CN117210417A

CN117210417A - 二氢青蒿酸脱氢酶及其应用

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Publication number: CN117210417A
Application number: CN202311110316.1A
Authority: CN
Inventors: 朱建华; 郭子正; 于荣敏
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2023-08-31
Filing date: 2023-08-31
Publication date: 2023-12-12
Anticipated expiration: 2043-08-31
Also published as: CN117210417B

Abstract

本发明公开了一种二氢青蒿酸脱氢酶及其应用。本发明以黄花蒿为原料，在催化活性指导下，首次提取分离得到一种可以催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化的氧化还原酶，命名为二氢青蒿酸脱氢酶（Dihydroartemisinic acid dehydrogenase，Aa‑DHAADH）。其编码序列特征如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明对Aa‑DHAADH进行酶学性质考察，发现Aa‑DHAADH对青蒿酸的亲和力强于二氢青蒿酸，为高产二氢青蒿酸底盘菌株的构建提供了新的思路和方法，对于青蒿素类化合物的规模化生产具有重要作用；丰富了青蒿素生物合成途径的线路，为青蒿素终端生物合成途径的解析提供理论依据。

Description

二氢青蒿酸脱氢酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物合成领域，具体涉及一种二氢青蒿酸脱氢酶及其应用。

背景技术

青蒿素(Artemisinin,ART)是从药用植物黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离获得的一种含有独特过氧桥结构的倍半萜类化合物，2001年，世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)确定以ART为基础的联合疗法是治疗急性疟疾的最佳选择。由于其较好的抗疟活性及其在黄花蒿中极低的含量(0.1-1％，干重)，使得ART的生产途径备受关注。

1983年，G.Schmid和W.Hofheinz两位科学家首次实现了ART的全合成，随着时间推进，ART的全合成路线不断被改进优化。但化学合成ART过程复杂、产量低且环境污染严重，未能被进行大规模工业化生产。随着合成生物学技术的不断发展，越来越多的科学家开始尝试在酵母和烟草等微生物体系中构建高产ART的底盘菌株。2006年，Dae-Kyun Ro等人在酿酒酵母中构建了产青蒿酸(Artemisinic acid,AA)(100mg/L)的底盘菌株，开启了采用半合成法生产ART的新篇章，2014年，C.J.Paddon等人在酿酒酵母中构建了高产AA(25g/L)的底盘菌株，并通过半合成法实现了ART的生产。至今为止，ART的终端生物合成途径未被完全解析阐明，在黄花蒿中过氧桥是如何产生的仍然是ART生物合成途径解析的瓶颈问题，使得异源合成ART受到巨大限制。因此，目前ART的来源主要依赖于从黄花蒿植株中直接提取获得。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种二氢青蒿酸脱氢酶，具有催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化的功能，为高产二氢青蒿酸底盘菌株的构建提供了新的思路和方法，对于青蒿素类化合物的规模化生产具有重要作用，为青蒿素终端生物合成途径的解析提供理论依据。

本发明采用的技术方案如下：

本发明首次从黄花蒿中提取分离得到一种催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化的氧化还原酶，命名为二氢青蒿酸脱氢酶(Dihydroartemisinic acid dehydrogenase，Aa-DHAADH)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了编码所述二氢青蒿酸脱氢酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了所述二氢青蒿酸脱氢酶在催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化中的应用。

本发明对二氢青蒿酸脱氢酶进行酶学性质考察，所述二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸和二氢青蒿酸的pH值为4.5-10.5，优选为6-9，催化温度为25-40℃，催化时间为1-8h。

本发明分别对二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸和二氢青蒿酸的动力学参数进行了测定，结果显示，二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸的Km值为340.00μM，催化二氢青蒿酸的Km值为532.35μM，二氢青蒿酸脱氢酶对青蒿酸的亲和力强于二氢青蒿酸。

本发明还提供了二氢青蒿酸脱氢酶在高产青蒿素类化合物底盘菌株的构建中的应用。

本发明提供了上述二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)以黄花蒿为原料，提取得到黄花蒿粗酶；

(2)以催化活性为导向对黄花蒿粗酶依次采用硫酸铵沉淀、葡聚糖G50凝胶柱层析、葡聚糖G25凝胶柱层析和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析进行分离纯化，得到活性组分DEAE-2；

(3)对DEAE-2活性组分进行质谱鉴定，经候选酶筛选和功能验证得到二氢青蒿酸脱氢酶。

优选地，步骤(2)中，所述硫酸铵的饱和度为60-90％。

优选地，步骤(3)中，所述葡聚糖G50凝胶柱层析和葡聚糖G25凝胶柱层析中的采用的流动相为PBS溶液，流速为0.20-0.80mL/min。

优选地，步骤(2)中，所述DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析中依次采用0.03M Tris+0.30M NaCl、0.03M Tris+1.00M NaCl、0.03M Tris+2.00M NaCl共3个梯度进行洗脱。

本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：

本发明以黄花蒿为原料，提取黄花蒿粗酶，以催化活性为导向对黄花蒿粗酶依次采用AS沉淀、葡聚糖G50凝胶柱层析、葡聚糖G25凝胶柱层析和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析分离纯化，首次从黄花蒿中提取分离得到一种能催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化的氧化还原酶，命名为二氢青蒿酸脱氢酶(Dihydroartemisinic aciddehydrogenase，Aa-DHAADH)。对Aa-DHAADH进行酶学性质考察，发现Aa-DHAADH对青蒿酸的亲和力强于二氢青蒿酸，为高产二氢青蒿酸底盘菌株的构建提供了新的思路和方法，对于青蒿素类化合物的规模化生产具有重要作用；丰富了青蒿素生物合成途径的线路，为青蒿素终端生物合成途径的解析提供理论依据。

附图说明

图1为实施例1中黄花蒿粗酶催化青蒿酸的活性验证结果；

图2为实施例1中黄花蒿粗酶催化二氢青蒿酸的活性验证结果；

图3为实施例2中经80％硫酸铵沉淀的黄花蒿粗酶催化青蒿酸的活性验证结果；

图4为实施例2中经80％硫酸铵沉淀的黄花蒿粗酶催化二氢青蒿酸的活性验证结果；

图5为实施例3中对80％硫酸铵沉淀的黄花蒿粗酶进行G50凝胶柱层析时的层析图谱；

图6为实施例3中G50凝胶柱层析组分(G50-1和G50-2)催化青蒿酸的活性验证结果；

图7为实施例3中G50凝胶柱层析组分(G50-1和G50-2)催化二氢青蒿酸的活性验证结果；

图8为实施例4中对G50-2活性组分进行G25凝胶柱层析时的层析图谱；

图9为实施例4中G25凝胶柱层析组分(G25-1和G25-2)催化青蒿酸的活性验证结果；

图10为实施例4中G25凝胶柱层析组分(G25-1和G25-2)催化二氢青蒿酸的活性验证结果；

图11为实施例5中，对G25-2活性组分进行DEAE柱层析时的层析图谱；

图12为实施例5中DEAE柱层析组分(DEAE-1、DEAE-2和DEAE-3)催化青蒿酸的活性验证结果；

图13为实施例5中DEAE柱层析组分(DEAE-1、DEAE-2和DEAE-3)催化二氢青蒿酸的活性验证结果；

图14为实施例6中对DEAE-2活性组分进行蛋白质组学鉴定的流程图；

图15为实施例7中筛选得到的62个氧化还原酶与青蒿素下游生物合成途径中已确定的活性酶的进化树分析结果；

图16为实施例7中4个候选酶与DBR2的氨基酸序列比对结果；

图17为实施例8中质粒pET-28b(+)-MBP的质粒图谱；

图18为实施例8中胶回收质粒和目的基因后葡聚糖凝胶电泳检测结果；

图19为实施例8中重组质粒转化到大肠杆菌DH5α之后再含有Kan抗性的LB平板上的筛选结果；

图20为实施例8中重组质粒的菌落PCR验证结果；

图21为实施例8中异源表达C71的SDS-PAGE分析结果(S：上清；P：沉淀；1：空载质粒pET-28b(+)-MBP；2：重组质粒pET-28b(+)-MBP-C71；3：通过镍柱纯化后的C71)；

图22为实施例8中候选酶催化青蒿酸的HPLC检测结果；

图23为实施例8中候选酶催化二氢青蒿酸的HPLC检测结果；

图24为实施例9中不同浓度的IPTG诱导下，蛋白的含量变化趋势图；

图25为实施例9中不同浓度的IPTG诱导下，蛋白的SDS-PAGE分析结果；

图26为实施例9中青蒿酸和二氢青蒿酸的标准曲线图(A：二氢青蒿酸的标准曲线；B：青蒿酸的标准曲线)；

图27为实施例9中最佳pH的考察结果(A：Aa-DHAADH催化青蒿酸的最佳pH的考察；B：Aa-DHAADH催化二氢青蒿酸的最佳pH的考察)；

图28为实施例9中最佳反应时间的考察结果(A：Aa-DHAADH催化青蒿酸的最佳反应时间的考察；B：Aa-DHAADH催化二氢青蒿酸的最佳反应时间)；

图29为实施例9中最佳反应温度的考察结果(A：Aa-DHAADH催化青蒿酸的最佳反应温度的考察；B：Aa-DHAADH催化二氢青蒿酸的最佳反应温度的考察)；

图30为实施例9中Aa-DHAADH的动力学参数的考察结果(A：Aa-DHAADH催化青蒿酸的动力学参数；B：Aa-DHAADH催化二氢青蒿酸的动力学参数)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1：黄花蒿粗酶的提取和活性验证

取生长周期为8周的黄花蒿植株，剪碎后放入研钵中，加入液氮冷冻并迅速研磨成粉末，准确称取研磨后的样品1.00g加入到15mL无菌离心管中，按照质量体积比1:5的比例加入5mL蛋白提取缓冲液，在4℃、80rpm条件下共孵育5h。共孵育结束后在4℃、6000rpm条件下离心15min，转移上清至另一新的15mL无菌离心管中，4℃、12000rpm离心15min，保留上清，过0.45μm微孔滤膜。把提取得到的黄花蒿粗酶溶液转移至1KD的透析袋中，4℃条件下在超纯水中透析24h以除去小分子化合物，采用超微量生物检测仪检测黄花蒿粗酶的浓度。

取1.5mL无菌EP管，依次加入200μg黄花蒿粗酶、100μg底物(AA，DHAA)，蛋白提取缓冲液补齐至500μL，在30℃、220rpm条件下反应4h；对照组：加入200μg煮沸的黄花蒿粗酶、100μg底物(AA，DHAA)，蛋白提取缓冲液补齐至500μL，在30℃、220rpm条件下反应4h。反应结束后向EP管中加入500μL乙酸乙酯萃取，25℃、12000rpm离心10min,保留上层有机相，重复萃取3次，合并萃取液后浓缩至干，然后加入600μL色谱甲醇，充分溶解后过0.22μm有机微孔滤膜，进行HPLC检测。

结果显示：由图1和图2可知，黄花蒿粗酶对青蒿酸和二氢青蒿酸均具有催化活性，可以催化青蒿酸和二氢青蒿酸的相互转化。

实施例2：采用80％硫酸铵(Ammonium sulfate,AS)对黄花蒿粗酶进行沉淀，及对80％ AS沉淀后的黄花蒿粗酶的活性验证

采用匀浆机在室温、干燥条件下把AS研磨成粉末，密封保存备用。取适量实施例1中提取的黄花蒿粗酶溶液置于玻璃烧杯中，在冰浴、30rpm条件下缓缓加入研磨好的AS粉末，直至AS的浓度达到80％。继续在冰浴、30rpm条件下共孵育2h，孵育结束后转移至50mL无菌离心管中，4℃、10000rpm条件下离心15min，弃上清，用5mL蛋白提取缓冲液溶解沉淀。合并溶解液，转移至1KD的透析袋中，4℃条件下在超纯水中透析24h以除去小分子化合物，采用超微量生物检测仪检测80％ AS沉淀后的黄花蒿粗酶浓度。活性验证部分同实施例1.

结果显示：由图3和图4可知，经80％ AS沉淀后的黄花蒿粗酶可以催化青蒿酸和二氢青蒿酸的相互转化。

实施例3：采用葡聚糖G50凝胶柱对80％ AS沉淀的黄花蒿粗酶进行层析及层析后不同组分的活性验证

在层析柜中(4℃)把葡聚糖G50填料装到柱子中(柱体积约80mL)，连接好恒流泵、核酸蛋白检测仪和电脑装置，流动相为PBS溶液，流速为0.50mL/min，备用。用0.45μm微孔滤膜过滤样品，上样，每次上样量为5mg，从层析图谱中可以看出共有2个峰(图5)，按照出峰时间的先后顺序分别命名为G50-1和G50-2。分别收集G50-1和G50-2组分，转移至1KD的透析袋中，4℃条件下在超纯水中透析24h，然后在真空冷冻干燥机中冻干。用适量蛋白缓冲液复融冻干后的样品，采用超微量生物检测仪分别检测G50-1和G50-2的浓度。分别对G50-1和G50-2组分进行活性验证，活性验证部分同实施例1。

结果显示：由图5可知，经G50凝胶柱层析后共得到2个组分，分别命名为G50-1和G50-2。然后对G50-1和G50-2进行活性验证，由图6和图7的活性验证结果可知G50-2组分是活性组分，可以催化青蒿酸和二氢青蒿酸的相互转化。

实施例4：采用葡聚糖G25凝胶柱对G50-2活性组分进行层析及层析后不同组分的活性验证

在层析柜中(4℃)把葡聚糖G25填料装到柱子中(柱体积约80mL)，连接好恒流泵、核酸蛋白检测仪和电脑装置，流动相为PBS溶液，流速为0.50mL/min，备用。用0.45μm微孔滤膜过滤样品，上样，每次上样量为5mg，从层析图谱中可知共有2个峰(图8)，按照出峰时间的先后顺序分别命名为G25-1和G25-2。分别收集G25-1和G25-2组分，转移至1KD的透析袋中，4℃条件下在超纯水中透析24h，然后在真空冷冻干燥机中冻干。用适量蛋白缓冲液复融冻干后的样品，采用超微量生物检测仪分别检测G25-1和G25-2的浓度。分别对G25-1和G25-2组分进行活性验证，活性验证部分同实施例1。

结果显示：由图8可知，经葡聚糖G25凝胶柱层析后共得到2个组分，分别命名为G25-1和G25-2。由图9和图10的活性验证结果可知G25-2组分是活性组分，可以催化青蒿酸和二氢青蒿酸的相互转化。

实施例5：采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱对G25-2活性组分进行层析及层析后不同组分的活性验证

在层析柜中(4℃)把DEAE-Sepharose Fast Flow填料装到柱子中(柱体积约200mL)，连接好恒流泵、核酸蛋白检测仪和电脑装置，流速为2mL/min，备用。用0.45μm微孔滤膜过滤样品，上样，每次上样量为20mg，依次采用0.03M Tris+0.30M NaCl、0.03M Tris+1.00M NaCl、0.03M Tris+2.00M NaCl共3个梯度进行洗脱，共得到3个组分，分别命名为DEAE-1、DEAE-2和DEAE-3(图11)。分别收集DEAE-1、DEAE-2和DEAE-3组分，转移至1KD的透析袋中，4℃条件下在超纯水中透析24h，然后在真空冷冻干燥机中冻干。用适量蛋白缓冲液复融冻干后的样品，采用超微量生物检测仪分别检测DEAE-1、DEAE-2和DEAE-3的浓度。分别对DEAE-1、DEAE-2和DEAE-3组分进行活性验证，活性验证操作同实施例1。

结果显示：经DEAE柱层析后共得到3个组分，分别命名为DEAE-1、DEAE-2和DEAE-3。由图12和图13的活性验证结果可知DEAE-2组分是活性组分，可以催化青蒿酸和二氢青蒿酸的相互转化。

实施例6：DEAE-2活性组分的蛋白质组学鉴定及候选活性酶的筛选

对DEAE-2活性组分进行酶切处理，采用液质联用(LC-MS/MS)进行多肽段检测，最后采用PEAKS软件进行数据库检索和数据分析(图14)。

⑴样品处理

·蛋白酶切

取DEAE-2活性组分，加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)试剂使其终浓度为50mM，37℃反应1h；

加入吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)试剂使其终浓度为100mM，25℃、避光反应40min；

将还原烷基化后的蛋白溶液转移至10KD的超滤管中，4℃、12000rpm离心20min，弃掉收集管底部溶液；

加入100μL浓度为8M的尿素(PH8.5)，4℃、12000rpm离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复2次；

加入25mM碳酸氢铵溶液100μL，4℃、12000rpm离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；

更换新的收集管，在超滤管中加入25mM碳酸氢铵溶液(含胰蛋白酶)使终体积为50μL，胰蛋白酶与蛋白质量比为1:50，37℃反应过夜；

次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比1:100)，37℃反应4h，4℃、12000rpm离心20min，使酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部，收集滤液；

在超滤管中加入50μL 25mM的碳酸氢铵溶液，4℃、12000rpm离心20min，收集滤液并与上步合并，共得到100μL酶解后的样品；

向多肽样品中加100μL 0.2％的三氟乙酸(TFA)水溶液，混匀；

取C18小柱，用适量乙腈(CH₃CN)活化后，加入1mL 0.1％TFA水溶液冲洗2次；

把多肽样品转移至C18小柱，弃掉滴下液体；

用1mL 0.1％TFA水溶液洗脱，弃掉滴下液体；

用1mL 70％ CH₃CN溶液洗脱，收集液体，真空冷冻干燥。

·使用ZipTip C18柱除盐

用50μL 60％ CH₃CN润洗TIP 10次；

用10μL 0.1％TFA清洗TIP 10次；

将样品吸入并排出TIP 20次，排出液体；

用10μL 0.1％TFA清洗TIP 5次。

用10μL 60％CH₃CN洗脱肽段至新的EP管，真空冷冻干燥。

⑵液质联用(LC-MS/MS)对样品进行质谱鉴定

·检测方法

用20μL溶解液(0.1％甲酸(HCOOH)、5％ CH₃CN)溶解肽段，充分振荡涡旋，4℃、12000rpm离心20min，吸取上清转移到进样瓶中，吸取8μL进行质谱鉴定。

·液相色谱设置参数如表1：

表1.流动相参数

A：0.1％ HCOOH水溶液；B：0.1％ HCOOH，80％ CH₃CN。:

·质谱设置参数如表2：

表2.质谱设置参数

⑶数据库检索和分析

采用PEAKS软件进行数据库检索和分析，具体检索参数如表3所示。

表3.鉴定参数

结果显示：经蛋白质组学鉴定在DEAE-2活性组分里面共鉴定出1370个蛋白。

实施例7：候选酶的筛选

采用UniProt数据库对实施例6中鉴定出的1370个蛋白进行功能分析，发现有62个酶具有氧化还原功能。然后把这62个酶与青蒿素下游生物合成途径中已经被确定的活性酶进行进化树分析，筛选与DBR2处于同一分支的酶做为候选酶。

结果显示：由进化树(图15)分析结果可知，与DBR2处于同一分支的酶共有4个，分别为J86、V73、C71和C90，即作为候选酶进行功能验证。同时，4个候选酶与DBR2的氨基酸序列比对结果如图16所示。

实施例8：候选酶的异源表达和功能验证

在大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中对实施例7中筛选得到的4个候选酶进行异源表达和功能验证。选用的质粒为带有融合标签MBP的pET-28b(+)，命名为pET-28b(+)-MBP，质粒图谱如图17所示。选用双酶切，酶切位点为NdeI和BamHI，分别对4个候选酶设计引物，克隆得到目的基因。采用同源重组的方法构建重组质粒，然后转化到E.coli BL21中进行异源表达，采用镍柱对表达得到的候选酶进行纯化，最后进行活性验证。

⑴质粒pET-28b(+)-MBP的提取和双酶切

在超净工作台中取10μL pET-28b(+)-MBP的甘油菌加入到5mL含有卡那霉素(Kanamycin，Kan)抗性的LB液体培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.6，然后采用擎科质粒提取试剂盒提取质粒pET-28b(+)-MBP。

采用超微量生物检测仪对提取得到的质粒进行浓度测定，然后按照表4配制反应体系对质粒pET-28b(+)-MBP双酶切，把配制好的体系置于37℃水浴锅中酶切2h。结束后把酶切反应体系进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，切下对应分子量的凝胶块保存在1.5mL EP管中，最后采用胶回收试剂盒(生工)回收双酶切之后的质粒。

表4.质粒pET-28b(+)-MBP的双酶切体系配置表

·质粒提取过程如下所示：

向吸附柱中(吸附柱提前放入收集管中)加入250uL Buffer BL，4℃、13500rpm离心1min,活化硅胶膜；

取培养好的菌液，25℃、3500rpm离心10min，弃上清；

加入250μL Buffer S1重悬菌体，涡旋振荡至无菌快为止；

加入250μL Buffer S2，温和地上下反转6-8次，使菌体充分裂解；

加入350μL Buffer S3，温和地上下反转6-8次，25℃、13500rpm离心10min；

将上清转移至吸附柱中，25℃、13500rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

向吸附柱中加入700μL Buffer W2，25℃、13500rpm离心1min，弃废液，重复操作一次；

将吸附柱放回收集管中，25℃、13500rpm离心2min；

取出吸附柱，放入干净的1.5mLEP管中，25℃静置5min，使残留的乙醇充分挥发；

向吸附膜中央加入35μL dd H₂O(65℃预热)，25℃静置5min，25℃、13500rpm离心2min；

此时EP管底部的溶液即为提取得到的质粒，可立即用于下游实验或保存于-20℃冰箱中备用。

·胶回收过程如下所示：

用干净的手术刀片将含目的片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL EP管中，称重；

按照每100mg琼脂糖加入500μLBuffer B2的比例加入适量Buffer B2；

置于65℃水浴锅中水浴5-10min，直至胶块完全融化；

将融化后的溶液全部转移至吸附柱中，25℃、9000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

向吸附柱中加入300μLBuffer B2，25℃、10000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

向吸附柱中加入500μL Wash Solution，25℃、10000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，重复操作一次；

将空吸附柱和收集管放入离心机中，25℃、10000rpm离心1min；

向吸附膜中央加入20μL dd H₂O(65℃预热)，25℃静置2min，25℃、10000rpm离心1min；

将所得到的DNA回收液置于-20℃冰箱中保存备用或立即用于下有实验。

结果显示：经质粒提取、双酶切和胶回收得到被NdeI和BamHI酶切后的质粒pET-28b(+)-MBP，如图18的葡聚糖凝胶电泳电泳检测结果所示。

⑵目的基因的扩增

采用植物总RNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)从黄花蒿植株中提取RNA，采用反转录试剂盒(TOYOBO)反转录得到cDNA。根据质粒pET-28b(+)-MBP和酶切位点NdeI、BamHI对4个候选酶进行引物设计(表5)，然后对4个候选酶进行PCR扩增，扩增体系和PCR扩增程序如表6、表7所示。PCR扩增结束后把反应体系进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，切下对应分子量的凝胶块保存在1.5mL EP管中，采用胶回收试剂盒(生工)回收扩增的目的基因。

表5.候选酶进行PCR扩增时的引物列表

表6.候选酶的PCR扩增体系

表7.候选酶的PCR扩增程序

注：变性、复性、延伸共进行33个循环。

结果显示：由图18的葡聚糖凝胶电泳检测结果可知，均从黄花蒿植株中扩增出相对应的目的基因。

⑶质粒与目的基因的同源重组和转化

采用“Hieff Clone Universal One Step Cloning Kit”试剂盒进行同源重组，同源重组体系如表8所示，50℃重组30min。重组结束后立即转化到大肠杆菌DH5α感受态中，转化步骤如下所示：

在超净工作台中取10μl重组反应体系加入到100μL DH5α感受态中，轻轻晃动混匀；

冰上静置30min，然后放入42℃水浴锅中热激1min，继续冰上静置3min；

在超净工作台中加入500μL不带抗性的LB液体培养基，37℃、220rpm培养1h；

25℃、3500rpm离心5min，转移至超净工作台中去上清，加入200μL LB液体培养基复融沉淀；

将上步的溶液转移至含有50μg/mL Kan抗性的LB平板中，涂板；

把平板放入37℃培养箱中培养过夜。

同时，取空载质粒pET-28b(+)-MBP按照上述方法转化到大肠杆菌DH5α感受态中，作为对照。

表8.重组反应体系

结果显示：次日，从培养箱中取出平板观察，发现每个平板上都长出了单克隆(图19)，表明转化成功，然后对长出的单克隆进行菌落PCR验证或短时间内保存在4℃冰箱中备用。

⑷阳性菌落的筛选与验证

次日，从37℃培养箱中取出过夜培养的LB平板，发现平板上长出单克隆，从每个平板上挑10个单克隆进行菌落PCR验证(图19)，菌落PCR反应体系和程序如表9、表10所示。取反应结束的菌落PCR体系进行1％的葡聚糖凝胶电泳检测(图20)，然后挑取阳性菌落加入到5mL含有Kan抗性的LB液体培养基中，摇菌，提取重组质粒，进行下游实验。

表9.菌落PCR反应体系

表10.菌落PCR反应程序

注：变性、复性、延伸共进行33个循环。

结果显示：如图20所示，对4个候选酶的重组质粒进行菌落PCR验证，均出现阳性条带，表明重组和转化成功。

⑸重组质粒转化到E.coli BL21及在E.coli中的表达

取步骤⑷中阳性的重组质粒，加入适量dd H₂O稀释终浓度为1μg/mL，取10μl稀释后的质粒溶液加入到100μL E.coli BL21感受态中，按照步骤⑶的转化方法进行转化。

挑取LB平板上的单克隆加入到5mL含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm条件下过夜培养。次日取1mL摇好的菌液加入到100mL含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入适量诱导剂IPTG，然后在16℃、220rpm条件下培养20h即得到在E.coli中表达的目的基因，用于后续纯化和活性验证。

⑹镍柱纯化得到异源表达的候选酶

按照步骤⑸的方法大批量表达候选酶，收集菌液，在4℃、8000rpm条件下离心15min，去上清，加入适量蛋白缓冲液溶解沉淀。转移溶解液于15mL无菌离心管中，采用超声破碎法破碎细胞，在50％振幅、5s工作/5s停止模式下破碎10min，破碎完成后在4℃、8000rpm条件下离心15min，保留上清即为在E.coli中异源表达的粗酶。

采用镍柱纯化，上样，依次经过0、50、100、200mM咪唑进行洗脱，收集200mM咪唑洗脱部分即为纯化得到的目的基因，4℃条件下在超纯水中透析24h，然后采用真空冷冻干燥机冻干，得到纯化的候选酶。

结果显示：由图21的SDS-PAGE分析结果可知，经镍柱纯化之后得到异源表达的候选酶，保存于-20℃冰箱中备用或立即用于下游实验。

⑺候选酶的功能验证

候选酶催化青蒿酸的功能验证：

取1.5mL无菌EP管，依次加入200μg纯化后的候选酶、100μg青蒿酸、10mM辅助因子NADPH，蛋白提取缓冲液补齐至500μL，在30℃、220rpm条件下反应4h；对照组：加入200μg煮沸的候选酶、100μg青蒿酸、10mM辅助因子NADPH，蛋白提取缓冲液补齐至500μL，在30℃、220rpm条件下反应4h。反应结束后向EP管中加入500μL乙酸乙酯萃取，25℃、12000rpm离心10min,保留上层有机相，重复萃取3次，合并萃取液后浓缩至干，然后加入600μL色谱甲醇，充分溶解后过0.22μm有机微孔滤膜，进行HPLC检测。

候选酶催化二氢青蒿酸的功能验证：

取1.5mL无菌EP管，依次加入200μg纯化后的候选酶、100μg二氢青蒿酸、10mM辅助因子NADP⁺，蛋白提取缓冲液补齐至500μL，在30℃、220rpm条件下反应4h；对照组：加入200μg煮沸的候选酶、100μg二氢青蒿酸、10mM辅助因子NADP⁺，蛋白提取缓冲液补齐至500μL，在30℃、220rpm条件下反应4h。反应结束后向EP管中加入500μL乙酸乙酯萃取，25℃、12000rpm离心10min,保留上层有机相，重复萃取3次，合并萃取液后浓缩至干，然后加入600μL色谱甲醇，充分溶解后过0.22μm有机微孔滤膜，进行HPLC检测。

结果显示：由HPLC检测结果(图22、图23)可知C71可以催化青蒿酸和二氢青蒿酸的相互转化，我们命名为二氢青蒿酸脱氢酶(Dihydroartemisinic acid dehydrogenase，Aa-DHAADH)。

实施例9：Aa-DHAADH的酶学性质考察

⑴诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)最佳工作浓度的考察

IPTG工作浓度考察范围为：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mM，每组设置3个平行。在超净工作台中取10μL在E.coli中异源表达Aa-DHAADH的甘油菌加入到5mL含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜。次日，取培养好的菌液1mL加入到100mL含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，然后分别加入不同浓度的IPTG，使其终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mM，在16℃、220rpm条件下培养20h。采收，收集菌液，在4℃、8000rpm条件下离心15min，弃上清，加入适量蛋白缓冲液溶解沉淀。转移溶解液于15mL无菌离心管中，采用超声破碎法提取粗酶,在50％振幅、5s工作/5s停止模式下破碎10min,破碎完成后在4℃、8000rpm条件下离心15min，保留上清。采用超微量生物检测仪检测每组的蛋白浓度，同时进行SDS-PAGE分析。

结果显示：由图24可知，随着IPTG浓度的增加，蛋白浓度呈现先增加后下降的趋势，当IPTG浓度为0.6mM是对应的蛋白浓度最高。由图25可知，当不加入IPTG时，活性酶Aa-DHAADH未表达，随着IPTG浓度的增加，Aa-DHAADH的表达量呈现先增加后下降的趋势。结合图24和图25，可知诱导Aa-DHAADH表达的最佳IPTG浓度为0.6mM。

⑵Aa-DHAADH最佳pH的考察

采用单一变量法考察Aa-DHAADH发挥催化活性时的最佳pH，反应时间为4h，反应温度为35℃，底物浓度为1mM。pH考察范围分别为：4.5、6.0、7.5、9.0和10.5，每组设置3个平行。

首先建立青蒿酸和二氢青蒿酸的标准曲线，按照实验条件把蛋白缓冲液的pH值分别调为4.5、6.0、7.4、9.0和10.5，在不同pH的缓冲体系中对Aa-DHAADH进行体外活性试验，通过产物的生成量确定活性酶Aa-DHAADH的最适pH。

结果显示：如图26所示，建立青蒿酸和二氢青蒿酸的标准曲线，图26-A为二氢青蒿酸的标准曲线，R²＝0.9998，图26-B为青蒿酸的标准曲线，R²＝0.9995。由图27可知，Aa-DHAADH催化青蒿酸和二氢青蒿酸的最适pH均为7.5。

⑶最佳反应时间的确定

采用单一变量法考察Aa-DHAADH发挥催化活性时的最佳反应时间，反应缓冲体系的pH为7.5，反应温度为35℃，底物浓度为1mM。反应时间考察范围分别为：1、2、4、6和8h，每组设置3个平行。建立关于Aa-DHAADH的体外活性试验，在不同反应时间后终止反应，根据产物的生成量确定活性酶Aa-DHAADH催化青蒿酸和二氢青蒿酸的最佳反应时间。

结果显示：由图28可知，Aa-DHAADH催化青蒿酸的最适反应时间为4h，催化二氢青蒿酸的最适反应时间为6h。

⑷最佳反应温度的确定

采用单一变量法考察Aa-DHAADH发挥催化活性时的最佳反应温度，反应缓冲体系的pH为7.5，Aa-DHAADH催化青蒿酸的反应时间为4h，催化二氢青蒿酸的反应时间为6h，底物浓度为1mM。反应温度的考察范围分别为：25、30、35和40℃，每组设置3个平行。在不同温度下分别建立关于Aa-DHAADH的体外活性试验，根据产物的生成量确定活性酶Aa-DHAADH催化青蒿酸和二氢青蒿酸的最佳反应温度。

结果显示：由图29可知，Aa-DHAADH催化青蒿酸和二氢青蒿酸的最适反应温度均为30℃。

⑸活性酶Aa-DHAADH催化青蒿酸和二氢青蒿酸的动力学参数

根据以上研究结果已知诱导活性酶Aa-DHAADH表达的最佳IPTG浓度为0.6mM，Aa-DHAADH催化青蒿酸和二氢青蒿酸的最佳反应pH为7.5、最佳反应时间分别为4h和6h，最佳温度为35℃。故在最佳条件下考察活性酶Aa-DHAADH催化青蒿酸和二氢青蒿酸的动力学参数，底物浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6和2.0mM，在最佳反应pH、最佳反应时间和最佳反应温度条件下进行体外活性验证，分别加入不同浓度底物，每组设置3个平行。反应结束后通过产物的生成量和反应时间计算不同底物浓度对应Aa-DHAADH的反应速率，根据底物浓度和反应速率绘制米氏方程曲线，得出Aa-DHAADH催化青蒿酸和二氢青蒿酸的Km值。

结果显示：由图30可知，Aa-DHAADH催化青蒿酸的Km值为340.00μM，催化二氢青蒿酸的Km值为532.35μM。Aa-DHAADH对青蒿酸的亲和力强于二氢青蒿酸。

Claims

1.二氢青蒿酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的二氢青蒿酸脱氢酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的二氢青蒿酸脱氢酶在催化青蒿酸和二氢青蒿酸相互转化中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸和二氢青蒿酸的pH值为4.5-10.5，优选为6-9，催化温度为25-40℃，催化时间为1-8 h。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述二氢青蒿酸脱氢酶催化青蒿酸的Km值为340.00 μM，催化二氢青蒿酸的Km值为532.35 μM。

6.权利要求1所述的二氢青蒿酸脱氢酶在高产青蒿素类化合物底盘菌株构建中的应用。

7.权利要求1所述的二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以黄花蒿为原料，提取得到黄花蒿粗酶；

（2）以催化活性为导向对黄花蒿粗酶依次采用硫酸铵沉淀、葡聚糖G50凝胶柱层析、葡聚糖G25凝胶柱层析和DEAE- Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析进行分离纯化，得到活性组分DEAE-2；

（3）对DEAE-2活性组分进行质谱鉴定，经候选酶筛选和功能验证得到二氢青蒿酸脱氢酶。

8.根据权利要求7所述的二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述硫酸铵的饱和度为60-90%。

9.根据权利要求7所述的二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述葡聚糖G50凝胶柱层析和葡聚糖G25凝胶柱层析中的采用的流动相为PBS溶液，流速为0.20-0.80 mL/min。

10.根据权利要求7所述的二氢青蒿酸脱氢酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述DEAE- Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析中依次采用0.03 M Tris+0.30 M NaCl、0.03 M Tris+1.00 M NaCl、0.03 M Tris+2.00 M NaCl共3个梯度进行洗脱。