CN114958862B - 检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法 - Google Patents
检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114958862B CN114958862B CN202210562063.0A CN202210562063A CN114958862B CN 114958862 B CN114958862 B CN 114958862B CN 202210562063 A CN202210562063 A CN 202210562063A CN 114958862 B CN114958862 B CN 114958862B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- feed
- culture
- stage
- culture medium
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 11
- 206010048302 Tubulointerstitial nephritis Diseases 0.000 title abstract description 10
- 231100000850 chronic interstitial nephritis Toxicity 0.000 title abstract description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 82
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 40
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 9
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 44
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 44
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 39
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 34
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 31
- 101150051118 PTM1 gene Proteins 0.000 claims description 23
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 22
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 21
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 16
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 13
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 11
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 11
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 8
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000037351 starvation Effects 0.000 claims description 5
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical group CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 abstract description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 abstract description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 22
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 17
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 11
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 7
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 7
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 5
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- 101100241858 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) OAC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 101150092906 pmt1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4717—Plasma globulins, lactoglobulin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。本发明提供了利用重组毕赤酵母高效地发酵生产β2‑微球蛋白的方法。与重组大肠杆菌表达系统相比，本发明克服了易形成包涵体、复性困难且易丧失免疫学活性等问题。甲醇作为诱导碳源促使AOX1基因的表达，从而提高了目的蛋白的表达量。增加发酵液氮源含量，采用恒流加补充尿素和分批补充蛋白胨，并用氨水控制最适pH的方法，维持适宜的碳氮比，为目的产物的合成提供所需的物质。本发明诱导时长缩短、补料速率提升，使得外源蛋白降解情况好转，相同诱导时间表达量提高。并且结果相关性好，准确度高，能够准确地表征抗原浓度的变化，且操作简单、临床应用广泛。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。
背景技术
β2-微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11.8KDa，由99个氨基酸组成的单链球蛋白。广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。Wibell发现血中β2-微球蛋白与肌酐有明显的正相关，揭示了血、尿中β2-微球蛋白是检测肾功能的灵敏指标。相较于其他传统的肾脏功能检测指标，β2-微球蛋白在肾病初期就能被检测出来，更适合作为早期肾脏疾病的临床诊断标志物。人体内肾近曲小管对β2-微球蛋白的重吸收率达到99％以上，正常情况下β2-微球蛋白从体内的排出水平极低，一般临床检测尿样中β2-微球蛋白的参考范围是0mg/L～0.3mg/L，在血液或血浆样本中最高含量为2.4mg/L。
该β2-微球蛋白可与包被在胶乳颗粒上的羊抗人β2-微球蛋白IgG结合产生浊度，在546nm处检测反应吸光度，吸光度值与β2-微球蛋白的浓度成正相关。通过乳胶免疫比浊法对血液和尿液中β2-微球蛋白进行测定最大优点是结果相关性好，准确度高，能够准确地表征抗原浓度的变化。此外，这种方法操作简单、临床应用广泛。
β2-微球蛋白的检测分为血液和尿液检测。检测血液中β2-微球蛋白的含量可以提前发现肾小球的病变、高血压患者的肾功能前期受损情况，观察肾脏移植的排斥反应，它也是反映长期血透患者淀粉样变性的指标。检测尿液中β2-微球蛋白含量来评定肾脏功能时，首先要检测血液中β2-微球蛋白的含量，排除引起血液中β2-微球蛋白含量增高的疾病。当血液中β2-微球蛋白含量正常，但尿液中β2-微球蛋白含量增高时，可进一步判断肾小管、肾小球功能是否正常、以及进行尿路感染定位等肾功能相关疾病的诊断。推进β2-微球蛋白标准化，研制β2-微球蛋白标准物质，对肾脏疾病早期诊断、病情预判以及后期治疗均有重要意义。
现存的制备方法的缺点表现在：诱导时间较长、补料速率的低、细胞表达量低、导致产量低并且表达出的蛋白准确度较低，不能够准确地表征抗原浓度变化，易形成包涵体、而且复性困难且易丧失免疫学活性，同时操作难度大，因此临床应用范围小。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。
本发明提供了编码β2-微球蛋白的核酸，其具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明还提供了包括所述的核酸的质粒载体。
本发明提供了表达β2-微球蛋白的酵母，其表达如SEQ ID NO.1所示的核酸。
本发明提供的重组毕赤酵母，通过多次发酵试验，结果表明构建好的工程菌株抗原产量较高、稳定性较强。
本发明还提供了重组毕赤酵母菌株的构建方法：将质粒载体转化到酵母，所述方法具体包括扩增结束后，通过SDS-PAGE电泳筛选出我们所需要的目的条带进行回收，对获得的核酸序列进行测序分析后，对获得的正确的基因序列进行重组构建，并后期通过对获得的诸多重组工程菌进行小样测试诱导蛋白的表达，对表达量较高的工程菌继续上罐验证，最终获得重组毕赤酵母。
本发明还提供了β2-微球蛋白的制备方法，所述方法包括培养所述酵母，诱导蛋白表达。
本发明所述的方法，其中：所述起始生长阶段：温度为26℃～32℃，所述起始生长阶段包括：通过三区划线挑取单菌落于YNB培养基中，得到一级种子液；然后，取一级种子液接入BMGY培养基中，得到二级种子液。
所述起始生长阶段以MD固体培养基划线培养所述的酵母，以YNB培养基进行一级种子制备，以BMGY培养基进行二级种子制备。
一些具体实施例中，所述起始生长阶段：温度为28℃。
本发明所述的方法，其中：所述富集培养阶段，控制pH值为6.0±0.2，所述流加补料I维持发酵液溶氧为30％±5％；所述富集培养阶段以补料III控制pH值，然后流加补料I，所述补料I包括甘油和PTM1微量元素溶液，所述补料III为25vol％的氨水。本发明所述富集培养阶段中使用的含PTM1微量元素溶液的甘油，其中PTM1微量元素溶液的添加量为每1L的50％甘油中加入5ml。
一些实施例中，所述富集培养阶段：温度为30℃±1℃，初始搅拌转速为300rpm，通气量为1.0vvm，通过调节搅拌转速，维持发酵液溶氧为30％以上，搅拌转速不超过750rpm，发酵液的pH值为6.0。
另一些实施例中，所述富集培养阶段：温度为30℃±1℃，初始搅拌转速为300rpm，通气量为0.8vvm～1.5vvm，通过调节搅拌转速，维持发酵液溶氧维持在30％±5％，搅拌转速不超过750rpm，发酵液的pH值为6.0±2。
一些具体实施例中，所述富集培养阶段包括将本发明制得的种子液接种至用氨水调pH为6.0±0.2的BSM2发酵培养基中，溶氧下降又升高至50％，流加含PTM1的甘油，调节流加速率使发酵液溶氧维持在30％±5％，当酵母湿重达到诱导条件，停止流加含PTM1的甘油，最后，确保培养基中甘油全部耗尽，开始诱导重组毕赤酵母表达。
一些具体实施例中，所述富集培养阶段，搅拌转速达到750rpm～850rpm，溶氧下降又升高至50％以上，流加补料I以维持溶氧为30％±5％，直至酵母湿重达到150g/L～250g/L，停止流加补料Ⅰ，饥饿培养耗尽甘油，结束富集培养阶段。
另一些具体实施例中，所述富集培养阶段，搅拌转速达到750rpm，溶氧下降又升高至50％以上，流加补料I以维持溶氧为30％±5％，直至酵母湿重达到150g/L～200g/L，停止流加补料Ⅰ，饥饿培养耗尽甘油，结束富集培养阶段。
一些实施例中，所述诱导培养阶段：温度为28℃±1℃，pH为5.8～6.2，通气量为0.8vvm～1.5vvm。一些具体实施例中，所述诱导培养阶段：温度为26℃，pH为5.8～6.2，通气量为0.8vvm～1.5vvm。
本发明所述诱导培养阶段，补料V的加入量为发酵体积的3.5％，所述流加补料II维持发酵液溶氧为30％±5％，所述补料IV的流速为2ml/h/L，所述补料VI的流速为2.4ml/h/L，诱导48h后，再次加入发酵体积的3.5％的补料V。
所述诱导培养阶段加入补料V后，流加补料II、补料Ⅳ和补料VI，所述补料II包括100％甲醇和PTM1微量元素溶液；所述补料Ⅳ为15wt％的尿素溶液；所述补料V为200g/L蛋白胨溶液；所述补料VI为150g/L的硫酸镁溶液。一些具体实施例中，所述补料II中PTM1微量元素溶液的添加量为每1L甲醇溶液中加入12ml。
一些具体实施例中，所述诱导培养阶段包括：将发酵温度降温至28℃，补加一次蛋白胨，开始同时流加含PTM1的甲醇、尿素；待诱导至48h时，再次补加蛋白胨，整个诱导过程通过调节含PTM1的甲醇流加速率使发酵液溶氧维持在30％±5％，整个诱导周期为96h。
本发明中溶氧条件包括：
一些实施例中，所述富集培养阶段发酵液溶氧为30％±5％；所述诱导培养阶段发酵液溶氧为30％±5％。
一些具体实施例中，所述富集培养阶段发酵液溶氧为30％±3％；所述诱导培养阶段发酵液溶氧为30％±3％。
一些具体实施例中，所述富集培养阶段发酵液溶氧为30％±1％；所述诱导培养阶段发酵液溶氧为30％±1％。
一个具体实施例中，所述富集培养阶段发酵液溶氧为30％；所述诱导培养阶段发酵液溶氧为30％。
本发明所述的方法，还包括收集上清、浓缩、疏水层析和离子交换层析的步骤，
所述浓缩采用分子量为3kDa的中空纤维柱；
所述疏水层析的柱填料为Phenyl；
所述离子交换层析的柱填料为DEAE。
本发明所述浓缩洗滤提纯及样品后处理过程包括浓缩洗滤、疏水层析、离子交换层析、样品后处理四个阶段；
所述浓缩洗滤包括采用中空纤维柱浓缩酵母上清，然后用NaCl粗纯处理，离心过滤后，用20mMTris-HClpH7.5缓冲液进行洗滤。
所述疏水层析包括用过滤纯化水冲洗填料后，使用NaCl平衡层析柱，调节上样速率将样品在低流速下缓慢上样，后用平衡缓冲液HCl和NaCl冲洗平衡层析柱，最后用HCl进行目的蛋白的解离，并收集。
所述离子交换层析包括用过滤纯化水冲洗填料后，使用HCl平衡层析柱，调节上样速率将获得的解离目的蛋白样品在低流速下缓慢上样，后用平衡缓冲液HCl冲洗平衡层析柱，用HCl和NaCl进行目的蛋白的解离，并收集。
所述样品后处理包括将离子交换层析后的样品用微量紫外分光光度计进行蛋白浓度测定和调节，调节好浓度的样品根据样品体积添加P300，搅拌混匀后，-20℃分装存放。
一些具体实施例中，所述β2-微球蛋白的分离纯化包括：
步骤1：浓缩洗滤
采用中空纤维柱将过滤后的酵母上清进行浓缩，浓缩后的样品用NaCl进一步粗纯处理，离心过滤后，使用20mM Tris-HCl pH7.5缓冲液进行洗滤。
步骤2：疏水层析
用过滤纯化水冲洗填料后，使用20mM Tris-HCl+1M NaCl pH7.5平衡层析柱，调节上样速率将洗滤后的样品在低流速下缓慢上样，待样品上样完毕后用平衡缓冲液20mMTris-HCl+1M NaCl pH7.5冲洗平衡层析柱，平衡至电导和紫外峰平衡，用20mM Tris-HClpH7.5进行目的蛋白的解离，并收集。
步骤3：离子交换层析
用过滤纯化水冲洗填料后，使用20mM Tris-HCl pH8.5平衡层析柱，调节上样速率将获得的解离目的蛋白样品在低流速下缓慢上样，待样品上样完毕后用平衡缓冲液20mMTris-HCl pH8.5冲洗平衡层析柱，平衡至电导和紫外峰平衡，用20mM Tris-HCl+1M NaClpH8.5进行目的蛋白的解离，并收集。
步骤4：样品后处理
将离子交换层析后的样品用微量紫外分光光度计进行蛋白浓度测定和调节，调节好浓度的样品根据样品体积添加P300，搅拌混匀后，-20℃分装存放。
本发明提供了使用甲醇作为碳源诱导表达的方法，所述方法具体为将发酵温度降温至28℃，补加一次蛋白胨，开始同时流加含PTM1的甲醇，尿素；待诱导至48h时，再次补加蛋白胨，整个诱导过程通过调节含PTM1的甲醇流加速率使发酵液溶氧维持在30％±5％，整个诱导周期为96h。
本发明还提供了一种预防和/或治疗慢性间质性肾炎的重组抗原疫苗，所述重组抗原疫苗包含有效剂量的本发明所述的β2-微球蛋白重组抗原和药学上可接受的载体。
本发明还提供了所述的重组蛋白疫苗在制备预防和/或治疗慢性间质性肾炎疫苗中的应用。
本发明所述补料培养基包括：补料Ⅰ(50％甘油630.5g/L、PTMI 5ml/L)、补料II(100％甲醇、PTM1 12ml/L)、补料Ⅲ(25％氨水)、补料Ⅳ(15％尿素)、补料Ⅴ(蛋白胨200g/L)和补料VI(硫酸镁150g/L)。
本发明还提供了预防和/或治疗慢性间质性肾炎的方法，其包括给予本发明所述的疫苗。
本发明在传统的重组毕赤酵母发酵条件的基础上，对发酵培养基成分和培养条件进行了优化改进。本发明提供的利用重组毕赤酵母高效地发酵生产β2-微球蛋白方法，其优点包括：①与重组大肠杆菌表达系统相比，克服了易形成包涵体、复性困难且易丧失免疫学活性的问题。②诱导阶段甲醇作为诱导碳源促使AOX1基因的表达，提高目的蛋白的表达量。③增加发酵液氮源含量，采用恒流加补充尿素和分批补充蛋白胨，并用氨水控制最适pH的方法，维持适宜的碳氮比，为目的产物的合成提供所需的调节物和前体物质。④诱导时长的缩短、补料速率的提升，使得外源蛋白降解情况较为好转，相同诱导时间表达量有所提高。通过乳胶免疫比浊法对血液和尿液中β2-微球蛋白进行测定最大优点是结果相关性好，准确度高，能够准确地表征抗原浓度的变化。此外，这种方法操作简单、临床应用广泛。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1示分批补料发酵每隔12h湿重变化趋势和上清蛋白浓度变化趋势；
图2示不同诱导阶段蛋白表达电泳图；图注：1～8泳道分别为诱导12h,24h,36h,48h,50h,72h,84h,96h后的电泳结果；
图3示疏水纯化后的蛋白电泳结果；图注：1～4泳道为前处理样品分别为上清原液、浓缩液、洗滤液、洗滤流穿液；5～7泳道为疏水纯化后样品分别为上样液、流穿液、解离液；
图4示离子交换纯化后的蛋白电泳结果；图注：1泳道为上样液、2泳道为流穿液、3～5泳道分别为10％、20％、100％目的蛋白解离液；
图5示菌体生长曲线；
图6示上清液中蛋白浓度变化曲线；
图7示不同组间、批次上清蛋白表达量；
图8示不同组间、批次β2微球蛋白表达量。
具体实施方式
本发明提供了检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了优化后的编码β2-MG蛋白的核酸序列：atgtccagatccgttgctttggctgttttggccttgttgtctttgtctggtttggaggctatccagagaaccccaaagattcaggtctactccagacatccagctgagaacggaaagtccaacttcctgaactgttacgtgtccggttttcacccatccgacattgaggttgacttgctgaagaacggtgagagaatcgagaaggttgaacactccgacctgtccttctcaaaggactggtctttctacctgctgtactacactgagttcaccccaactgaaaaggacgagtacgcctgtagagttaaccacgttactttgtcccagccaaagatcgtcaagtgggacagagatatg(SEQ ID NO:1)
本发明所述的方法包括起始生长阶段、富集培养阶段和诱导培养阶段：
所述起始生长阶段的培养基包括MD培养基、YNB培养基和BMGY培养基培养；
所述富集培养阶段和所述诱导阶段的培养基包括BSM2培养基、PTM1、Biotin和YNB培养基。
本发明所述的方法，其中：
所述MD平板培养基组分包括：C6H12O6 20.0g/L、琼脂粉20.0g/L、500×Biotin(生物素200mg/L)和10×YNB(无氨基酵母氮源134g/L)
一些实施例中，所述MD平板培养基组分包括：C6H12O6 10.0g/L～30.0g/L、琼脂粉10.0g/L～30.0g/L、10×YNB 50.0ml/L～150.0ml/L和500×Biotin 1.0ml/L～5.0ml/L。
另一些实施例中，所述MD平板培养基组分包括：C6H12O6 5.0g/L～25.0g/L、琼脂粉15.0g/L～25.0g/L、10×YNB 75.0ml/L～120.0ml/L和500×Biotin 1.0ml/L～3.0ml/L。
一些具体实施例中，所述MD平板培养基组分包括：C6H12O6 15.0g/L～25.0g/L、琼脂粉18.0g/L～22.0g/L、10×YNB 95.0ml/L～105.0ml/L和500×Biotin 1.5ml/L～2.2ml/L。
所述YNB培养基组分包括：无氨基酵母氮源134.0g/L；
所述BMGY培养基组分包括：蛋白胨20.0g/L、酵母提取物10.0g/L、KH2PO411.8g/L、K2HPO4·3H2O 3.0g/L、甘油10.0ml/L、10×YNB 100.0ml/L和500×Biotin 2.0ml/L；
一些实施例中，所述BMGY培养基组分包括：蛋白胨10.0g/L～30.0g/L、酵母提取物0～20.0g/L、KH2PO410g/L～12g/L、K2HPO4·3H2O 2.0g/L～5.0g/L、甘油5.0ml/L～15.0ml/L、10×YNB 100.0ml/L和500×Biotin 2.0ml/L；
另一些实施例中，所述BMGY培养基组分包括：蛋白胨15.0g/L～25.0g/L、酵母提取物5.0～15.0g/L、KH2PO411g/L～12g/L、K2HPO4·3H2O 2.0g/L～3.5g/L、甘油7.0ml/L～12.0ml/L、10×YNB 100.0ml/L和500×Biotin 2.0ml/L；
所述BSM2培养基组分包括：85％H3PO4 22.7ml/L、CaSO4·2H2O 0.83g/L、K2SO420.2g/L、(NH4)2SO4 15.0g/L、KOH 3.13g/L、甘油50.0ml/L、MgSO4·7H2O 16.9g/L、PTM16.0ml/L、500×Biotin 2.0ml/L和10×YNB 20.0ml/L。
一些实施例中，所述BSM2培养基组分包括：85％H3PO4 20ml/L～30ml/L、CaSO4·2H2O 0.5g/L～2.0g/L、K2SO4 15g/L～25g/L、(NH4)2SO4 10.0g/L～25g/L、KOH 2g/L～5g/L、甘油35.0ml/L～75ml/L、MgSO4·7H2O 15g/L～20g/L、PTM1 5.0ml/L～10.0ml/L、500×Biotin 2.0ml/L和10×YNB 20.0ml/L。
另一些实施例中，所述BSM2培养基组分包括：85％H3PO4 20ml/L～25ml/L、CaSO4·2H2O 0.7g/L～1.5g/L、K2SO4 20g/L～23g/L、(NH4)2SO4 12g/L～17g/L、KOH 2g/L～4g/L、甘油45.0ml/L～55ml/L、MgSO4·7H2O 16g/L～18g/L、PTM1 5.5ml/L～8.0ml/L、500×Biotin2.0ml/L和10×YNB 20.0ml/L。
本发明所述PMT1组分包括：CuSO4·5H2O 8g/L、KI 0.188g/L、MnSO4·H2O 3g/L、Na2MoO4·2H2O 0.2g/L、H3BO3 0.12g/L、CoCl2·6H2O 0.15g/L、ZnCl2 30g/L、FeSO4·7H2O65g/L、Biotin 0.25g/L和浓H2SO4 8ml/L。
本发明发酵培养提供了一种发酵培养重组毕赤酵母的方法，所述方法包括以下两个步骤。
步骤一：
1、采用20L发酵罐，按照5％的接种量将400ml种子液接种于8L BSM2发酵初始培养基中，初始搅拌转速300rpm，通气量1vvm，罐压0.05MPa，30℃，pH6.0培养至溶氧突升，培养过程中，当溶氧下降至30％以下时，逐级提升转速至750rpm。
2、流加补料Ⅰ，控制流加速率使溶氧维持在30％左右，完成后取样测定湿重约180.0g/L，整个过程约24h。
3、饥饿2h后，降温至28℃，添加补料Ⅴ315ml，接着补料Ⅳ以2ml/h/L的速率流加，同时，流加补料II控制流加速率，使溶氧维持在30％±5％，持续进行至72h。
4、再次添加补料Ⅴ420ml，接着补料Ⅳ以2ml/h/L的速率流加，补料VI以2.4ml/h/L的速率流加，流加补料液II控制速率使溶氧维持在30％±5％，维持进行至120h。
5、从发酵培养基接种开始，每隔12h对发酵液取样，进行湿重、上清蛋白浓度、电泳分析。从发酵罐中取发酵液30ml，用已知重量的离心管10000rpm离心10分钟。
湿重测定：弃上清后称重，总重量减去离心管重量即为湿重。
上清蛋白浓度测定：取上清采用G250法测定蛋白浓度。
电泳：采用15％SDS-PAGE变性还原胶分析。
步骤二：
1、取重组酵母发酵液1000ml，使用3KD中空纤维柱浓缩至原体积的1/10，得到100ml浓缩液，经粗纯离心过滤和洗滤后，得到蛋白浓度为16.5mg/ml的样品。
2、取70ml洗滤后的蛋白样品进行疏水层析，并用100％的20mM Tris-HCl pH7.5解离缓冲液进行目的蛋白的解离，疏水层析过程中收集流穿液和解离液。最后各取20μl上样样品，流穿液和解离液，进行15％SDS-PAGE变性还原胶分析。
3、取45ml疏水层析后的样品进行离子交换层析，并分别用10％、20％、100％的20mM Tris-HCl+1M NaCl pH8.5解离缓冲液进行目的蛋白的解离，离子交换层析过程中收集流穿液和解离液。最后各取20μl上样样品，流穿液和解离液，进行15％SDS-PAGE变性还原胶分析。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1重组酵母的构建方法
1、序列优化
在NCBI中进行信息检索，获得β2-微球蛋白的基因序列，根据毕赤酵母密码子偏好性对该段基因序列进行优化。
2、引物设计
在β2-微球蛋白的基因序列5’端插入含SnaB I限制性内切酶酶切位点引物序列，在3’端插入含EcoR I和Sac I限制性内切酶酶切位点引物序列，经PCR扩增后与pPIC9K质粒相连，并保存于大肠杆菌中。
3、重组毕赤酵母制备
向150ml LB培养基中加入150μl卡那霉素和150μl保存的大肠杆菌菌液，37℃，230rpm培养约4h～5h，当菌液OD600约在0.6～0.8之间时，进行质粒提取，用Sac I限制性内切酶进行单酶切，线性化质粒经DNA凝胶电泳、切胶回收后，-20℃保存。将GS115毕赤酵母制备成感受态酵母细胞后与线性化重组质粒混合，将混合液加入电转杯，转化结束后，在28℃的培养箱中静置2h后，取50μl菌液涂布在MD平板上，28℃，培养24h。挑取阳性转化子，提取质粒进行酶切鉴定和测序，并进行小样诱导表达确认后，最终得到产β2-微球蛋白的重组毕赤酵母。
实施例2菌株培养方法
1、平板划线
MD平板培养基组分：C6H12O6 20.0g/L、琼脂粉20.0g/L、10×YNB(无氨基酵母氮源134g/L)100.0ml/L、500×Biotin(生物素200mg/L)2.0ml/L。
按无菌操作要求，用接种环蘸取BMG酵母甘油菌在MD平板培养基上进行划线，将平板置于恒温培养箱中28℃培养24h，获得BMG酵母单菌落。
2、一级种子制备
YNB培养基组分：蛋白胨20.0g/L、酵母提取物10.0g/L、C6H12O6 20.0g/L。
按无菌操作要求，挑取单菌落置于YNB培养基中，在180rpm，28℃的环境中培养24h，OD600＞3.0。
3、二级种子制备
BMGY培养基组分：蛋白胨20.0g/L、酵母提取物10.0g/L、KH2PO411.8g/L、K2HPO4·3H2O 3.0g/L、甘油10.0ml/L、10×YNB(无氨基酵母氮源134g/L)100.0ml/L、500×Biotin(生物素200mg/L)2.0ml/L。
按无菌操作要求，以10％的接种量取一级种子液接入BMGY培养基中，在180rpm，28℃的环境中培养15h～24h，2.0＜OD600＜6.0。
4、富集培养
BSM2培养基组分：85％H3PO422.7ml/L、CaSO4·2H2O 0.83g/L、K2SO420.2g/L、(NH4)2SO4 15.0g/L、KOH 3.13g/L、甘油50.0ml/L、MgSO4·7H2O 16.9g/L、PTM1 6.0ml/L、500×Biotin(生物素200mg/L)2.0ml/L、10×YNB(无氨基酵母氮源134g/L)20.0ml/L。
PMT1组分：CuSO4·5H2O 8g/L、KI 0.188g/L、MnSO4·H2O 3g/L、Na2MoO4·2H2O0.2g/L、H3BO3 0.12g/L、CoCl2·6H2O 0.15g/L、ZnCl2 30g/L、FeSO4·7H2O 65g/L、Biotin(生物素200mg/L)0.25g/L、浓H2SO4 8ml/L。
补料培养基：补料Ⅰ(50％甘油 630.5g/L、PTMI 5ml/L)、补料II(100％甲醇、PTM112ml/L)、补料Ⅲ(25vol％氨水)、补料Ⅳ(15％尿素)、补料Ⅴ(蛋白胨200g/L)、补料VI(硫酸镁150g/L)
将BSM2培养基加入到发酵罐内，121℃，30min灭菌，待发酵罐内的培养基冷却到室温时，每升培养基添加PTM1 1.5ml，500×Biotin(生物素200mg/L)2ml以及10×YNB(无氨基酵母氮源134g/L)20ml，使用25％的氨水维持培养基的pH为6.0。按照5％的接种量将步骤3所制的种子液接种到发酵罐中，开始发酵培养。发酵罐参数设置为初始搅拌转速300rpm，通气量为1vvm，温度控制在30℃±1℃，通过调节搅拌转速和通气量将溶氧维持在30％以上，转速最高达到750rpm。每隔12h进行一次取样测定OD600，同时离心收集菌体测定酵母湿重，分析酵母的生长状态，酵母离心后的上清进行蛋白检测。当搅拌转速达到750rpm后，溶氧下降又升高至50％以上，开始流加补料Ⅰ，流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％为标准，当酵母湿重达到150g/L～200g/L时，停止补加补料Ⅰ，饥饿培养2小时，确保甘油全部耗尽后，开始诱导。
5、诱导培养
将温度从30℃±1℃降28℃±1℃，加入3.5％发酵体积的补料V，自动流加补料液II，流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％为标准，同时以2ml/h/L的速率流加补料Ⅳ，以2.4ml/h/L的速率流加补料VI。每隔12h进行一次取样测定OD600，同时离心收集菌体测定酵母湿重，分析酵母的生长状态，酵母离心后的上清进行蛋白检测。诱导48h后，再次加入3.5％发酵体积的补料V，诱导发酵至96h后，整个发酵周期结束。
6、收集上清
将发酵液转移至1000ml离心杯中，4℃、8000rpm条件下离心20min后，在将上清液用400目的尼龙网过滤后收集，4℃暂存。
实施例3浓缩洗滤提纯及样品后处理
本发明分离纯化提供了一种浓缩洗滤，疏水层析，离子交换层析获取目的蛋白的方法。
1、浓缩洗滤
用过滤纯化水将保存完好的3KD中空纤维柱冲洗至pH接近中性，再用20mM Tris-HCl pH7.5缓冲液平衡中空纤维柱，然后将收集到的酵母上清使用该中空纤维柱浓缩至原体积的1/10，浓缩后的样品用NaCl进一步粗纯处理，接着将离心过滤后的样品使用20mMTris-HCl pH7.5的缓冲液洗滤5次。
2、疏水层析
将浓缩洗滤后的蛋白进行Phenyl层析纯化。设置压力0.5MPa，流速30ml/min，用过滤纯化水将层析柱填料冲洗3CV～5CV柱床体积。用20mM Tris-HCl+1M NaCl pH7.5平衡缓冲液以30ml/min流速平衡层析柱3CV～5CV柱床体积。调节上样速率至10ml/min，将过滤后的样品在低流速下缓慢上样，使目的蛋白充分结合。待样品上样完毕后，用平衡缓冲液20mMTris-HCl+1M NaCl pH7.5，以30ml/min流速再次平衡层析柱，平衡至电导和紫外峰平衡。最后，以30ml/min流速用20mM Tris-HCl pH7.5进行目的蛋白的解离，并收集。
3、离子交换层析
将疏水解离的目的蛋白进行DEAE层析纯化。设置压力0.5MPa，流速15ml/min，用过滤纯化水将层析柱填料冲洗3CV～5CV柱床体积。用平衡缓冲液20mM Tris-HCl pH8.5，以15ml/min流速平衡层析柱3CV～5CV柱床体积。调节上样流速至5ml/min将样品在低流速下缓慢上样，使其充分结合。待样品上样完毕后用平衡缓冲液20mM Tris-HCl pH8.5，以15ml/min流速再次平衡层析柱，平衡至电导和紫外峰平衡。最后，以15ml/min流速用20mM Tris-HCl+1M NaCl pH8.5进行目的蛋白的解离，并收集。
4、样品后处理
将DEAE解离样品用微量紫外分光光度计1Abs进行蛋白浓度测定和调节，将样品浓度调节至2.0mg/ml。处理好的样品根据样品体积添加1‰P300，搅拌混匀后，-20℃分装保存。
实施例4不同发酵培养方案验证报告
一、不同发酵培养方案对提高β2微球蛋白重组毕赤酵母菌体湿重和蛋白表达量的影响
1、发酵方案：
优化前发酵培养方案A：
1)将BSM培养基加入到发酵罐中，经高温高压灭菌后，当发酵培养基温度降至30℃，用氨水将发酵液pH值调至5.0，然后加入PTM1微量元素溶液，最后接入种子液。
2)初始培养过程中，通过调节搅拌转速和通气量将溶氧维持在30％以上，转速最高达到750rpm。
3)当基础培养基中的碳源消耗完毕后，溶氧会跳升至50％以上，此时开始添加含PTM1微量元素溶液的50％甘油，并维持流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％。
4)当甘油补加完毕后，溶氧会再次跳升至50％以上，此时开始添加含PTM1微量元素溶液的甲醇，进行诱导表达，并维持流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％，诱导过程持续96h。
优化后发酵培养方案B(实施例2)：
1)将BSM2培养基加入到发酵罐中，经高温高压灭菌后，当发酵培养基温度降至30℃，用氨水将发酵液pH值调至6.0，然后加入PTM1微量元素溶液，500×Biotin以及10×YNB，最后接入种子液。
2)初始培养过程中，通过调节搅拌转速和通气量将溶氧维持在30％以上，转速最高达到750rpm。
3)当基础培养基中的碳源消耗完毕后，溶氧会跳升至50％以上，此时开始添加含PTM1微量元素溶液的50％甘油，并维持流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％。
4)当酵母湿重达到150g/L～200g/L时，停止补加甘油，饥饿培养2小时后，将温度从30℃±1℃降28℃±1℃。开始进行目的蛋白诱导，此时加入3.5％发酵体积的蛋白胨，自动流加含PTM1微量元素溶液的甲醇，流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％为标准，同时以2ml/h/L的速率流加15％尿素，以2.4ml/h/L的速率流加150g/L的硫酸镁。诱导48h后，再次加入3.5％发酵体积的蛋白胨，诱导过程持续96h。
2、菌体湿重结果：表格中第1批、第2批和第3批是优化后发酵培养方案B的三次重复验证结果对比。
总结：优化后的发酵培养方案B相较于优化前的发酵方案A在菌体湿重上综合提升效果约为22.90％(如图5所示)。
3、上清蛋白表达量结果：
总结：优化后的发酵培养方案B相较于优化前的发酵方案A在上清蛋白浓度上综合提升效果约为42.78％(如图6所示)。
4、单位菌株单位时间内蛋白量：
总结：优化后的发酵培养方案B相较于优化前的发酵方案A在单位菌体单位时间内上清蛋白量综合提升效果约为17.92％(如图7所示)。
5、纯化结果：
总结：优化前发酵培养方案A的β2微球蛋白总体平均浓度μ为4.3mg/ml,优化后发酵培养方案B，通过3批次纯化后，测得的β2微球蛋白平均浓度为6.8mg/ml,标准差s为0.265，进行单样本t检验(单侧)，以显著性水平α＝0.05，查t值表可知t0.05,2＝2.92,即说明优化后的发酵培养方案B能够提升目的蛋白表达量，具有显著性差异。(如图8所示)。
经三次重复性验证，重现性结果较好。优化后发酵培养方案B在菌体湿重、上清蛋白表达量以及β2微球蛋白纯化结果上均优于优化前发酵培养方案A。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 郑州伊美诺生物技术有限公司
<120> 检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法
<130> MP22000195
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtccagat ccgttgcttt ggctgttttg gccttgttgt ctttgtctgg tttggaggct 60
atccagagaa ccccaaagat tcaggtctac tccagacatc cagctgagaa cggaaagtcc 120
aacttcctga actgttacgt gtccggtttt cacccatccg acattgaggt tgacttgctg 180
aagaacggtg agagaatcga gaaggttgaa cactccgacc tgtccttctc aaaggactgg 240
tctttctacc tgctgtacta cactgagttc accccaactg aaaaggacga gtacgcctgt 300
agagttaacc acgttacttt gtcccagcca aagatcgtca agtgggacag agatatg 357
Claims (10)
1.编码β2-微球蛋白的核酸，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.包括权利要求1所述的核酸的质粒载体。
3.表达β2-微球蛋白的酵母，其特征在于，其表达如SEQ ID NO.1所示的核酸。
4.β2-微球蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求3所述的酵母，诱导蛋白表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括起始生长阶段、富集培养阶段和诱导培养阶段：
所述起始生长阶段的培养基包括MD培养基、YNB培养基和BMGY培养基培养；
所述富集培养阶段和所述诱导阶段的培养基包括BSM2培养基、PTM1、Biotin和YNB培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述起始生长阶段以MD固体培养基划线培养权利要求3所述的酵母，以YNB培养基进行一级种子制备，以BMGY培养基进行二级种子制备；
所述富集培养阶段以补料III控制pH值，然后流加补料I，所述补料I包括甘油和PTM1，所述补料III为25vol%的氨水；
所述诱导培养阶段加入补料V后，流加补料II、补料Ⅳ和补料Ⅵ，所述补料II包括100%甲醇和PTM1；所述补料Ⅳ为15wt%的尿素溶液；所述补料V为200g/L蛋白胨溶液；所述补料Ⅵ为150g/L的硫酸镁溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述富集培养阶段，控制pH值为6.0±0.2，所述流加补料I维持发酵液溶氧为30%±5%；
所述诱导培养阶段，补料V的加入量为发酵体积的3.5%，所述流加补料II维持发酵液溶氧为30%±5%，所述补料IV的流速为2ml/h/L，所述补料VI的流速为2.4ml/h/L，诱导48h后，再次加入发酵体积的3.5%的补料V。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述起始生长阶段：温度为26℃~32℃；
所述富集培养阶段：初始搅拌转速为300rpm，通气量为0.8vvm~1.5vvm，通过调节搅拌转速，维持发酵液溶氧为30%±5%，搅拌转速不超过750rpm，发酵液的pH值为6.0±0.2；
所述诱导培养阶段：温度为26℃~32℃，pH为5.8~6.2，通气量为0.8vvm~1.5vvm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述富集培养阶段，搅拌转速达到750rpm，溶氧下降又升高至50%以上，再次流加补料I以维持溶氧为30±5%，直至酵母湿重达到150 g/L ~200g/L，停止流加补料Ⅰ，饥饿培养耗尽甘油，结束富集培养阶段；
所述诱导培养阶段共诱导96h。
10.根据权利要求5~9任一项所述的方法，其特征在于，还包括收集上清、浓缩、疏水层析和离子交换层析的步骤，
所述浓缩采用分子量为3kDa的中空纤维柱；
所述疏水层析的柱填料为Phenyl；
所述离子交换层析的柱填料为DEAE。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210562063.0A CN114958862B (zh) | 2022-05-23 | 2022-05-23 | 检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210562063.0A CN114958862B (zh) | 2022-05-23 | 2022-05-23 | 检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114958862A CN114958862A (zh) | 2022-08-30 |
| CN114958862B true CN114958862B (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=82985362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210562063.0A Active CN114958862B (zh) | 2022-05-23 | 2022-05-23 | 检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114958862B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994024280A1 (en) * | 1993-04-08 | 1994-10-27 | British Biotech Pharmaceuticals Limited | Expression of beta-2-microglobulin in pichia pastoris |
| CN1699550A (zh) * | 2005-05-17 | 2005-11-23 | 上海大学 | 巴士德毕赤酵母gs115/pfk－k5的高密度发酵方法 |
| CN110869493A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-03-06 | 韦尔赛特公司 | 通用供体细胞和相关方法 |
| CN112608963A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-06 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法 |
| CN113383018A (zh) * | 2018-09-05 | 2021-09-10 | 波赛达治疗公司 | 同种异体细胞组合物和使用方法 |
-
2022
- 2022-05-23 CN CN202210562063.0A patent/CN114958862B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994024280A1 (en) * | 1993-04-08 | 1994-10-27 | British Biotech Pharmaceuticals Limited | Expression of beta-2-microglobulin in pichia pastoris |
| CN1699550A (zh) * | 2005-05-17 | 2005-11-23 | 上海大学 | 巴士德毕赤酵母gs115/pfk－k5的高密度发酵方法 |
| CN110869493A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-03-06 | 韦尔赛特公司 | 通用供体细胞和相关方法 |
| CN113383018A (zh) * | 2018-09-05 | 2021-09-10 | 波赛达治疗公司 | 同种异体细胞组合物和使用方法 |
| CN112608963A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-06 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 半连续发酵培养毕赤酵母工程菌的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| The PRY/SPRY domain of pyrin/TRIM20 interacts with β2-microglobulin to promote inflammasome formation;Sei Samukawa et al.;《Sci Rep.》;1-16 * |
| 重组人a1- 微球蛋白在毕赤酵母中的高效分泌性表达;谈春荣 等;《中华检验医学杂志》;736-739 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114958862A (zh) | 2022-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108330083B (zh) | 一株嗜热链球菌及在生产搅拌型酸奶中的应用 | |
| US10975128B2 (en) | Recombinant Dermatophagoides farinae type 1 allergen protein and its preparation method and application | |
| CN113150120B (zh) | 发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法 | |
| CN108265065B (zh) | 一种重组黄花蒿1类变应原蛋白及其应用 | |
| CN115851858B (zh) | 一种生产、纯化rspo1细胞因子方法 | |
| CN114958862B (zh) | 检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法 | |
| CN117512031B (zh) | 一种肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法 | |
| CN112143743B (zh) | 一种乙醛脱氢酶基因、大肠杆菌工程菌、表达及应用 | |
| CN113214363B (zh) | 一组特殊膳食蛋白质 | |
| CN107778365A (zh) | 一种多点整合的重组蛋白表达方法 | |
| CN117210417A (zh) | 二氢青蒿酸脱氢酶及其应用 | |
| CN116179582A (zh) | 一种通用型基因重组蛋白质a亲和纯化填料制备方法和应用 | |
| CN109852652B (zh) | 重组尘螨Ⅰ型变应原Der p1和Der f1蛋白的制备与应用 | |
| CN105734066B (zh) | 一种含有重组乙肝病毒基因的真核汉逊酵母工程菌的构建及乙肝表面抗原的生产方法 | |
| WO2002057478A1 (en) | Methods and compositions for extracting proteins from cells | |
| CN105755035B (zh) | 一种汉逊酵母特异性表达载体的构建及在提高乙肝病毒表面抗原在汉逊酵母表达量的方法 | |
| CN105802989A (zh) | 毕赤酵母表达重组蛋白的载体、基因、方法及应用 | |
| CN108570098B (zh) | 一种百日咳多种抗原成分的分离纯化方法 | |
| CN113480632A (zh) | 一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺 | |
| CN109294968B (zh) | 一种动物核酸疫苗的大规模生产技术 | |
| CN115073559A (zh) | 重组的非洲猪瘟病毒ep153r亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法和应用 | |
| CN106854656A (zh) | 一种异源二聚体蛇毒蛋白的制备方法 | |
| CN107129978A (zh) | 耐热赖氨酸氨肽酶的发酵方法 | |
| CN110205336A (zh) | 一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法及应用 | |
| CN110305927B (zh) | 利用重组大肠杆菌发酵制备包被tp抗原的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |