏蛋白含量。按下式计算纳米粒黏附力(％)：
黏附率(％)＝(A-B)×100/A
其中A为黏蛋白的总量(μg)；B为上清液中黏蛋白的含量(μg)。
TMC-Cys(100，15)/pEGFP纳米粒和TMC-Cys(100，30)/pEGFP纳米粒的黏附率分别为(86±14)％和(90±14)％，而相应的TMC(100，15)/pEGFP纳米粒和TMC(100，30)/pEGFP纳米粒的黏附率分别为(36±7)％和(46±9)％，表明巯基化修饰显著提高了TMC/pEGFP纳米粒的黏附力。
实施例70壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒在HEK293细胞中的摄取
取生长旺盛的HEK 293细胞，以1×105cell/孔的密度接种到24孔板上，培养24h后更换无血清DMEM培养基，按每孔2μg FITC-pDNA加入TMC-Cys/pEGFP纳米粒(实施例47，季胺化度分别为15％和30％)。培养6h后吸弃培养基，以PBS洗涤两次，胰酶消化，收集细胞，3000rpm离心5min，吸弃上清，细胞经PBS吹打均匀后于流式细胞仪上检测纳米复合物的摄取效率。
TMC-Cys(100，15)/pEGFP纳米粒和TMC-Cys(100，30)/pEGFP纳米粒在HEK 293细胞中摄取效率分别为(84±12)％和(79±16)％，而相应的TMC(100，15)/pEGFP纳米粒和TMC(100，30)/pEGFP纳米粒在HEK 293细胞中摄取效率分别为(43±8)％和(48±12)％，表明巯基化修饰显著提高了TMC/pEGFP的细胞摄取能力。
实施例71壳聚糖季胺盐-半胱氨酸共聚物/pEGFP自组装纳米粒转染HEK293细胞
取生长旺盛的HEK 293细胞，以1×105cell/孔的密度接种到24孔板上，培养24h后更换无血清DMEM培养基，按每孔2μg pDNA加入TMC-Cys/pEGFP纳米粒(实施例47，季胺化度分别为15％和30％)。培养8h后更换新鲜DMEM完全培养基(10％胎牛血清)，继续培养40h小时，胰酶消化收集细胞，于流式细胞仪上测定转染效率。以Lipofectamine2000(Lipo)处理的细胞为阳性对照，不经处理的细胞为阴性对照。
TMC-Cys(100，15)/pEGFP纳米粒和TMC-Cys(100，30)/pEGFP纳米粒在HEK 293细胞中转染效率分别为(41±6)％和(38±11)％，而相应的TMC(100，15)/pEGFP纳米粒和TMC(100，30)/pEGFP纳米粒在HEK 293细胞中摄取效率分别为(27±3)％和(28±10)％。阳性对照的转染效率为(35±7)％。上述结果表明巯基化修饰显著提高了TMC/pEGFP的细胞转染效率，且TMC-Cys/pEGFP纳米粒的转染效率与常用的转染试剂Lipofectamine2000相近。
Claims (23)
1.一种巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述的自组装纳米粒由荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐和荷负电的蛋白质多肽药物或核酸药物经聚电解质作用生成，其中，所述的巯基化壳聚糖季胺盐为壳聚糖的氨基依次经季胺化修饰和巯基化修饰所得的共聚物，其中壳聚糖重均分子量为30～1,000kDa，季胺化度为15～80％，摩尔百分数，巯基化修饰物为半胱氨酸或巯基乙酸，所述的巯基化壳聚糖季胺盐游离巯基修饰率为40～400μmol/g，二硫键修饰率为60～600μmol/g。
2.按权利要求1所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，其中所述的巯基化壳聚糖季胺盐，按如下步骤制备：
(1)合成壳聚糖季胺盐，反应时间为45～240min；所得壳聚糖季胺盐以Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；其中反应45、120、180和240min所得壳聚糖季胺盐的季胺化度分别为15％、30％、60％和80％；
(2)壳聚糖季胺盐和巯基化修饰物溶于水中，壳聚糖季胺盐和巯基化修饰物的质量比为32∶1～1∶10，加入终浓度分别为50～500mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH至3.0～5.0，室温反应2～8h，透析，冷冻干燥，得巯基化壳聚糖季胺盐。
3.根据权利要求2所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述的巯基化壳聚糖季胺盐制备方法步骤(2)中所述的壳聚糖季胺盐和巯基化修饰物的质量比为1∶4。
4.根据权利要求2所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述的巯基化壳聚糖季胺盐制备方法步骤(2)中所述的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度分别为300mM。
5.根据权利要求2所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述的巯基化壳聚糖季胺盐制备方法步骤(2)中所述的反应时间为5h。
6.根据权利要求1所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述的巯基化壳聚糖季胺盐/蛋白质多肽药物自组装纳米粒由荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐和荷负电的蛋白质多肽药物组成。
7.如权利要求6所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述蛋白质多肽药物选自胰岛素、降钙素、干扰素、抗利尿激素、奥曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、依诺肝素、红细胞生长素、血红蛋白、白蛋白、细胞色素、各种生长因子白介素、集落刺激因子、抗原或抗体中的一种。
8.根据权利要求1所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述巯基化壳聚糖季胺盐/核酸药物自组装纳米粒由荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐和荷负电的核酸药物组成。
9.如权利要求8所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述的核酸药物选自DNA、RNA、低聚核苷酸或多核苷酸中的一种。
10.如权利要求9所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述的DNA为质粒DNA。
11.如权利要求10所述的巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述的质粒DNA可以表达蛋白质或转录成小分子干扰RNA。
12.如权利要求6或8所述巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的平均粒径为50～500nm。
13.如权利要求6或8所述巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的平均粒径为80～150nm。
14.如权利要求6或8所述巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述纳米粒Zeta电势为-20～50mV。
15.如权利要求6或8所述巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述纳米粒Zeta电势为10～30mV。
16.如权利要求6或8所述巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的包封率为20～95％。
17.如权利要求6或8所述巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的包封率为80～90％。
18.一种制备如权利要求6所述巯基化壳聚糖季胺盐/蛋白质多肽药物自组装纳米粒的方法，其特征在于按如下步骤制备：
(1)巯基化壳聚糖季胺盐溶于水，蛋白质多肽药物溶于酸性溶液中并调节pH至7.0～9.0；
(2)搅拌下将蛋白质多肽药物溶液滴加至巯基化壳聚糖季胺盐溶液中，巯基化壳聚糖季胺盐与蛋白质多肽药物的质量比为1∶5～5∶1；
(3)室温搅拌15～60min，荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐与荷负电的蛋白质、多肽药物经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的巯基化壳聚糖季胺盐与蛋白质多肽药物的质量比为1∶2～2∶1。
20.一种制备如权利要求8所述巯基化壳聚糖季胺盐/核酸药物自组装纳米粒的方法，其特征在于按如下步骤制备：
(1)巯基化壳聚糖季胺盐和和核酸药物分别溶于20mM pH 6.0磷酸缓冲液中；
(2)搅拌下将核酸药物溶液滴加至巯基化壳聚糖季胺盐溶液中，巯基化壳聚糖季胺盐与核酸药物的质量比为1∶1～30∶1；
(3)室温搅拌15～60min，荷正电的巯基化壳聚糖季胺盐与荷负电的核酸药物经聚电解质作用自组装形成纳米粒。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的巯基化壳聚糖季胺盐与核酸药物的质量比为15∶1～25∶1。
22.权利要求6所述的巯基化壳聚糖季胺盐/蛋白质多肽药物自组装纳米粒在制备口服给药系统中的应用。
23.权利要求8所述的巯基化壳聚糖季胺盐/核酸药物自组装纳米粒在制备基因传释系统中的应用。
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