CN111481673B - 一种多活性组分制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂与药物递送等领域，特别涉及多活性组分体系的制备方法。所述体系为无机离子交联剂与多酚类有机配体形成的金属涂层（MPN），难溶性药物颗粒与大分子药物如免疫佐剂、免疫增强剂、酶、基因、蛋白质、多肽等；其中MPN包裹于药物颗粒表面，形成MPN‑药物颗粒（MPN‑NPs），大分子药物复合于MPN‑NPs表面，形成多组分体系MPN‑NPplex。该制备方法工艺简单，制备过程易控，制备的体系质量稳定。

Description

一种多活性组分制剂的制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种多活性组分制剂的制备与应用。
背景技术
生物大分子是目前药物递送领域最受关注的对象之一，但是由于较大的分子量以及复杂的生物环境，实现其胞内递送极具挑战。传统的大分子递送载体如聚合物胶束和无机纳米材料等，通过内吞作用进入胞浆后于溶酶体结合。由于溶酶体内大量的水解酶、酯酶且pH值低，生物大分子会被快速降解，但其溶酶体的逃逸效率依然很低。同时，传统的大分子递送载体具有生物相容性差、易引发免疫反应、生物清除过快的缺点，使得应用受到限制。另外大分子递送作用效果受限，临床上一般采用小分子药物和大分子联合用药，具有广阔的应用前景。
纳米载体能同时封装多种药物并统一药物动力学，然而，传统的纳米粒存在载药量低、生物相容性低、批次间差异大等缺点。用传统方法进行共递送，两药的载药量加和亦不超过10％，使药效大打折扣。寻找高载药量的纳米载体成为本领域技术研究热点和难点。
金属多酚网络(MPN)是由无机金属离子与多酚类化合物交联形成的复合物。由于MPN与疏水界面的高亲和力，MPN能稳定难溶药物的纳米晶，防止聚集，形成金属多酚网络-药物纳米晶复合物(MPN-NPs)。
由于MPN表面具有大量的电荷，MPN-NPs能与大分子药物通过化学结合形成一种小分子药物/大分子药物的组合体系，实现小分子与大分子药物胞内的有效共递送，根据不同的作用机制实现协同作用提高治疗效果。
本发明以MPN-NPs为载体，制备MPN-NPs/大分子药物复合物体系MPN-NPplex，以实现小分子药物/大分子药物的联合递送。
发明内容
本发明的目的之一在于构建一种多活性组分制剂。本发明将金属离子交联剂、多酚类有机配体与难溶性小分子药物作用共同形成MPN颗粒(MPN-NPs)并作为大分子药物递送载体。
本发明的目的之二是提供MPN纳米粒的制备方法，该制备方法工艺简单，制备过程易控，制备的体系质量稳定。
本发明的目的之三是提供MPN颗粒药物递送体系在大分子递送系统中的应用。
本发明提供以下技术方案：
以无机交联剂氯化铁和多酚类有机配体单宁酸为例，载入小分子难溶药物形成MPN纳米粒。
一种多活性组分制剂的制备方法，其特征在于：无机离子和多酚类有机配体制备的金属多酚网络MPN与小分子难溶药物先形成金属多酚网络-药物纳米晶复合物MPN-NPs，经由化学键合作用，MPN-NPs与大分子药物形成复合物。
所述的无机离子包括AgI、AuI、BaII、CaII、CdII、CuII、FeII、MnII、MgII、MoII、ZnII、PtII、AuIII、AlIII、CeIII、CoIII、CrIII、EuIII、EuIII、FeIII、GdIII、NiIII、WIII、VIII或ZrIV。
所述的多酚类有机配体包括单宁酸、醅单宁、鞣花单宁、多巴胺、氯原酸、花青素、姜黄素、茶黄素、茶红素、柠檬黄素、花色苷、槲皮素、矢车菊素、山奈素、堪非醇、杨梅酮、异鼠李亭、芸香苷、橙皮素、柚皮素、圣草酚、毛地黄黄酮、芹菜素、花旗松素、白黎芦醇、褐藻多酚、聚黄烷醇多酚、去甲肾上腺素、茶多酚、儿茶酚、儿茶酚胺、儿茶素、儿茶酸、表儿茶素、表儿茶酚、表焙儿茶素、表焙儿茶素没食子酸酯、没食子酚儿茶素、表没食子酚儿茶素、鞣花酸、没食子酸、双没食子酸、没食子酸盐、没食子酸丙酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、单没食子酰基-D-葡萄糖、二没食子酰基-D-葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖、四没食子酰基葡萄糖、五没食子酰基葡萄糖、焦棓酚、桑色素或羟基氢醌。
所述的小分子难溶药物包括非诺贝特、诺西肽、阿霉素、阿托伐他汀、辛伐他丁、冬凌草甲素、类黄酮、多西紫杉醇、吲哚美辛、两性霉素B、穿心莲内酯、紫杉醇、依鲁替尼、尼美舒利或萘普生。
大分子药物包括免疫佐剂、免疫增强剂、酶、基因、蛋白和多肽；
其中所述免疫佐剂包括铝盐佐剂、油乳佐剂、弗氏佐剂、白细胞介素-2、干扰素、多糖佐剂、黄酮佐剂、皂甙佐剂、蜂胶佐剂、免疫刺激复合物佐剂或CpGODN佐剂；
免疫增强剂包括微生物来源的药物、人或动物免疫系统产物、化学合成药物、真菌多糖；
基因包括DNA、反义寡核苷酸、mRNA、小干扰RNA、小发夹RNA或共轭寡核苷酸；
多肽包括：细胞穿膜肽CPP、靶向肽CSKSSDYQC、胸腺五肽或索马鲁肽。
所述的方法，其特征在于：按如下步骤实现：
1)将无机盐和多酚类物质分别溶于纯化水中，作为水相备用；
2)将小分子药物溶解于丙酮、乙醇或其他有机溶剂中，作为有机相备用；
3)在搅拌条件下，将有机相快速加入到蒸馏水中，冰浴条件下探头超声，随后加入有机配体和无机交联剂的水相，超声至结束；冰浴条件下探头超声，加入有机相，再快速加入水相有机配体及无机离子交联剂，超声一定时间后结束；
4)通过超滤除去游离的有机配体和无机交联剂，得到纯化的MPN纳米粒；
5)MPN纳米粒与大分子药物质量比为1:100-100:1；
6)MPN纳米粒与大分子药物按质量比等体积混合，室温孵育半小时后，得到复合物。
所述的方法，其特征在于步骤3)中超声条件为：250W功率强度处理10min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
所述的方法，其特征在于：
步骤3)所述无机离子和多酚类有机配体的质量比为50:1～1:50
步骤4)获得MPN纳米粒的粒径为10-500nm，电位为-50～-10mv。
举例来说：
(1)称取化合物溶解于有机溶剂中作为有机相；量取一定量蒸馏水置于离心管中作为水相；制备不同浓度的无机交联剂氯化铁溶液和单宁溶液备用；
(2)在冰浴条件下，将所述的有机相和水相迅速混合，搅拌均匀后置于探头超声中，加入一定体积的无机交联剂氯化铁溶液和单宁溶液，以250W功率强度处理10min，超声模式开2s，关2s，形成形成MPN纳米晶溶液。制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分(MPN)。
(3)MPN纳米粒与大分子药物复合物MPN-NPplex的形成
在超净台中，用无菌无酶水将免疫佐剂稀释到不同浓度，使MPN与大分子的质量比为1:1～320:1；将制得的MPN纳米晶和大分子药物于1分钟内在温和涡旋的条件下等体积混合，室温孵育30分钟后，二者通过静电作用力结合，制得纳米晶与大分子复合物。
步骤(1)化合物为极性小的化合物，如紫杉醇、阿魏酸、阿托伐他丁、穿心莲、辛伐他丁或法莫替丁；所述的有机溶剂为乙醇、丙酮
步骤(2)氯化铁和单宁溶液的浓度分别为1mg/mL和20mg/mL
本发明所用的原料或者试剂，均市售可得。
采用动态光散射纳米粒径仪，透射电镜等对MPN-NPs和MPN-NPplex进行表征。
采用琼脂糖凝胶电泳对MPN-NPs与大分子复合物的形成进行验证。
本发明的MPN纳米晶与大分子复合物具有制备工艺简单，安全性高等特点。
以紫杉醇为例，进行处方筛选：
1、超声功率的影响
称取4mg紫杉醇溶解于0.25mL乙醇中作为有机相，制备浓度分别为1mg/ml和20mg/ml的FeCl3·6H2O和单宁溶液备用，量取9.3mL蒸馏水置于10mL离心管中作为水相。
注射器取0.25mLPTX-乙醇溶液在搅拌条件下加入预先冰浴的9.3mL蒸馏水中，得带蓝色乳光的混悬液，然后再超声条件下用注射器分别加入0.2mL单宁溶液和0.5mLFeCl3·6H2O溶液，溶液转为蓝色，继续超声，设定超声功率为100w，150w，200w，250w，300W，400W时间均为10min。超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实验结果见图1，超声功率对紫杉醇纳米晶(PTX-NCs)的粒径和PDI的影响。综上，确定超声功率250W。
2、超声时间的影响
称取4mg紫杉醇溶解于0.25mL乙醇中作为有机相，制备浓度分别为1mg/ml和20mg/ml的FeCl3·6H2O和单宁溶液备用，量取9.3mL蒸馏水置于10mL离心管中作为水相。
注射器取0.25mLPTX-乙醇溶液在搅拌条件下加入预先冰浴的9.3mL蒸馏水中，得带蓝色乳光的混悬液，然后再超声条件下用注射器分别加入0.5mL单宁溶液和0.25mLFeCl3·6H2O溶液，溶液转为蓝色，继续超声，设定超声功率为250w，超声时间为5min，10min，15min。超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实验结果见图2，超声时间对紫杉醇纳米晶(PTX-NCs)的粒径和PDI的影响。综上，确认超声时间为10min。
3、PTX载药量筛选
投药顺序以及制备方法同上，对PTX载药量进行筛选。设定超声功率为250w，超声时间为10min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实验结果见图3，PTX载药量对紫杉醇纳米晶(PTX-NCs)的粒径和PDI的影响。综上，确认PTX载药量为10mg。
4、FeCl3·6H2O与单宁酸质量比筛选
加入方法及顺序同上，单宁酸与FeCl3·6H2O质量比为16:1，8:1，1:1，1:8，1:16。设定超声功率为250w，超声时间为10min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实验结果见图4，FeCl3·6H2O与单宁酸质量比对紫杉醇纳米晶(PTX-NCs)的粒径和PDI的影响。综上，单宁酸与FeCl3·6H2O质量比确定为8:1。
创新点：
本发明巧妙的利用了难溶药物和多酚类与金属离子结合形成的螯合物共沉淀形成纳米晶这一原理，将金属离子与多酚类的比例固定，经过特色工艺(特定的超声条件)，形成纳米晶。实验表明只有特定比例和工艺环境下才能形成纳米晶，其他比例形成螯合物会自发聚集，产生大量沉淀，无法获得纳米晶，即不会形成MPN纳米晶溶液。
有益效果
1、本发明首次采用单宁与交联剂氯化铁溶液相互作用形成网状结构，装载难溶药物，实现难溶小分子药物和生物大分子的共递送；
2、该体系特殊的入胞途径，绕过溶酶体，极大提高递送效率。
附图说明
图1为超声功率对紫杉醇纳米晶(PTX-NCs)的粒径和PDI的影响；
图2为超声时间对紫杉醇纳米晶(PTX-NCs)的粒径和PDI的影响；
图3为PTX载药量对紫杉醇纳米晶(PTX-NCs)的粒径和PDI的影响；
图4为FeCl3·6H2O与单宁酸质量比对紫杉醇纳米晶(PTX-NCs)的粒径的影响；
图5为本发明实施例1中紫杉醇纳米晶(A)及实施例2获得紫杉醇纳米晶/基因复合物(B)的粒径分布图；
图6为本发明实施例2中紫杉醇纳米晶/基因复合物的琼脂糖凝胶电泳图；
图7为本发明实施例2中紫杉醇纳米晶/基因复合物的TEM图；
图8为本发明实施例8中紫杉醇纳米晶的粒径分布图；
图9为本发明实施例8中紫杉醇纳米晶的电位分布图。
具体实施方式
实施例1采用反溶剂沉淀法制备紫杉醇纳米晶(PTX-NCs)。
制备工艺：
称取10mg紫杉醇溶解于0.375mL丙酮中作为有机相，制备浓度分别为1mg/ml和20mg/ml的FeCl3·6H2O和单宁溶液备用，量取9.3mL蒸馏水置于10mL离心管中作为水相。
在冰浴条件下，将有机相和水相迅速混合，搅拌均匀后置于探头超声中，加入0.5mLFeCl3·6H2O溶液和0.2mL单宁溶液，以250W功率强度处理10min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实验结果见图5A，紫杉醇纳米晶的粒径为160nm。
实施例2:
琼脂糖凝胶电泳验紫杉醇纳米晶/基因复合物的形成:
电泳缓冲液的配制:称取Tris碱54g，硼酸27.5g，量取0.5M乙二胺四乙酸二钠(pH8.0)20mL，用蒸馏水定容至1L，配置成5×TBE缓冲液；取该缓冲液200mL，定容至1L配置成1×TBE缓冲液；称取1.8g的琼脂糖，加入1×TBE缓冲液150mL，微波加热溶解后倒入电泳槽内，室温条件下凝固，配制成0.8％的琼脂糖凝胶。
基因PolyI:C(PolyI:C，polyinosine-polycytidylicacid，是一种与病毒感染相关的双链RNA(dsRNA)，厂家：sigma货号P0913)用无菌无酶水稀释至10μg/mL，将实施例1中的证紫杉醇纳米晶用无菌水分别稀释至含阳离子化β-乳球蛋白浓度分别为80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL；取稀释的纳米粒和基因各6μL，在温和涡旋的条件下混合，室温孵育30分钟后，每个样品中加入3μLGe1Red后混匀。将样品上样后，在110V条件下电泳15分钟，用凝胶成像仪进行成像。
结果：
见图5B和图7，紫杉醇纳米晶/基因复合物的粒径为273nm，带正电荷的纳米粒通过静电作用与带负电荷的基因PolyI:C结合，与图5A中的纳米粒相比，粒径在一定程度上增加。
见图6，紫杉醇纳米晶与基因PolyI:C在质量比2：1～8:1范围内形成纳米晶/基因复合物，没有明显的游离基因PolyI:C的条带出现，证明基因PolyI:C完全压缩在纳米晶的表面。
实施例3：采用反溶剂沉淀法制备阿魏酸纳米晶(AW-Nps)。
制备工艺：
称取10mg阿魏酸溶解于0.25mL乙醇中作为有机相，制备浓度分别为1mg/ml和20mg/ml的FeCl3·6H2O和单宁溶液备用，量取9.3mL蒸馏水置于10mL玻璃烧杯中作为水相。
在冰浴条件下，将有机相和水置于探头超声中迅速混合，加入0.5mLFeCl3·6H2O溶液和0.2mL单宁酸溶液，以250W功率强度处理10min，超声模式开2s，关2s，形成MPN纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实施例4：采用反溶剂沉淀法制备阿托伐他丁钙纳米晶(AT-Nps)。
制备工艺：
称取10mg阿托伐他丁钙溶解于0.4mL乙醇中作为有机相，制备浓度分别为1mg/ml和20mg/ml的FeCl3·6H2O和单宁溶液备用，量取9.3mL蒸馏水置于10mL玻璃烧杯中作为水相。
在冰浴条件下，将有机相和水相迅速混合，搅拌均匀后置于探头超声中，加入0.5mL FeCl3·6H2O溶液和0.2mL单宁酸溶液，以250W功率强度处理10min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实施例5：采用反溶剂沉淀法制备纳米晶(AND-Nps)。
制备工艺：
称取1mg穿心莲内酯溶解于0.25mL乙醇中作为有机相，制备浓度分别为1mg/ml和20mg/ml的FeCl3·6H2O和单宁酸溶液备用，量取9.3mL蒸馏水置于10mL玻璃烧杯中作为水相。
在冰浴条件下，将有机相和水相迅速混合，搅拌均匀后置于探头超声中，加入0.5mL FeCl3·6H2O溶液和0.2mL单宁酸溶液，以250W功率强度处理10min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实施例6采用反溶剂沉淀法制备辛伐他丁纳米晶(SIM-Nps)。
制备工艺：
称取10mg辛伐他丁溶解于0.25mL乙醇中作为有机相，制备浓度分别为1mg/ml和20mg/ml的FeCl3·6H2O和单宁酸溶液备用，量取9.3mL蒸馏水置于10mL玻璃烧杯中作为水相。
在冰浴条件下，将有机相和水相迅速混合，搅拌均匀后置于探头超声中，加入0.5mL FeCl3·6H2O溶液和0.2mL单宁酸溶液，以250W功率强度处理10min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实施例7：采用反溶剂沉淀法制备法莫替丁纳米晶(FA-Nps)
制备工艺：
称取5mg法莫替丁溶解于0.125mL冰醋酸中作为有机相，制备浓度分别为1mg/ml和20mg/ml的FeCl3·6H2O和单宁酸溶液备用，量取9.3mL蒸馏水置于10mL玻璃烧杯中作为水相。
在冰浴条件下，将有机相和水相迅速混合，搅拌均匀后置于探头超声中，加入0.5mL FeCl3·6H2O溶液和0.2mL单宁溶液，以250W功率强度处理5min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分。
实施例8：采用反溶剂沉淀法制备紫杉醇纳米晶(PTX-Nps)
制备工艺：
称取10mg紫杉醇溶解于0.25mL乙醇中作为有机相，制备浓度分别为1mg/ml和20mg/ml的FeCl3·6H2O和单宁酸溶液备用，量取9.3mL蒸馏水置于10mL玻璃烧杯中作为水相。
在冰浴条件下，将有机相和水相迅速混合，搅拌均匀后置于探头超声中，加入0.5mL FeCl3·6H2O溶液和0.2mL单宁酸溶液，以250W功率强度处理10min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液。
制备完毕后，使用Ultra-410kDa超滤管，超滤去除游离的药物和稳定剂，收集超滤管上层纳米晶部分，结果见图8和图9。

Claims (5)

1.一种多活性组分制剂的制备方法，其特征在于：无机离子交联剂和多酚类有机配体制备的金属多酚网络MPN与小分子难溶药物先形成金属多酚网络-药物纳米晶复合物MPN-NPs，经由静电吸引作用，MPN-NPs与大分子药物形成复合物；
按下步骤制备获得：
1） 将无机盐和多酚类有机配体分别溶于纯化水中，作为水相备用；
2） 将小分子药物溶解于丙酮、乙醇或其他有机溶剂中，作为有机相备用；
3） 在搅拌条件下，将有机相快速加入到蒸馏水中，冰浴条件下探头超声，随后加入有机配体和无机交联剂的水相，超声至结束；冰浴条件下探头超声，加入有机相，再快速加入水相有机配体及无机离子交联剂，超声一定时间后结束；
4） 通过超滤除去游离的有机配体和无机离子交联剂，得到纯化的MPN纳米粒；
5） MPN纳米粒与大分子药物质量比为1:100-100:1；
6） MPN纳米粒与大分子药物按质量比等体积混合，室温孵育半小时后，得到复合物；
其中 步骤3）中超声条件为：250W功率强度处理10 min，超声模式开2s，关2s，形成纳米晶溶液；
步骤3）所述无机离子和多酚类有机配体的质量比为50:1～1:50；
步骤4）获得MPN纳米粒的粒径为10-500 nm，电位为-50～-10mv。
2.根据权利要求1的所述方法，其特征在于：所述的无机离子包括AgI、AuI、BaII、CaII、CdII、CuII、FeII、MnII、MgII、MoII、ZnII、PtII、AuIII、AlIII、CeIII 、CoIII、CrIII、EuIII、FeIII、GdIII、NiIII、WIII、VIII 或ZrIV。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的多酚类有机配体包括单宁酸、醅单宁、鞣花单宁、多巴胺、氯原酸、花青素、姜黄素、茶黄素、茶红素、柠檬黄素、花色苷、槲皮素、矢车菊素、山奈素、堪非醇、杨梅酮、异鼠李亭、芸香苷、橙皮素、柚皮素、圣草酚、毛地黄黄酮、芹菜素、花旗松素、白黎芦醇、褐藻多酚、聚黄烷醇多酚、去甲肾上腺素、茶多酚、儿茶酚、儿茶酚胺、儿茶素、儿茶酸、表儿茶素、表儿茶酚、表焙儿茶素、表焙儿茶素没食子酸酯、没食子酚儿茶素、表没食子酚儿茶素、鞣花酸、没食子酸、双没食子酸、没食子酸盐、没食子酸丙酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、单没食子酰基-D-葡萄糖、二没食子酰基-D-葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖、四没食子酰基葡萄糖、五没食子酰基葡萄糖、焦棓酚、桑色素或羟基氢醌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的小分子难溶药物包括非诺贝特、诺西肽、阿霉素、阿托伐他汀、辛伐他丁、冬凌草甲素、类黄酮、多西紫杉醇、吲哚美辛、两性霉素B、穿心莲内酯、紫杉醇、依鲁替尼、尼美舒利或萘普生。
5.根据权利要求1所述的方法，大分子药物包括免疫佐剂、免疫增强剂、酶、基因、蛋白和多肽；
其中所述免疫佐剂包括铝盐佐剂、油乳佐剂、弗氏佐剂、白细胞介素-2、干扰素、多糖佐剂、黄酮佐剂、皂甙佐剂、蜂胶佐剂、免疫刺激复合物佐剂或CpG ODN佐剂；
免疫增强剂包括微生物来源的药物、人或动物免疫系统产物、化学合成药物、真菌多糖；基因包括DNA、反义寡核苷酸、mRNA、小干扰RNA、小发夹RNA或共轭寡核苷酸；多肽包括：细胞穿膜肽CPP、靶向肽CSKSSDYQC、胸腺五肽或索马鲁肽。
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