CN105142619A - 药剂的靶向颊内递送 - Google Patents

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Abstract

已研发出一种用于将药剂局部和全身递送到靶向口腔位置，如口腔癌细胞的递送装置。调配物包括如壳聚糖的粘膜粘附聚合基质，其含有一种或多种治疗剂和/或诊断剂、味道掩蔽剂、渗透增强剂，待递送治疗剂或诊断剂以及亲水性聚合涂层，如聚乙二醇(“PEG”)。

Description

药剂的靶向颊内递送
技术领域
本发明大体上属于用于将药剂靶向递送到口腔粘膜的调配物的领域，例如递送用于治疗口腔癌的抗肿瘤药剂。
相关申请案的交叉参考
本申请案要求2013年2月21日提交的U.S.S.N.61/767,589的优先权。
关于联邦资助研究的声明
美国政府对本发明无权利。
背景技术
根据口腔癌(OC)基金会，仅是今年便将有约40,000美国人被诊断患有口腔和咽部癌症，导致8,000人死亡，每天24小时大致每小时杀死一个人。所述问题在全球更加显著；每年超过640,000个新病例。尽管许多癌症的发病率正在不断减少，但OC的发病率已连续增长五年。目前，顺铂(cisplatin)、顺二氯二氨铂(II)(CIS)是最常见抗肿瘤OC治疗剂。
全身药剂递送问题是众所周知的。归因于较高剂量需求的副作用和对身体不需要治疗的区域的无意治疗，尤其针对癌症在药剂几乎与疾病一样有害的情况下，产生对药剂的局部投与的强烈需求。
这些OC患者中仅一半将在确诊后存活五年。在某些国家，如斯里兰卡、印度、巴基斯坦和孟加拉国，OC是最常见的癌症。在印度部分地区，其表示超过所有癌症的50％。仅在美国，OC发病率在2002与2007之间增长了11％。到2020年，预测全世界每年发病率增长到超过840,000，升高了30％，并且每年死亡率增长到几乎480,000，大致提高了37％。
根据OC基金会，持续超过三周的任何口腔病变都需要由临床医师进行检查并且治疗。患者无法得到安全、有效并且适宜的治疗。如果化疗药物毒性显著降低，那么临床医师将更可能尽早地以较低剂量治疗患者。
将治疗剂局部递送到口腔极其困难。粘膜形成粘附的强大屏障并且极少物质可以穿透这一粘性、光滑材料到达下部口腔上皮细胞，更少物质与细胞保持连接持续足够长的时间以递送有效量的治疗剂。
如赖(Lai)等人,先进药物递送评论(AdvAgentDelivRev.),27:61(2):158-171(2009)所报道，粘液是粘弹性凝胶层，其保护原本暴露于外部环境中的组织。粘液主要由杯形细胞和粘膜下腺分泌的交联并且缠结的粘蛋白纤维构成。粘蛋白是大分子，通常通过诸多粘蛋白单体的连接形成0.5-40MDa的尺寸，每个约0.3-0.5MDa，并且涂布有一系列复杂并高度不同的蛋白多糖。至少二十个粘蛋白类型糖蛋白已分到MUC基因家族，其中若干粘蛋白类型在每个粘膜表面表达。粘蛋白一般可以分成两个家族：长度范围在100nm与500nm之间的细胞结合粘蛋白，其含有跨膜结构域，以及分泌粘蛋白，其长度长达几微米。个别粘蛋白纤维直径大致是3-10nm，如生物化学和电子显微研究所测定。它们是高度柔性分子，持续长度为大致15nm。除特定疾病病况(如COPD和CF)外，对于子宫颈、鼻部和肺脏粘液来说，粘蛋白含量范围在2重量％与5重量％之间，糖基化寡醣代表粘蛋白质量的40％-80％。大多数粘液类型(即，肺脏、胃、子宫颈阴道)中的水含量通常在90％-98％范围内。除粘蛋白外，粘液凝胶还载有细胞、细菌、脂质、盐、蛋白质、大分子以及细胞碎片。粘液pH可以取决于粘膜表面而大大变化，其中强酸性环境能够聚集粘蛋白纤维并且大大增加粘液粘弹性。肺脏和鼻部粘液一般是pH中性的，并且眼睛粘液是略碱性，pH约7.8。相比之下，胃粘液暴露于广泛范围的pH下：在相同粘液横截面内存在较大pH梯度，pH从内腔约1-2的pH上升到上皮表面处约7的pH。阴道分泌物通常展现在3.5到4.5范围内的pH，这归因于在厌氧条件下乳杆菌所产生的乳酸的酸化。除生物化学差异外，粘液覆盖层的厚度还因不同粘膜表面而变化。鼻腔具有有限厚度的粘液层，相比于其它粘膜表面其是容易接近并且视为高度可渗透的。在人类GI道中，粘液层在胃和结肠中最厚，但展现显著变化。
粘液连续分泌，接着被排出和丢弃或消化和回收。其寿命较短，常常在几分钟到几小时来度量。对各种粘膜表面处的粘液层厚度和清除时间的理解对于研发经设计以克服粘膜清除机制的粒子来说是重要的，因为其必须以比粘液更新和清除显著更快的速率穿透粘液以克服障碍。关于口腔粘膜所知甚少。
在口腔粘膜腔内递送药剂被分成三种类别：(i)舌下递送，用于全身药剂递送通过粘膜里层，口腔底部，(ii)颊内递送，其通过颊部里层(颊内粘膜)用于药剂递送，以及(iii)局部口腔递送，其将药剂递送到口腔中。
递送到口腔组织中是困难的，因为未直接施加到上皮细胞中的治疗剂经吞咽而损失。仅接触面积可以形成用于药剂到达口腔上皮细胞的有效导槽。味道也是药剂递送到这一区域的主要挑战。药剂的味道掩蔽是设计递送手段时的重要因素。相较于其它粘膜(如肠内部)，递送治疗剂通过口腔粘膜的另一个主要困难是口腔上皮为约40到50个细胞层深，具有阻止药剂渗透的紧密连接。相比之下，肠上皮仅为单个细胞层。
因此，本发明的一个目标为提供用于局部和全身投与通过口腔上皮细胞的治疗剂或诊断剂递送装置，其可以渗透较厚的紧密口腔上皮。
本发明的一个目标还提供掩蔽待递送治疗剂或诊断剂味道的治疗剂或诊断剂递送装置。
本发明的另一个目标为提供尽管存在与口腔递送相关的持续唾液和清除问题仍有效的治疗剂或诊断剂递送装置。
本发明的另一个目标为提供一种用于将治疗剂或诊断剂投与到口腔上皮特定区域的方法。
发明内容
已研发出一种用于将药剂局部和全身递送到靶向口腔位置(如口腔癌细胞)的递送装置。调配物包括粘膜粘附聚合基质，其含有一种或多种治疗剂和/或诊断剂、味道掩蔽剂、渗透增强剂以及药剂囊封纳米粒子。纳米粒子由粘膜粘附聚合物(如壳聚糖或环糊精，其任选地与如RGD肽、叶酸、抗体或葡萄糖类似物的靶向分子组合)；待递送治疗剂或诊断剂；以及亲水性聚合涂层(如聚乙二醇(“PEG”)，其增强通过粘膜到达递送部位的渗透)形成。在一个实施例中，调配物包括用于递送顺铂(“CIS”)或其它化学治疗剂或抗炎剂的壳聚糖或环糊精纳米粒子；聚乙二醇(PEG)涂层以增强纳米粒子的粘膜渗透；以及与PEG连接的靶向基序(RGD肽或葡萄糖类似物)以提高对靶向细胞的生物粘附。粘膜粘附聚合物用于掩蔽治疗剂味道同时使其保留在癌细胞部位处。可以实现较大负载剂量，例如20％顺铂的负载量。
在优选实施例中，使基质调配有具有PEG粘膜粘附聚合物的一侧，其中PEG粘膜粘附聚合物是暴露的以便局部放置于口腔或其它粘膜区域中的上皮或癌细胞上，以及面对口腔内部、覆盖有对待递送治疗剂和/或诊断剂来说不可渗透的生物相容性惰性膜的侧面。基质可以包括额外组分，如味道掩蔽剂以阻止治疗剂的苦味和令人不愉快的味道，例如柠檬酸或其它果味调味剂；渗透增强剂，例如PEG、胆汁盐、柠檬酸或其它；以及抗炎剂或抗氧化剂，例如姜黄素。
附图说明
图1是递送装置、制造和使用的图式。
图2是示出了顺铂负载纳米粒子的不同百分比负载容量的囊封效率的图。
图3是示出了顺铂负载纳米粒子在不同pH下的尺寸和电荷的图。
图4是示出了顺铂负载纳米粒子在pH6下的活体外释放曲线的图。
图5是示出了顺铂囊封纳米粒子随时间推移从壳聚糖海绵释放的图。
图6A示出了FaDu细胞响应于不同浓度顺铂负载纳米粒子(●)、空白纳米粒子(■)、游离顺铂(▲)或无治疗(▼)24小时的生存力。图6B示出了FaDu细胞响应于不同浓度顺铂负载纳米粒子(●)、空白纳米粒子(■)、游离顺铂(▲)或无治疗(▼)48小时的生存力。图6C示出了HCPC1细胞响应于不同浓度顺铂负载纳米粒子(●)、空白纳米粒子(■)或游离顺铂(▲)48小时的生存力。
图7A和7B示出了暴露于顺铂负载纳米粒子(15％)24小时(图7A)或72小时(图7B)的KB细胞的生存力。
图8示出了使用FaDu细胞异种移植小鼠模型顺铂负载纳米粒子的活体内疗效研究。
图9A和9B是经CIS-NP嵌入海绵局部处理和游离顺铂腹膜内处理的仓鼠颊囊癌瘤(HCPC1)细胞系同种异体移植仓鼠的肿瘤抑制研究。结果显示经CIS-NP嵌入海绵处理的仓鼠在四次处理后肿瘤完全消除(图9A)。在处理过程期间HCPC1同种异体移植仓鼠的重量改变曲线图示出了相比于健康群组的不显著的重量损失；而游离顺铂腹膜内群组示出了显著的重量损失(图9B)。
图10是TR-146细胞的np的细胞摄取图。
图11是硫醇改性的壳聚糖聚合物。
图12是荧光团结合的壳聚糖。
具体实施方式
已研发出一种递送装置，其尤其用于口腔内到达口腔粘膜的递送。对递送装置的要求包括：
装置不管生物膜必须粘着于颊内组织
装置必须具有强大的味道掩蔽元件以便患者顺应性
装置必须阻止药剂被洗涤下到咽喉
对于全身递送，装置必须具有足够的渗透能力以在到达全身循环之前渗透通过大致50层细胞。
对于局部递送，必须可根据所需深度调节渗透。
I.定义
“每秒千计数”(Kcps)意指计数率(以每秒千计数计(kcps))。如果样品的计数率低于100，那么应中止测量，意指样品浓度对于测量来说过低。具有适合的Kcps的样品可以视为具有对于测量来说理想浓度的稳定样品。
本文中使用“多分散指数”(PDI)或简称“分散度”来指混合物中的粒子尺寸的不均匀性的量度。PDI测量纳米粒子的尺寸分散度。
本文中使用“ζ电位”(ZP)来指在特定介质中采集的纳米粒子的总电荷并且可以在泽塔塞泽纳米仪器(ZetasizerNanoinstrument)上测量。
“粘膜粘附”是具有粘着于人体中的粘膜的能力的材料的特性。
“生物相容性”是指生物材料在医学疗法方面执行其所需功能的能力，而不会在所述疗法接受者或受益人中引发任何显著非所需局部或全身作用，而在所述特定情形下产生最适当的有利的细胞或组织反应，并且优化所述疗法的临床上相关表现。
“生物可降解”是指材料能够通过活物的作用尤其分解成无害产物的特性。
I.药剂递送装置
图1中示出了代表性递送装置。
装置10包括纳米粒子负载粘膜粘附基质12和不可渗透的背层14。纳米粒子16分散于粘膜粘附基质12中。纳米粒子16包括聚合物18，其具有分散或囊封于其中的治疗剂、防治剂、诊断剂或营养药剂20。任选地，纳米粒子16可以包括化学连接剂22，其可以将靶向配体24和/或额外药剂20偶合到纳米粒子16。粘膜粘附基质12可以包括一种或多种渗透增强剂26a、26b。
将装置10的粘膜粘附基质12施加到口腔，优选于粘液层30上，使得将药剂20递送到下面的口腔上皮32。纳米粒子16渗透粘膜并且把药剂20直接释放于组织中。靶向配体24用于优先递送到如肿瘤细胞34。
基质由生物粘附聚合物，最优选粘膜粘附聚合物形成。基质具有分散于其中的纳米粒子，并且可以包括塑化剂。针对基质选择因粘膜粘附性和将聚合递送系统和味道掩蔽剂组合到多孔结构中的能力而熟知的生物粘附聚合物。将对药剂扩散来说惰性并且不可渗透的膜施加到不用于药剂递送的表面。这产生单向递送药剂的粘膜粘附材料。可以添加渗透增强剂和味道掩蔽剂以增强药剂渗透。
纳米级尺寸粒子渗透口腔组织。尺寸小于200nm的NP渗透通过粘膜并且被癌细胞摄取。这一尺寸足以运载足够治疗剂或诊断剂(如化学治疗剂，如顺铂(CIS))以获得较高负载和囊封效率(高于80％)，其对于按比例扩大和商业化来说是合乎需要的。
囊封保护口腔中的味蕾避免如顺铂的药剂的令人不愉快的金属味道，允许如PEG的亲水性聚合物的涂层受控制地渗透进入粘液，允许添加靶向配体，并且允许控制释放药剂。此外，在全身渗透的情况下，囊封还减少身体网状内皮系统的摄取。较小粒子具有较大表面积与体积比，其使得粒子溶解速率高于较大粒子的溶解速率，使得其能够克服归因于溶解度因素的渗透限制。较大表面积与体积增加生物粘附力。这些因素组合起来导致药剂深深渗透到癌细胞中，提供肯定效益。
存在三个帮助实现局部递送的主要靶向方面：
1.直接：通过将药剂负载纳米粒子直接放置在癌症肿瘤上来实现。
2.主动：使用分子靶向药剂，如RGD以进一步集中于癌细胞上并且减小对健康细胞的毒性来获得。
3.被动：归因于导致组织中较高药剂摄取的肿瘤中的血管结构，自然地发生。这被称为增强的渗透性和保留效应(EPR)。
A.粘膜粘附聚合纳米粒子
已知多种生物粘附和粘膜粘附聚合物。在优选实施例中，聚合物是粘膜粘附性的以使得其可以结合到口腔的粘膜区域。优选地，聚合物是聚阳离子、生物相容性并且生物可降解的。优选聚合物是壳聚糖。
壳聚糖是聚阳离子、无毒、生物相容性并且生物可降解的聚合物。另外，壳聚糖具有可以以多种配体改性的不同官能团。由于其独特的物理化学特性，壳聚糖在生物医学应用范围内具有极大潜能。壳聚糖(CHI)由于其生物粘附性和渗透性特性已经常用作粘膜药剂递送机制。口腔上皮中的屏障可以轻易被壳聚糖粒子破坏，从而增强通过颊内粘膜的渗透性。
可以利用壳聚糖的伯胺基来经由使用N-羟基琥珀酰亚胺化学作用的生物素化实现壳聚糖改性。这之后添加强有力地与生物素结合的抗生物素蛋白。可以接着添加生物素化配体，如聚乙二醇(PEG)和RGD肽序列或生物素化酶，以改变壳聚糖的表面特性。不同因素影响壳聚糖粒子的制造，如制剂pH、包括聚阴离子、电荷比和脱乙酰化程度以及壳聚糖的分子量。
壳聚糖纳米粒子优选与如小红莓(doxorubicin)的化学治疗剂一起使用，因为壳聚糖对较低pH敏感，因为癌症组织是酸性的，并且粒子在酸性环境中释放药剂更快。从壳聚糖纳米粒子控制释放药剂确保稳定量的药剂靶向癌症组织同时使对周围健康组织的毒性副作用减到最小。
其它适用的天然聚合物是环糊精和果胶。若干研究报道合成生物粘附聚合物。马西威兹(Mathiowitz)等人的美国专利第6,217,908号描述了聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚亚烷基对苯二甲酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚磷腈、聚丙烯酰胺、聚(乙烯醇)、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯苯酚、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚丙交脂、聚丙交脂和聚乙交酯的共聚物、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(交酯-共-己内酯)、聚[交酯-共-乙交酯]、聚酸酐、聚原酸酯、其掺合物和共聚物。耐非(Nafee)等人,药物开发与工业制药学(DrugDev.Ind.Pharm.),30(9):985-983(2004)报道羧乙烯聚合物(CP934和CP940)、聚卡波非(PC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)以及阴离子聚合物、作为阳离子聚合物的壳聚糖(Ch)以及作为非离子聚合物的羟丙基甲基纤维素(HPMC)都是适用的，但聚丙烯酸衍生物(PAA)显示最高的生物粘附力、延长的滞留时间以及较高的表面酸性。SCMC和壳聚糖还具有良好的生物粘附特征，而HPMC和果胶展现较弱的生物粘附。
B.增强粘膜渗透的亲水性聚合物
在优选实施例中，较低分子量聚乙二醇(PEG)(最优选约5000道尔顿)或巴斯夫(BASF)出售的(非离子三嵌段共聚物，其由侧接聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水性链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水性链构成)的致密涂层共价连接到壳聚糖纳米粒子表面上以使粒子更具亲水性并且从而更容易渗透粘膜。其它适用的粘膜上皮渗透性的聚合增强剂由迪克罗(DiColo)等人,药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)97(5):1652-1680(2008)。活性聚合物可以分成：聚阳离子(壳聚糖和其季铵衍生物，聚-L-精氨酸(聚-L-Arg)、胺化明胶)、聚阴离子(N-羧甲基壳聚糖、聚(丙烯酸))以及硫醇化聚合物(羧甲基纤维素-半胱氨酸、聚卡波非(PCP)-半胱氨酸、壳聚糖-硫代丁基脒、壳聚糖-硫代乙醇酸、壳聚糖-谷胱甘肽结合物)。
C.组织粘附分子
已知诸多组织靶向部分。靶向部分分类为蛋白质(主要是抗体和其片段)、肽、核酸(适体)、小分子或其它(维生素或碳水化合物)。尽管单系抗体(mAb)已广泛用作导向分子以用于靶向递送纳米粒子，包括较大尺寸和与纳米粒子结合困难的若干限制妨碍其使用。因此，在可能时使用包括肽的其它较小尺寸的配体。肽基靶向配体可以经由若干方法鉴别。最常，其获自相关蛋白质的结合区。噬菌体展示技术也可以用于鉴别肽靶向配体。在噬菌体展示筛选中，噬菌体呈现噬菌体展示文库中的多种靶向肽序列(约1011个不同序列)，并且使用结合分析选择目标肽。西仑吉肽(Cilengitide)是具有整合素结合亲和力的环肽，其目前在II期临床试验中用于治疗非小细胞肺癌和胰腺癌。人类VEGF受体2(安吉赛特(Angiocept))的艾德素(Adnectin)是40氨基酸热稳定和蛋白酶稳定寡肽，其在2006年进入I期临床试验用于治疗晚期实体肿瘤和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)。尽管肽可能具有缺点，如较低目标亲和力和蛋白水解裂解敏感性，这些问题可以通过多价展示肽或通过使用D-氨基酸合成其来改善。参见余(Yu)等人,治疗诊断学(Theranostics).2(1):3-44(2012)。关于可以被靶向的粘膜上皮特定抗原决定基还参见斯努克(Snook)等人,癌症免疫学(CancerImmunology),免疫疗法(Immunotherapy)61(5):713-723(2012)。
癌细胞靶向部分中的一个是RGD，其是肿瘤血管归巢肽，其靶向整合素受体。其是在血管生成(血管形成)期间高度表达的细胞粘附蛋白质并且对肿瘤增生来说很关键。RGD已知直接结合到壳聚糖纳米粒子以提高用于药剂递送的组织粘附(汉(Han)等人,临床癌症研究(ClinCancerRes.),16:3910(2010))并且已知结合到壳聚糖-PEG粒子以提高化学治疗剂递送到肿瘤(吕(Lv)等人,分子药物学(Mol.Pharmaceutics),9:1736-1747(2012))。
可以通过RGD识别整合素α(2)β(1)和α(3)β(1)。数据还表明RGD序列可以识别至少12种整合素异质二聚物，并且实际上在口腔SCC细胞系中，α(2)β(1)和α(3)β(1)高度表达并且这导致极大的转染效率。
纳米粒子上RGD的表面覆盖率可以通过改变纳米粒子表面上的PEG链和PEG-RGD链的比率来调节。纳米粒子的靶向特异性和递送性能可能受RGD基序密度影响。一般来说，5％-10％的RGD覆盖率被视为有效。
可以用于靶向口腔癌的生物标记物描述在文献中，例如许(Hsu)等人分子癌症研究(MolCancerRes.)10(11):1430-9(2012)。研究显示IL-20促进口腔肿瘤生长、迁移以及肿瘤相关的炎症，其可以是治疗口腔癌的目标。IL-6是另一种特定标记物口腔鳞癌(库里格(Culig),治疗靶标专家评论(ExpertOpinTherTargets),17(1):53-9(2013))。
作为一个替代方案，抗-IL-20或抗-IL-6单株抗体可以结合到PEG链末端上靶向基序以提高递送系统的特异性和功效。
18F-FDG(2-脱氧-2-[18F]氟-d-葡萄糖)PET(正电子发射断层摄影术)是提供关于组织代谢信息的功能成像技术，并且其已经成功地应用到头颈癌评估(中川(Nakagawa)等人,核医学杂志(JNuclMed.),49(7):1053-1059(2008))。葡萄糖类似物18F-FDG通过葡萄糖易化扩散转运蛋白运输到细胞中(米克勒(Mueckler),欧洲生物化学杂志(EurJBiochem.),219:713-725(1994))。恶性肿瘤中普遍存在的1型葡萄糖运输蛋白(GLUT1)的过度表达使得18F-FDGPET在肿瘤学中具有适用作用(史密斯(Smith),英国生物医学集杂志(BrJBiomedSet),56:285-292(1999))。
葡萄糖类似物由于其在癌细胞代谢中的作用而适用作癌细胞的靶向基序。已研发出各种葡萄糖类似物，如1-硫代-β-D-葡萄糖，其已表明是黑素瘤的特异性探针(卡斯泰利(Castelli)等人,当前放射性药物(CurrentRadiopharmaceuticals),4(4):355-360(2012))；以及D-葡糖胺(2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖)盐酸盐，其结合到氧化铁纳米粒子上用于活体外海拉(Hela)细胞靶向(熊(Xiong)等人,药物研究(PharmRes.),29:1087-1097(2012))。
通过将葡萄糖类似物结合到PEG化壳聚糖纳米粒子的PEG链上，口腔癌的靶向特异性可以得到改良，所述葡萄糖类似物在葡萄糖分子-(1或2)-(官能团)-β-D-葡萄糖)中的1或2'位置处具有取代标准羟基的不同官能团，所述葡萄糖类似物例如：1-叠氮基-β-D-葡萄糖、1-叠氮基-β-D-葡萄糖四乙酸、2-叠氮基-β-D-葡萄糖、2-叠氮基-β-D-葡萄糖四乙酸、1-硫代-β-D-葡萄糖、2-硫代-β-D-葡萄糖)。
D.生物相容性不可渗透的膜或涂层
基质通过喷射、浸渍或接触涂布有膜或不可渗透的涂层，如用于背衬生物粘附片剂和装置的那些。参见例如博德帕里(Boddupalli)等人,先进药物技术研究杂志(JAdvPharmTechnolRes.),1(4):381-387(2010)；罗宾逊(Robinson)和艾恩斯(Irons)；胶粘剂技术手册(HandbookofAdhesiveTechnology),A.皮兹(A.Pizzi)和K.L.米塔尔(K.L.Mittal)编(CRC出版社2003)。
不可渗透背衬执行双重功能：(1)防止药剂损失和(2)提供药剂味道掩蔽。
一般来说，不可渗透的涂层由如乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素或尤特奇(Eudragit)(聚丙烯酰胺)的聚合物形成。这些也可以是生物粘附性的。生物可降解的材料是优选的，因为所述材料可能被吞咽的可能性。
E.待囊封药剂
任何治疗剂、防治剂、诊断剂或营养药剂都可以被囊封。代表性药剂包括化学治疗剂、抗感染剂、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、疫苗以及其组合。
优选药剂是铂基化学治疗剂，如顺铂(CIS)。历史上，CIS已处于铂基化学治疗剂的前沿并且是包括OC的许多癌症的治疗中的护理标准。尽管CIS是许多癌症的主导疗法，但其常常由于传统大丸剂全身IV剂量而受其显著的全身性毒性阻碍。这一系统避免所述毒性。
诊断剂可以是不透射线的、放射性的或其它。举例来说，诊断剂可以是成像剂，如氧化铁、钆络合物、放射性同位素、金以及其组合。
F.额外添加剂
可以包括的其它化合物是味道掩蔽剂，如调味剂(薄荷、橙子或柑桔调味剂等)；以及抗氧化剂，其可用于预防细菌污染。代表性抗血管生成剂是姜黄素和其纯化组分；抗生素，如四环素和其衍生物；以及化学治疗剂，如沙立度胺(thalidomide)。这些还可以帮助治疗癌症或治疗部位处的感染。
这些药剂可以涂布于基质或纳米粒子上、分散在基质或纳米粒子内或囊封在基质或纳米粒子内。
II.制造方法
至少存在四种可用方法以制得壳聚糖粒子：离子型胶凝、微乳液、乳化溶剂扩散以及聚电解质络合物。最广泛研发的方法是离子型胶凝和自组装聚电解质。这些方法提供许多优势，如简单并且温和的制备方法，而不使用有机溶剂或较高剪切力。其适用于较宽类别的药剂，包括作为不稳定药剂众人皆知的大分子。一般来说，发现影响纳米粒子形成(包括粒径和表面电荷)的因素是壳聚糖的分子量和脱乙酰化程度。发现截留效率取决于pKa和截留药剂的溶解度。
离子型胶凝方法常用于制备壳聚糖纳米粒子。在酸性溶液中，壳聚糖分子的胺基被质子化并且通过离子相互作用与如三聚磷酸盐(TPP)的阴离子相互作用形成粒子(李(Lee)等人,聚合物(Polymer),42:1879-1892(2001))。这种方法极其简单并且温和。应用可逆的通过静电相互作用的物理交联替代化学交联以防止试剂的可能的毒性和其它非所需作用(舒(Shu)等人,国际药学杂志(InternalJ.Pharm.),201:51-58(2000))。
还参见吕等人,分子药物学,9:1736-1747(2012)，其描述通过接枝有环状Arg-Gly-Asp(RGD)肽的PEG化O-羧甲基-壳聚糖(CMC)纳米粒子的不溶性药剂(太平洋紫杉醇，PTX)的肿瘤靶向递送系统。为了提高负载效率(LE)，将O/W/O双乳液方法与程序升温固化技术组合，并且控制呈原位纳米微晶形式的基质网络内的PTX。此外，这些CMC纳米粒子被PEG化，其可以减少网状内皮系统(RES)识别并且延长在血液中的循环时间。
已知通过微乳液制得壳聚糖粒子的方法。举例来说，使用壳聚糖(CS)作为亲水性主链和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)作为疏水性侧链的两亲性接枝共聚物经由乳液自组装合成制备。CS水溶液用作水相，并且三氯甲烷中的PLGA用作油相。在表面活性剂斯潘-80(span-80)存在下制造油包水(W/O)乳液。CS-g-PLGA两亲物可以自组装形成尺寸在≈100-300nm范围内的胶束，使得其容易应用到各种靶向药物释放和生物材料领域中。壳聚糖可以与1-羟基苯并三唑一起溶解于去离子水中。制备油包水(W/O)壳聚糖和聚(乳酸-共-乙醇酸)微乳液，并且接着制造壳聚糖-接枝-聚(乳酸-共-乙醇酸)刺激反应两亲物。所得两亲物可以在适合的溶剂中自组装形成胶束。蔡(Cai),国际纳米医学杂志(IntJNanomedicine),6:3499-508(2011)描述了针对整合素过度表达肿瘤细胞靶向递送的RGD肽介导的壳聚糖基聚合胶束。
壳聚糖微米粒子可以通过油包水乳液溶剂扩散方法制备。在搅拌下将壳聚糖溶液逐滴添加到乙酸乙酯中持续45分钟。在乳化扩散之后，通过离心回收壳聚糖微米粒子并且在30℃下在真空烘箱中干燥24小时。
壳聚糖的重复吡喃葡萄糖单元的C2位置上的阳离子氨基可以与其它聚离子的阴离子基团(通常羧酸基团)以静电方式相互作用以形成聚电解质络合物。已使用许多来自天然来源(例如果胶、海藻酸盐、角叉菜胶、黄原胶、羧甲基纤维素、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、玻尿酸)或合成来源(例如聚(丙烯酸))、聚磷酸、聚(L-交酯)的不同聚阴离子来形成具有壳聚糖的聚电解质络合物以提供对于特定药物递送系统设计所需的物理化学特性(伯杰(Berger)等人欧洲制药学与生物制药学杂志(EurJPharmBiopharm.)2004；57:35-52)。
如实例5所展示，壳聚糖海绵可以通过形成壳聚糖溶液、添加酸、接着冷冻并且冻干壳聚糖来制备。在一个优选实施例中，使含有药物的纳米粒子悬浮于壳聚糖溶液中以产生具有分散于其中的药物纳米粒子的壳聚糖海绵。
II.投与方法
两种通常报道的口腔癌给药方案(假设平均生理资料档案)产生15-40μg/ml范围内的治疗剂浓度。这些浓度范围可以使用NP递送系统获得。然而，重要的是理解药剂被吸收通过口腔粘膜时的生物可用性。意图是将药剂递送到局部组织，其在待递送药剂总浓度方面具有直接影响。需要浓度小于全身治疗剂给定的浓度。举例来说，CIS传统上以静脉内大丸剂剂量形式递送，并且受其全身性毒性限制。这一毒性尤其导致肾毒性(肾脏)和耳毒性(听觉)以及骨髓抑制、恶心和呕吐。在累积剂量200mg/m2的情况下观测到神经毒性。发现CIS的近期脂质形式具有300mg/m2的最大耐受剂量。假设平均生理资料档案，血浆浓度应小于76μg/ml。通过保持累积剂量在所报道的耐受范围内，这一途径避免全身性毒性和其相关作用。如果由于唾液清除药剂到达胃肠(GI)道，那么这还将避免全身性毒性。最终在GI道中的大多数药剂将被排泄出，因为大多数铂基抗癌剂在GI道中的吸收较低。
将通过参考以下非限制性实例进一步理解本发明。
实例1：制备无药物壳聚糖基纳米粒子
使用如下文所描述的低分子量研究级壳聚糖制备纳米粒子。
材料和方法
简单来说，在剧烈搅拌的同时将以各种w/v(0.1％-1％)于纯化水中的5mL三聚磷酸盐(TPP)溶液添加到含有各种浓度低分子量、中等重量并且脱乙酰化壳聚糖(0.1％-1％w/v)的10mL乙酸溶液(0.175％v/v)中。在室温下连续搅拌混合物10分钟，产生具有各种尺寸的壳聚糖纳米粒子(CHI-NP)的集合。
表征纳米粒子。通过泽塔塞泽纳米仪(英国马尔文仪器有限公司(MalvernInstruments,Ltd.,UK))测量纳米粒子的尺寸、多分散指数(PDI)、每秒千计数(KCPS)以及ζ电位(ZP)。
结果
表1概括了由低分子量壳聚糖制备的纳米粒子的特性。到目前为止，颗粒样品的最重要的物理性质是粒径。在广泛范围的工业领域中常规地进行粒径分布的测量，并且其常常是制造许多产品时的关键参数。NP必须小于200nm以渗透通过粘膜并且被癌细胞摄取。
如休托特(Heurtault)等人,生物材料(Biomaterials),24:4283-4300(2003)中所描述，ζ电位是粒子表面电荷的重要并且有用的指标，其可以用于预测并且控制胶体悬浮液或乳液的稳定性。几乎所有与液体接触的粒子在其表面上获得电荷。剪切面处的电势称为ζ电位。剪切面是分离在运动中结合到固体表面的液体薄层(由抗衡离子构成的液体层)的假想表面。ζ电位越大，悬浮液越有可能稳定，因为带电粒子彼此排斥并且因此克服聚集的自然倾向。ζ电位的测量允许对胶体分散液的储存稳定性进行预测。
纳米粒子的电荷对其粘膜粘附特性来说是关键的(生物药效学公报(BiolPharmBull.)2003年5月；26(5):743-6.ζ电位与猪膀胱粘膜的粘膜粘着强度之间的相关性(Thecorrelationbetweenzetapotentialandmucoadhesionstrengthonpigvesicalmucosa).)。带正电荷纳米材料具有较佳粘膜粘着强度。因此，所需ζ电位是在10-50mV范围内的正电荷，其被视为稳定的。
表1：低分子量壳聚糖纳米粒子。
样品名称 KCPS 直径(nm) PDI ZP(mV)
0.1％TPP+0.1％壳聚糖 423.6 193.2 0.283 48.24
0.1％TPP+0.5％壳聚糖 213.9 810.6 0.331 67.89
0.1％TPP+1％壳聚糖 308.6 2616.3 0.383 -1.42E-01
0.5％TPP+0.1％壳聚糖 378.2 5721 0.289 7.63
0.5％TPP+0.5％壳聚糖 456.8 990.3 0.429 65.63
0.5％TPP+1％壳聚糖 54.7 4744 0.444 76.78
1％TPP+0.1％壳聚糖 319.4 6391.4 0.628 2.54
1％TPP+0.5％壳聚糖 465.3 802.5 0.005 6.36E-01
1％TPP+1％壳聚糖 476.1 608.7 0.139 -2.30E+00
KCPS＝每秒千计数
PDI＝多分散指数，也称为分散度
ZP＝ζ电位
中等分子量研究级壳聚糖还用于由低分子量研究级壳聚糖制备如上文所描述的纳米粒子。如表2中所示出表征纳米粒子。
表2：中等分子量壳聚糖纳米粒子。
样品名称 KCPS 直径(nm) PDI ZP(mV)
0.1％TPP+0.1％壳聚糖 361.9 1940.3 0.241 -5.07E-01
0.1％TPP+0.5％壳聚糖 296.7 822.7 0.319 146.42
0.1％TPP+1％壳聚糖 483.4 939.4 0.217 -3.99E-01
0.5％TPP+0.1％壳聚糖 534 2147.6 0.373 -3.29
0.5％TPP+0.5％壳聚糖 362.7 1450.3 0.005 1.94E+01
0.5％TPP+1％壳聚糖 472.4 1098.4 0.005 124.74
1％TPP+0.1％壳聚糖 347.7 3152.4 0.339 2.02E-01
1％TPP+0.5％壳聚糖 394.6 901.9 0.005 2.95E-01
1％TPP+1％壳聚糖 305.5 1981.6 0.005 -2.07E+01
在单独的实验中，还使用医药级壳聚糖PROTASANTMUPCL113(壳聚糖氯化物)如上文所描述制备纳米粒子。PROTASANTMUPCL113(壳聚糖氯化物)是基于壳聚糖，其中去除75％与90％之间的乙酰基。阳离子聚合物是高度纯化并且充分表征的水溶性氯化物盐。功能特性通过分子量和脱乙酰化程度描述。通常，PROTASANTMUPCL113(壳聚糖氯化物)的分子量在50,000-150,000g/mol范围内(如乙酸壳聚糖所测量)。内毒素和蛋白质的超低水平允许很多种活体外和活体内应用。
表3：PROTASANTMUPCL113(壳聚糖氯化物)纳米粒子。
样品名称 KCPS 直径(nm) PDI ZP(mV)
0.1％TPP+0.1％壳聚糖(0.6:1) 332.6 403.2 0.447 30.24
0.1％TPP+0.1％壳聚糖(0.5:1) 313.9 133.5 0.221 44.38
0.1％TPP+0.1％壳聚糖(0.4:1) 308.6 102.3 0.243 66.89
通过使用高纯度壳聚糖(阳离子聚合物是高度纯化并且充分表征的水溶性氯化物盐。)，获得具有较佳品质的壳聚糖纳米粒子，如表3中所示。通过优化TPP与壳聚糖溶液之间的不同比率(0.6:1；0.5:1；0.4:1)获得最佳调配物。如表3中所示，最佳形成是使用大约0.5:1的TPP与壳聚糖的比率，其具有理想的尺寸和ζ电位。
实例2：顺铂囊封纳米粒子的制备和表征
材料和方法
使用低分子量研究壳聚糖，使用如下文所描述的不同浓度顺铂制备顺铂负载纳米粒子。
简单来说，在剧烈搅拌的同时将以0.1％w/v含有顺铂(0.1-2mg)的5mL三聚磷酸盐(TPP)溶液添加到含有0.1％w/v壳聚糖的10mL乙酸溶液(0.175％v/v)中。在室温下连续搅拌混合物10分钟，产生具有不同顺铂负载量的顺铂囊封CHI-NP的集合。
空白纳米粒子的最佳调配是在剧烈搅拌的同时将以0.1％w/v于纯化水中的5mL三聚磷酸盐(TPP)溶液添加到含有0.1％w/v壳聚糖的10mL乙酸溶液(0.175％v/v)中。在室温下连续搅拌混合物10分钟，产生含有113nmNP的壳聚糖纳米粒子(CHI-NP)溶液。
顺铂负载纳米粒子制备如下。在剧烈搅拌的同时将含有不同量顺铂(0.1-5mg)的5mL0.1％w/v三聚磷酸盐(TPP)溶液添加到含有0.1％w/v壳聚糖的10mL乙酸溶液(0.175％v/v)中。在室温下连续搅拌混合物10分钟，产生具有不同顺铂负载量的顺铂囊封CHI-NP的集合。
通过ICP-AES(电感耦合等离子体原子发射光谱学)对顺铂负载纳米粒子中的顺铂量进行定量，并且计算负载效率。
对于稳定性测试，合成顺铂囊封纳米粒子并且对于尺寸分布通过泽塔塞泽纳米仪来表征。接着将5mLNP溶液添加到10mLPBS、培养基和水中。所得个别溶液接着再次表征。NP溶液的储存稳定性测试在室温中3周后进行。
结果
如上文所描述制备的纳米粒子表征并且概述在表4中。
表4：顺铂囊封低分子量壳聚糖纳米粒子。
样品名称 直径(nm) PDI KCPS ZP(mV)
空白 265.3 0.538 165.5 12.1
0.75％顺铂负载NP 150.6 0.305 254.5 16.8
1.87％顺铂负载NP 187.8 0.212 316 14.4
3.75％顺铂负载NP 306.6 0.474 276 13.7
7.5％顺铂负载NP 315.9 0.402 377.9 14.5
15％顺铂负载NP 285.4 0.324 314.8 14.7
空白+2mg泊洛沙姆(Poloxamer)188 235.8 0.324 294.8 15.2
空白+4mg泊洛沙姆188 255.5 0.57 392.2 14.2
使用表4中示出的低分子量研究壳聚糖制备含有不同量顺铂的顺铂负载纳米粒子。使用低分子量研究级壳聚糖的PDI和尺寸能控性表现不佳。
为了获得较佳品质药物负载纳米粒子，使用PROTASANCL113(壳聚糖氯化物)制备顺铂负载纳米粒子。如上文所描述制备的这些顺铂囊封纳米粒子表征并且概述在表5中。
表5：顺铂囊封PROTASANTMUPCL113(壳聚糖氯化物)纳米粒子。
样品名称 直径(nm) PDI KCPS ZP(mV)
空白 133.5 0.221 313.9 44.38
0.75％顺铂负载CHI-NP 122.3 0.284 278.5 40.35
1.87％顺铂负载CHI-NP 107.9 0.212 301 42.54
3.75％顺铂负载CHI-NP 74.2 0.276 332 37.33
7.5％顺铂负载CHI-NP 70.1 0.260 323.9 38.14
15％顺铂负载CHI-NP 75.1 0.279 354.1 36.92
33.3％顺铂负载CHI-NP 143.8 0.237 364.4 38.79
使用33.3％顺铂负载壳聚糖纳米粒子获得最佳调配物，并且选择这一调配物进行其它活体外和活体内研究。简单来说，在剧烈搅拌的同时将以0.1％w/v含有顺铂(5mg)的5mL三聚磷酸盐(TPP)溶液添加到含有0.1％w/v壳聚糖的10mL乙酸溶液(0.175％v/v)中。在室温下连续搅拌混合物10分钟，产生尺寸为143nm的33.3％顺铂负载CHI-NP。
通过ICP-AES(电感耦合等离子体原子发射光谱学)对表5中示出的顺铂负载纳米粒子中的顺铂量进行定量，并且负载效率显示于表6中。针对囊封效率绘制的负载效率显示于图2中。
表6：通过ICP-AES对顺铂负载纳米粒子中的顺铂进行定量。
如表7中所示，通过在第0天和第21天测量顺铂负载壳聚糖纳米粒子的直径、PDI以及ζ电位，来测定由表5中的PROTASANTMUPCL113制备的顺铂负载壳聚糖纳米粒子的稳定性。
表7.顺铂负载纳米粒子稳定性
样品名称 直径(nm) PDI ζ(mV) 直径(nm) PDI ζ(mV)
空白 133.5 0.221 44.38 135.4 0.233 45.12
0.75％顺铂负载NP 122.3 0.284 40.35 128.7 0.231 43.12
1.87％顺铂负载NP 107.9 0.212 42.54 111.2 0.278 40.11
3.75％顺铂负载NP 74.2 0.276 37.33 75.25 0.29 38.21
7.5％顺铂负载NP 70.1 0.260 38.14 72 0.273 37.1
15％顺铂负载NP 75.1 0.279 36.92 77.5.5 0.263 35.59
33.3％顺铂负载NP 143.8 0.237 38.79 141.3 0.254 37.01
数据显示纳米粒子稳定长达三周。
实例3：pH对顺铂囊封壳聚糖纳米粒子特性的影响
材料和方法
使用泽塔塞泽(纳米ZS，英国马尔文仪器公司)研究pH对上文所提到的33.3％顺铂负载壳聚糖纳米粒子的尺寸和ζ电位的影响。用0.1M氢氧化钠溶液(NaOH)在持续搅拌下在一定pH范围内(3.7-8)滴定纳米粒子(12mL)的水性分散液。将经滴定的分散液转移到毛细管测量池中以便泽塔塞泽测量。测量出纳米粒子的特性(尺寸和电荷两种)随pH变化而改变。
材料和方法
在3.7-8.0pH范围内，纳米粒子的ζ电位变化显示于图3中(以黑色表示)。在较低pH下交联壳聚糖的较高表面正电荷密度归因于壳聚糖的表面游离胺基。随着纳米粒子悬浮液pH提高，较大比例胺基被去质子化，导致粒子所测量的正ζ电位下降。
pH对纳米粒子尺寸的影响显示于图3中。在3.7-5的pH范围下，平均纳米粒子尺寸为常数。酸性介质中的壳聚糖的正电荷产生纳米粒子之间的排斥力。然而，随着pH提高，平均测量粒径提高，表明纳米粒子膨胀并且聚集。纳米粒子膨胀导致药物在pH6或更高pH下释放，其使得顺铂负载壳聚糖纳米粒子成为pH敏感性药物释放系统。
实例4：在pH＝6下顺铂囊封壳聚糖纳米粒子的活体外模拟药物释放研究。
材料和方法
对33％顺铂负载壳聚糖纳米粒子进行活体外药物释放研究。3mL纳米粒子溶液用pH6缓冲液进行透析。旋转速度固定在100rpm下。在特定时间间隔(10分钟、30分钟、1小时、1.5小时、2小时以及24小时)取出各5ml的样品。收集样品并且通过ICP-AES对顺铂浓度进行定量。
结果
计算顺铂从纳米粒子释放的百分比并且概述在图4中。在24小时之后，大致60％顺铂从纳米粒子释放。
实例5：制备嵌入有顺铂囊封壳聚糖纳米粒子的壳聚糖海绵
材料和方法
将含有1％壳聚糖w/v的0.6mL1％w/v柠檬酸添加到16mLCHI-NP或顺铂负载的CHI-NP(16:6w/wNP和壳聚糖)中。在-80℃下冷冻所得溶液并且冻干2天以获得纳米粒子嵌入海绵。柠檬酸用作渗透增强剂以及味道掩蔽剂。
为了理解来自海绵样基质的纳米粒子的释放曲线，合成FITC标记的纳米粒子。简单来说，将25mg壳聚糖溶解于25ml(.175％，v/v)乙酸水溶液中，并且用1MNaOH将pH值调节到6.0。将一毫克荧光素钠盐溶解于100μl乙醇中并且添加到壳聚糖溶液中。为了催化形成酰胺键，添加EDAC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐]以达到0.05M的最终浓度。在暗处在室温下培育反应混合物12小时伴随着持久搅拌。通过用去矿物质水进行透析(纤维素透析导管，孔径12,400Da；无缝)来分离所得FITC结合壳聚糖。通过红外光谱学(IR)和分光荧光法，使用未改性的壳聚糖和荧光素作为对照进行衍生化方法的评估。
接着通过以下相同方案，使用FITC结合壳聚糖获得FITC标记的纳米粒子。接着将FITC标记的纳米粒子嵌入如上文所描述的海绵中。将海绵放置于1mLPBS中并且在各个时间点收集溶液。通过测量所收集的溶液的荧光强度，随时间推移测量来自壳聚糖海绵的纳米粒子的释放曲线。
制备FITC标记的顺铂囊封纳米粒子嵌入海绵，并且将其放置于具有两种pH条件(即，pH5.5和pH7)的6孔盘中。来自海绵的纳米粒子的释放通过其在不同时间点的荧光强度使用盘读数器来测量。
结果
从海绵释放的纳米粒子随时间推移而增加，如图5所示。在大致20分钟内90％的纳米粒子从海绵释放。
结果显示在pH5.5下比在pH7下快的释放曲线，其指示肿瘤细胞上我们的优选释放平台(比健康细胞酸性更强)。
实例6：使用顺铂负载壳聚糖纳米粒子的细胞生存力研究
材料和方法
使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)分析进行33％顺铂负载纳米粒子的细胞生存力研究。FaDu(HTB-43，来自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC))细胞系是来源于咽的顺铂敏感性鳞状癌细胞系[临床癌症研究10:8005-8017(2004).]，将其用于活体外研究。
还使用四唑化合物(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑内盐MTS进行33％顺铂负载纳米粒子的细胞生存力研究。当被细胞并入时，MTS被代谢活性细胞生物还原。发光量与培养物中的活细胞数量成正比。
在单独组的实验中，在用15％顺铂负载壳聚糖纳米粒子处理24小时后，使用MTT分析检测KB细胞(海拉亚系)。
为了理解CIS-NP是如何影响顺铂抵抗性细胞系，进行顺铂敏感性卵巢细胞系A2670和顺铂抵抗性卵巢细胞系A2670的细胞生存力研究。
结果
显示24小时和48小时培育后相对于FaDu细胞系，如MTT分析所评定的游离顺铂、33％顺铂负载纳米粒子以及空白纳米粒子的活体外疗效的结果分别显示于图6A和6B中。
使用MTS分析的48小时33％顺铂负载纳米粒子、空白纳米粒子或游离顺铂相对于HCPC1(仓鼠颊囊癌瘤)细胞的细胞生存力显示于图6C中。细胞生长发生50％抑制的浓度的IC50值对于游离顺铂约为0.06μM，对于空白纳米粒子为0.26μM，并且对于33％顺铂负载纳米粒子大致为2.3nM。
图7A和图7B显示单独组实验的结果，其中在用15％顺铂负载壳聚糖纳米粒子处理24小时(图7A)和72小时(图7B)后，使用MTT分析检测KB细胞(海拉亚系)。所述结果进一步验证了顺铂负载壳聚糖纳米粒子的疗效。此外，还已研究了人类口腔表皮的KB细胞系、其它类型的细胞系(例如3T3：小鼠成纤维细胞；A431：皮肤癌瘤)。
具有顺铂敏感性和不敏感性细胞系的研究显示比敏感性细胞系的游离CIS低得多的CIS-NP的IC50；然而，在CIS-NP与抵抗性细胞系的游离CIS群组之间差异并不显著。尽管通过使用高浓度药物可以破坏抵抗性细胞系两个群组中的细胞，但在活体内情况下对于游离CIS存在剂量限制性毒性问题。
实例8：使用顺铂负载壳聚糖纳米粒子的活体内小鼠研究
A.FaDu肿瘤
材料和方法
将4-5周大的裸小鼠麻醉、刮毛并且准备植入肿瘤细胞。从培养物收集FaDu细胞，并且接着将悬浮于1:1PBS缓冲液与基质胶的混合物中的3×105个细胞皮下注入小鼠背部。21天后，当肿瘤尺寸达到大致150mm3时，将小鼠分成3个群组，每个群组五个小鼠，使重量和肿瘤尺寸差异减到最小。通过皮下注射PBS、顺铂负载纳米粒子或无药物壳聚糖纳米粒子(1.15mg/kg顺铂等效物)来处理携带肿瘤的小鼠。以3天的间隔，即，分别在第21天、第24天、第27天以及第30天投与两种剂量。注射后，严密监测动物，并且在不知道每个动物接受哪种注射的情况下每隔一定间隔使用卡尺对每个动物进行肿瘤尺寸和体重的测量。根据公式(长度)×(宽度)2/2计算每个时间点的肿瘤体积，其中长轴是长度，短轴是宽度。
结果
针对每个群组制备的中位肿瘤生长曲线描绘了随时间变化的中位肿瘤尺寸(图7)。结果表明顺铂负载纳米粒子减小肿瘤尺寸。
在处理终点(三周)收集三个群组(肿瘤内CIS-NP、肿瘤内游离顺铂以及静脉内游离顺铂)的肿瘤组织，并且使用ICP-MS进行分析。结果显示用纳米粒子处理的群组相较于其它两个群组，在肿瘤中具有最多的药物积聚，即，肿瘤内和静脉内游离顺铂)。小鼠血液中的毒性研究显示在24小时内，相比于游离顺铂群组(瘤内和静脉内两者)，肿瘤内纳米粒子群组的血流中存在极少量的化学药物，表明递送系统的毒性减到最小。
B.HCPC1肿瘤
材料和方法
将71-80g的金叙利亚(Syrian)仓鼠麻醉并且准备植入肿瘤细胞。从培养物收集仓鼠颊囊癌瘤(HCPC1)细胞，接着将悬浮于PBS缓冲液中的1×108个细胞皮下注入仓鼠的颊囊中。7天后，当肿瘤尺寸达到约100mm3时，将仓鼠分成4个群组，使重量和肿瘤尺寸差异减到最小。
通过腹膜内注射游离顺铂和局部放入纳米粒子嵌入海绵(1.15mg/kg顺铂等效物)来处理携带肿瘤的仓鼠。以3天间隔投与两种剂量。处理后，严密监测动物，并且在不知道每个动物接受哪种注射的情况下每隔一定间隔使用卡尺对每个动物进行肿瘤尺寸和体重的测量。根据公式(长度)×(宽度)2/2计算每个时间点的肿瘤体积，其中长轴是长度，短轴是宽度。用CIS-NP嵌入海绵局部处理和游离顺铂腹膜内处理的HCPC1同种异体移植仓鼠的肿瘤抑制和重量改变百分比。
结果
图9A和9B中示出的结果表明，两种处理获得肿瘤尺寸的可比减小，但在纳米粒子的情况下重量损失显著较小，表明在相同功效的情况下较大的安全性。
实例9：合成PEG结合壳聚糖和PEG化壳聚糖纳米粒子
材料和方法
如下文所描述合成PEG结合壳聚糖。制备含有0.1％w/v壳聚糖的5mL乙酸溶液(0.175％v/v)，并且使用1MNaOH将pH调节到6。随后，在室温下在磁性搅拌下将5mgNHS-PEG-COOH添加到壳聚糖溶液中持续3小时。接着将混合物调节到pH7。在氩气氛围下进行反应过夜。接着冻干所得溶液以产生PEG结合壳聚糖。
为了评估结合到PEG的壳聚糖的化学结构，获得偏光傅立叶变换红外(FTIR)光谱以便表征。PEG-NHS中酯-C＝O特有的1713cm-1下峰值在PEG-壳聚糖的FT-IR光谱中消失，这是因为酯键转化成PEG-壳聚糖中的酰胺键。另外，在≈1466cm-1、≈1657cm-1、≈3365cm-1下的峰值的强度增加，这归因于壳聚糖与PEG的交键中的酰胺键形式。结果显示PEG与壳聚糖的成功结合。
PEG化壳聚糖纳米粒子由如下文所描述的PEG结合壳聚糖制备。简单来说，在剧烈搅拌的同时将5mL三聚磷酸盐(TPP)溶液添加到含有0.1％w/vPEG-壳聚糖的10mL乙酸溶液(0.175％v/v)中。在室温下连续搅拌混合物10分钟，产生PEG化CHI-NP。
实例10：在大规模下NP的最佳化
过程自动化是工业生产不可或缺的一部分，因为其通过消除批次间变化和人类误差来实现更快并且更便宜的制造和产品特性标准化。尤其在纳米技术应用中是必需的，在所述应用中，产品特性必须保持在非常有限的公差内。
自动化NP合成的材料和方法：
所有所使用的试剂和化学物质都是赋形剂或医药级的。
溶液A：溶液A：含0.1％顺铂的0.1％三聚磷酸盐(TPP)溶液
溶液B：含0.1％壳聚糖(CL113)的0.175％乙酸溶液
将10mL溶液B放置在玻璃烧杯中并且在磁性搅拌器上以600rpm搅拌。借助于蠕动泵或可以提供恒定流速(如本文所使用，以1.5mL/min)的任何其它泵将总计10mL溶液A逐滴转移到搅拌溶液B上，但其可以改变以产生不同尺寸、电荷、多分散性、NP产率以及药物囊封效率特性。
使用从1:1(如在以上情况下)到1.1:0.85的不同比率的溶液A与溶液B(A:B)。不同混合比率产生不同NP特性。在已转移一半溶液A时将溶液B的搅拌速度逐渐提高到650rpm。当溶液A的转移完成时，将搅拌速度逐渐提高到700rpm，并且接着将二糖海藻糖逐渐添加到溶液中以获得2％的最终海藻糖浓度。继续搅拌直到所有添加的海藻糖溶解(或持续至少10分钟)以平衡溶液。
测量Z平均值、多分散指数(PdI)、每个峰值的平均直径以及所得NP的NP产率(计数率)。
根据所需最终产物，遵循以下步骤中的任一个。
对于储存，将最终NP溶液放置在恰当容器中并且在干冰中或在超低温冷冻器中使用液氮冷冻直到所得全部冷冻，并且接着将其冻干直到所得溶剂全部消除。
为了放置在载体晶片(凯莫辛(ChemoThin)晶片或CTW)中，接着放入最终NP溶液中，在搅拌下逐渐添加含2mL1％壳聚糖G113溶液的1％乙酸(或1％柠檬酸)，并且混合物保持搅拌10分钟。接着将这一混合物放置在恰当容器中并且冻干。如果溶液A与溶液B的比率不同于1:1，那么必须调节待添加的G113壳聚糖量以使得其体积是总NP溶液的10％。
可扩展性为大批量生产所必需。药物运载纳米粒子通过自组装形成于溶液环境中，其是仅在适当化学条件下发生的动态过程。这一技术对制造变量极其敏感，所述变量包括后续溶液的混合速率和其浓度、新鲜度以及纯度。后续溶液的混合速率无法在不牺牲纳米粒子特性的情况下提高到大于某一值。此外，归因于自组装的动态性质，混合过程必须在有限时间内完成，因为这一持续时间的任何延迟都会提高纳米粒子特性或产率相比于最佳值有偏差的可能性。自组装生产方法的敏感性质迫使采用严格控制的分批型制造工艺并且不允许每批次较高生产体积。通过使用小组研发的自动化系统，我们已成功地将初始人工纳米粒子生产工艺调适成自动化版本，并且其现在可以严格地控制所得纳米粒子的特性，包括尺寸、多分散性以及囊封效率。这些参数在药物递送系统的功效以及原料成本方面至关重要。可以调节参数获得最大批料体积与纳米粒子产率(特定生产批次中形成的纳米粒子的数量)之间的平衡，同时保持纳米粒子特性在较窄公差内。发现所得纳米粒子的多分散性完全在可接受的范围内。初始结果证明，在不牺牲纳米粒子特性或产率的情况下可以获得至多70mL的批料体积。此外，有可能并行进行这些成批生产过程以加快生产速度。
纳米粒子调配物的稳定性是必需的。纳米粒子调配物的稳定性测试显示，在不会降低介质中的纳米粒子产率的情况下，从生产开始其在生产介质中稳定长达3小时。此外，有可能在无任何产率下降的情况下通过将天然二糖海藻糖添加到生产介质中将此延长到至少长达4小时。
所述方法涉及冷冻干燥步骤。当设计所述过程后的NP稳定性时，这可能是一个顾虑。为了证明NP在冷冻干燥之后保持类似结构和特性，将冷冻干燥后获得的NP的粉末形式再悬浮于不同pH中。30分钟后，通过泽塔塞泽测量不同pH溶液下NP的尺寸。NP尺寸增加百分比计算如下：(不同pH中的NP尺寸减去冷冻干燥前的NP尺寸)/(冷冻干燥前的NP尺寸)×100。
NP溶液的纯化，即，去除所有过量化合物，如TPP和游离顺铂。在使用30K帕尔纳米赛普过滤装置(PALLNanosepFiltrationDevice)的小规模工艺中，其被证明是成功的。去除大于90％的过量组分并且产生高度纯化的NP产品。至于大规模纯化，所述小组与帕尔生命科学(PALLLifeScience)一起研究小型(Minimate)TFF(切向流过滤)系统。结果显示在1小时内从100ml中去除过量游离化合物。
实例11.含有NP的顺铂的负载能力和细胞摄取
材料和方法
NP的调配物已经最佳化以获得较佳载药能力和囊封效率。通过ICP-AES测定囊封效率(EE％)。简单来说，400uLNP使用帕尔纳米赛普30K过滤器(1100rcf，8分钟，25℃)离心。离心后，收集底部溶液(对应于游离顺铂)和顶部溶液(对应于NP)，并且在以1/100稀释于2％硝酸中之后通过ICP-AES测量这些溶液中的Pt量。使用下式计算EE％：
100-(Pt底留物(mg)×100/Pt总理论值(mg))
在52uM下用FITC标记的NP处理TR-146细胞30分钟，并且通过流动式细胞测量术测量NP的细胞摄取。
结果
结果表明30％的负载能力伴随81％的囊封效率。
结果显示约75％的NP被细胞摄取，如图10中所示。
实例12.壳聚糖的改性
为了增加对壳聚糖纳米粒子的细胞摄取机制以及这些NP在胞内区室中的运输的理解，用各种荧光团合成壳聚糖聚合物。经由壳聚糖聚合物上的胺基，经由酯化学作用结合荧光团(FITC，阿莱克萨(Alexa))(图11)。因为壳聚糖聚合物的胺基在纳米粒子调配和药物囊封方面起主要作用，所以用荧光团使仅约5％的胺基官能化。壳聚糖聚合物还用硫醇基官能化以改良粘膜粘附特性。使用2-亚氨基硫杂环戊烷(图12)。不同于壳聚糖荧光团，通过使用2-亚氨基硫杂环戊烷，正电荷保留在聚合物上，并且引入硫醇端基。
荧光素钠盐(FITC)、2-亚氨基硫杂环戊烷HCL以及N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)购自西格玛-阿尔德里奇(Sigma-Aldrich)。阿莱克萨647羧酸、琥珀酰亚胺酯(阿莱克萨647)购自生命技术。
合成壳聚糖-FITC结合物：将25mg壳聚糖溶解于25ml乙酸水溶液(0.175％，v/v)中，并且用1MNaOH将溶液pH调节到6。向这一溶液中添加1mg含荧光素钠盐的乙醇(10mg/ml)和21mgEDC，并且在室温下搅拌12小时。12小时后，用去矿物质水渗析反应混合物2天，并且冷冻干燥获得所需壳聚糖-FITC结合物。
合成壳聚糖-阿莱克萨结合物：将25mg壳聚糖溶解于25ml乙酸水溶液(0.175％，v/v)中，并且用1MNaOH将溶液pH调节到6。向这一溶液中添加50ul含阿莱克萨647的DMSO(1mg/ml)和21mgEDC，并且在室温下搅拌12小时。12小时后，用去矿物质水渗析反应混合物2天，并且冷冻干燥获得所需壳聚糖-阿莱克萨结合物。
合成硫醇化壳聚糖：将50mg壳聚糖溶解于5ml1％乙酸中，并且用1MNaOH将溶液pH调节到6。向这一溶液中添加20mg2-亚氨基硫杂环戊烷HCl，并且在室温下搅拌反应混合物24小时。反应完成后，反应混合物用5mMHCl渗析，用含有1％NaCl的5mMHCl、5mMHCl渗析两次，并且最后用0.4mMHCl渗析。透析后，冷冻干燥反应混合物以获得固体硫醇改性的壳聚糖。
实例13：以高通量方式加速合成NP嵌入晶片
使用各种冻干形式进行实验，并且发现最佳一个是12孔盘。
材料和方法
试剂：晶片溶液、液氮、12孔盘、冻干器。
方案：通过离子胶凝方法，通过将顺铂逐滴添加到壳聚糖溶液中首先合成顺铂囊封NP。接着搅拌混合物10分钟。搅拌工艺后，接着将含谷氨酸壳聚糖(G113)溶液的1％乙酸溶液添加到其中，并且搅拌额外的1分钟。接着将这一混合物转移到12孔盘中，每孔4ml。冷冻工艺在液氮中进行30分钟，继而冻干2天。
结果
这一平台使可再生性最大化并且允许精确控制晶片形状和每个晶片中的药物量。另外，已进行实验探究冷冻晶片的替代方法。发现在液氮中冷冻晶片溶液30分钟产生与在干冰上将其冷冻3小时相同的效果。所述工艺产生12个晶片单一个，并且在冷冻时间内缩减83％。
实例14：将甜味剂和味道掩蔽剂的最佳化调配物并入NP嵌入晶片中。
存在与顺铂相关的令人不愉快的金属味道。这令人不愉快的并且常常不能忍受的味道可能大大降低化学疗法患者的生活品质，并且给顺铂的局部投与造成显著障碍。进行严格实验以测定可以并入NP嵌入晶片方案的甜味剂和味道掩蔽剂的最佳调配物，同时使改变减到最小。在各种条件下测试许多调味剂和甜味剂调配物。这一实验的目标是确定用于隐藏顺铂的金属味道的调味剂/掩蔽剂的最佳组合。
材料和方法
六种不同调味剂样品和一种拆分剂获自威尔德调味剂公司(WILDFlavors)。粉末状蔗糖素和怡滋甜(EZ-Sweetz)购自Amazon.com，并且温和铁(GentleIron)补充剂购自维生素专柜(VitaminShoppe)。
所使用的试剂和设备：
水果果汁调味剂
热带果汁调味剂
橙子霜调味剂
橙子奶昔调味剂
胡椒薄荷调味剂
香草薄荷调味剂
拆分剂
25mg温和铁胶囊(以测试顺铂调味剂)
怡滋甜
粉末状蔗糖素
结果
在6种不同参数下测试每种调味剂：
1滴调味剂+2ml5％铁溶液
1滴调味剂+2ml5％铁溶液+1滴怡滋甜
1滴调味剂+2ml5％铁溶液+1滴42mg/ml蔗糖素溶液
1滴调味剂+2ml5％铁溶液+1滴拆分剂
1滴调味剂+2ml5％铁溶液+1滴怡滋甜+1滴拆分剂
1滴调味剂+2ml5％铁溶液+1滴42mg/ml蔗糖素溶液+1滴拆分剂
几乎所有组合都产生完全掩盖了强烈的金属味道的溶液。当将怡滋甜添加到大多数调味剂中时，其味道太强达到仅品尝甜度的程度。一些是如此甜；其难以吞咽。另外，当与怡滋甜组合时，拆分剂对一些调味剂具有非常重要的作用。其不仅降低甜度，通过拆分剂还使6个测试组合中的5个的核心味道增强(例如，胡椒薄荷更加显著)。6种调味剂中的5种的最佳结果来自怡滋甜与拆分剂的组合。
实例15.渗透增强剂的最佳化以及渗透增强剂到晶片中的并入
本研究为测定嵌入晶片中的顺铂囊封NP可以渗透猪舌中的渗透深度。平台技术可以在纳米粒子表面添加各种类型的渗透增强剂或混合进入海绵基质中。平台的灵活性可以产生具有可以渗透不同深度组织的渗透增强剂的各种组合的文库。可以使用逐层方法将如胆酸的带负电荷的渗透增强剂添加到纳米粒子的表面上。
材料和方法
使用FITC标记的壳聚糖NP。
使用以下渗透增强剂(“PE”)：
a)无PE(仅PBS)
b)乙醇(用50％PBS稀释的100％乙醇)
c)2-二甲基氨基丙酸十二烷基酯(DDAIP)(“DDAIP”)(2g/100ml稀释于PBS中)
d)乙醇+DDAIP(用4g/100mlDDAIP稀释的100％乙醇，以获得与分别在(b)和(c)中所使用的乙醇和DDAIP相同的最终工作浓度。
e)TDCA(100mM稀释于PBS中)
举例来说，选择脱氧胆酸(DCA)钠。将2.4mL含有顺铂(1mg/mL)的TPP溶液缓慢添加到3mL壳聚糖溶液(乙酸溶液0.175％v/v)中。通过迅速将60uLDCA(1.6mg/mL)添加到混合物中来进行渗透增强剂(在此情况下，DCA)的逐层涂布。接着在室温下剧烈搅拌溶液10分钟，并且获得DCA涂布的顺铂囊封纳米粒子(DCA涂布的CIS-NP)。
或者，将1mL含有1％壳聚糖的1％w/v柠檬酸溶液和10mg脱氧胆酸(DCA)钠添加到1mLCHI-NP溶液中。接着在-80℃下冷冻所得溶液并且冻干2天以获得DCA/CIS-NP嵌入海绵。
新鲜猪舌获自剑桥(Cambridge)的屠夫商店(Butchershop)。选择舌头的中间部分用于这些研究。在这一部分上选择5个指定切片，并且在这些切片中的每一个处施加0.75mL这些PE中的每一种，继而添加晶片(每个25mg)，其中在晶片顶部上具有额外0.75mL的PE。在暗处在室温下进行培育1小时。接着用水洗涤舌头，并且从其指定切片中去除所有晶片。各个切片单独切割并且嵌入OCT中以用于使用超薄切片机切片。从这些切片中的每一个切割50微米切片，并且将2个切片放置在载玻片上。载玻片浸没在水中保持3小时以去除任何结合OCT，因为其干扰图像质量。之后，使用含有封固介质的DAPI给不同切片的载玻片中的每一个安装有盖玻片，并且使用荧光显微镜进行成像。在4×、10×和20×下，在两个FITC和DAPI通道中获取图像。另外，还切割未经处理的舌头的切片并且成像以解释舌头的固有荧光。然而，在进行渗透研究之前，进行许多实验以发现将不会使当前晶片合成方案显著改变并且允许无缝集成晶片的PE最佳浓度。
结果
研究结果显示DDAIP是最有效的渗透增强剂(表8)。
表8：渗透增强剂和渗透深度
渗透增强剂-(PE)(如果存在) 渗透深度(微米)
对照 NA
PBS(无PE) 70
乙醇 140
DDAIP 200
TDCA 100
乙醇+DDAIP 100
口腔药物递送的主要挑战中的一个是确保药物成功地绕过颊内屏障到达其标靶位点。两个最显要的屏障是脂质屏障和基膜。脂质屏障存在于上部上皮中并且由膜被颗粒和紧密连接组成，而基膜在上皮中更深并且由阻止大分子进入的细胞外基质蛋白质组成。尽管壳聚糖其本身就是一种渗透增强剂，但其无法渗透足够深进入上皮中(如表8中所示的70μm)以便充分递送药物。其阳离子特性与带负电细胞膜相互作用，破坏脂质屏障并且增加渗透。当DDAIP-HC1用作PE时，NP渗透的最大深度是200μm，远超出基膜屏障(约100μm)。DDAIP-HC1是已显示改变细胞脂双层的动力学并且松散细胞之间的紧密连接、增加渗透的亲水性分子。研究还显示，DDAIPNP遵循渗透的旁细胞路径，意指NP使用细胞之间的细胞内空间以更深地进入上皮。
这些结果显示，壳聚糖和DDAIP-HCl能够克服脂质屏障和基膜，足够渗透上皮到达甚至较深的肿瘤。

Claims (24)

1.一种用于将药剂递送到粘膜腔中的部位的调配物，所述调配物包含
粘膜粘附聚合基质，其具有并入其中的含有治疗剂、防治剂、诊断剂或营养药剂的纳米粒子，其味道被掩蔽或在所述粘膜腔中释放后靶向组织，
其中所述基质具有至少两个表面，用于接触所述口腔中的部位以递送所述药剂的第一表面，以及暴露于所述口腔的第二表面，
其中所述基质的所述第一表面包含在所述基质的表面上具有一定分子量和密度的聚合材料以促进所述纳米粒子穿过所述口腔的粘膜，以及
其中所述基质的所述第二表面包含对待递送药剂来说不可渗透穿过的涂层或膜。
2.如权利要求1所述的调配物，其中所述基质包含具有并入其中的药剂的壳聚糖或环糊精的纳米粒子。
3.如权利要求1所述的调配物，其中所述涂层或膜由选自由以下组成的群组的聚合物形成：羟丙基甲基纤维素、乙酸纤维素以及聚丙烯酰胺。
4.如权利要求1所述的调配物，其中所述纳米粒子的直径在约60nm与450nm之间。
5.如权利要求1所述的调配物，其中所述纳米粒子涂布有聚二醇部分以增强通过所述粘膜到达所述递送部位的渗透。
6.如权利要求1所述的调配物，其中所述纳米粒子在其表面上包含靶向部分以引导所述纳米粒子到达所述药剂递送部位。
7.如权利要求1所述的调配物，其中所述基质包含附着肽，其有效地使所述基质粘着到所述药剂的待递送部位的组织上。
8.如权利要求1所述的调配物，其中所述药剂选自由以下组成的群组：化学治疗剂、抗感染剂、抗炎剂、免疫调节剂、疫苗以及其组合。
9.如权利要求8所述的调配物，其中所述抗感染剂选自由以下组成的群组：抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂以及其组合。
10.如权利要求1所述的调配物，其中所述诊断剂是选自由以下组成的群组的成像剂：氧化铁、钆络合物、放射性同位素、金以及其组合。
11.如权利要求1所述的调配物，其中所述药剂是铂基化学治疗剂。
12.如权利要求1所述的调配物，其进一步包含一种或多种渗透增强剂。
13.如权利要求12所述的调配物，其中所述渗透增强剂选自由以下组成的群组：2-二甲基氨基丙酸十二烷基酯、聚乙二醇、柠檬酸、胆汁盐以及β-环糊精。
14.如权利要求1所述的调配物，其包含一种或多种味道掩蔽剂。
15.如权利要求14所述的调配物，其中所述味道掩蔽剂选自由以下组成的群组：柠檬酸、甜味剂以及食品调味剂。
16.如权利要求1所述的调配物，其进一步包含抗炎剂或抗氧化剂。
17.如权利要求5所述的调配物，其中所述聚二醇部分是分子量小于10,000Da的聚乙二醇。
18.如权利要求6所述的调配物，其中所述部分是RGD肽。
19.如权利要求1所述的调配物，其中所述聚合基质材料是壳聚糖，所述壳聚糖味道掩蔽所述待递送药剂并且所述壳聚糖在暴露于所述口腔的pH后释放所述纳米粒子。
20.如权利要求19所述的调配物，其中所述纳米粒子在暴露于所述口腔的pH后释放化学治疗剂或诊断剂。
21.一种将药剂递送到粘膜腔中的部位的方法，其包含向区域投与如权利要求1到20中任一权利要求所述的调配物。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述部位包含癌细胞。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述部位包含口腔、颊内或舌下粘膜。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述药剂以不会引起所述药剂的全身性有效水平的剂量递送。
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