CN117802055B - 去氧青蒿素b合酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去氧青蒿素B合酶及其应用。本发明在青蒿素（Artemisinin,ART）的生物合成途径中，提供了一种新的功能酶：去氧青蒿素B合酶（Deoxyarteannuin B synthase，DBS），其可以催化青蒿酸生成去氧青蒿素B，丰富了ART生物合成途径的线路，为ART的终端生物合成途径解析提供理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物合成领域，具体涉及一种去氧青蒿素B合酶(Deoxyarteannuin Bsynthase,DBS)及其应用。
背景技术
黄花蒿(Artemisia annua L.)为菊科蒿属一年生草本植物，是抗疟疾药物青蒿素(Artemisinin,ART)的唯一天然来源。1970年左右，中国科学家从黄花蒿提取物中分离得到ART，其具有较强的抗疟活性，主要用于间日疟、恶性疟的症状控制及氯喹耐药性疟疾的治疗。随着研究的不断深入，发现ART同时具有抗肿瘤、抗炎和免疫调节等多种药理学作用，使得ART的市场需求逐渐增加。但ART在黄花蒿中的含量极低(0.01-1.00％，干重)，虽然已经实现ART的化学全合成，但过程复杂，产量低且环境污染严重，未能进行工业化生产，所以ART的市场供应问题一直备受关注。
由于ART的终端生物合成途径未被阐明，仍然不能采用合成生物学的方法直接生产ART，目前ART的来源主要依赖于从黄花蒿植株中直接提取获得。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种去氧青蒿素B合酶，其可以催化青蒿酸生成去氧青蒿素B，为青蒿素的终端生物合成途径解析提供理论基础。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种催化青蒿酸(Artemisinic acid,AA)生成去氧青蒿素B(Deoxyarteannuin B,DB)的内酯合酶，命名为去氧青蒿素B合酶(Deoxyarteannuin Bsynthase，DBS)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的具有60％以上的同源性。
本发明提供了编码所述的去氧青蒿素B合酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述的去氧青蒿素B合酶的异源表达具体包括但不限于在原核生物(如：大肠杆菌)、真核生物(如：酵母)、植物(烟草，苔藓等)和真菌(如：米曲霉)等微生物体系中的异源表达，异源表达重组蛋白的纯化及利用重组蛋白催化青蒿酸、二氢青蒿酸及其他青蒿素类化合物发生羧基内酯化反应。
本发明还提供了所述的去氧青蒿素B合酶在催化青蒿酸生成去氧青蒿素B中的应用。
本发明对去氧青蒿素B合酶的酶学性质研究，所述去氧青蒿素B合酶催化青蒿酸生成去氧青蒿素B时的反应时间为0-64h，优选为16-56h，反应温度为20-60℃，优选为20-40℃。
本发明去氧青蒿素B合酶对底物青蒿酸的动力学参数研究，结果显示，所述去氧青蒿素B
本发明还提供了所述的去氧青蒿素B合酶在高产青蒿素类化合物底盘菌株构建中的应用。
本发明还提供了一种去氧青蒿素B及其类似物的催化合成方法，以青蒿酸或其类似物为底物，利用所述的去氧青蒿素B合酶催化生成去氧青蒿素B及其类似物。本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：
本发明在ART的生物合成途径中，提供了一种新的功能酶：去氧青蒿素B合酶(Deoxyarteannuin B synthase，DBS)，其可以催化青蒿酸生成去氧青蒿素B，丰富了ART生物合成途径的线路，为ART的终端生物合成途径解析提供理论基础。
附图说明
图1为青蒿酸生物合成去氧青蒿素B的思路图(A：AA到DB的过程设想；B：AA生物合成DB的推测线路图；C：木香烯内酯合酶(Costunolide synthase,COS)催化香精烯A酸生成木香烯内酯；
图2在黄花蒿转录组数据库中以COS为诱饵的Blast数据分析；
图3为候选酶与已报道内酯合酶的氨基酸序列比对；
图4为候选酶与已报道内酯合酶的进化树分析；
图5为质粒pESC-His和目的基因DBS的葡聚糖凝胶电泳图谱(A：质粒pESC-His和目的基因DBS胶回收的核酸凝胶电泳；B：重组质粒的菌落PCR验证)；
图6为候选酶DBS催化青蒿酸的UPLC检测；
图7为候选酶DBS催化青蒿酸的GC-MS检测；
图8为酶催化产物与去氧青蒿素B标准品的质谱图(A：去氧青蒿素B(DB)标准品的质谱图；B：酶催化后产物的质谱图)；
图9为去氧青蒿素B的标准曲线；
图10为DBS催化青蒿酸生成去氧青蒿素B随时间变化的UPLC检测；
图11为产物去氧青蒿素B在不同反应时间条件下的生成量；
图12为DBS催化青蒿酸生成去氧青蒿素B随温度变化的UPLC检测；
图13为产物去氧青蒿素B在不同反应温度条件下的生成量；
图14为DBS催化青蒿酸的动力学参数。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
本发明首先采用逆向合成的思路推测出催化青蒿酸(Artemisinic acid,AA)生成去氧青蒿素B(Deoxyarteannuin B,DB)的活性酶为内酯合酶，通过文献检索，发现在小白菊内酯的生物合成途径中有一个木香烯内酯合酶(Costunolide synthase,COS)可以发生类似的催化活性。以COS为诱饵在黄花蒿转录组数据库中Blast，从Blast的结果中检索和COS同源的内酯合酶。最后对筛选到的候选酶进行功能验证，得到活性酶，并对活性酶的酶学性质进行考察。具体实验过程如下：
实施例1：活性酶的筛选
根据青蒿酸(Artemisinic acid,AA)和去氧青蒿素B(Deoxyarteannuin B,DB)的化学结构推测催化AA生成DB的过程是一个羧基的酯化过程，故需要内酯合酶的参与(图1中A和B)。以此为基础进行文献检索，发现在小白菊内酯的生物合成途径中木香烯内酯合酶(Costunolide synthase,COS)可以催化香精烯A酸(Germacrene Aacid)生成木香烯内酯(Costunolide)(图1中C)。由于小白菊内酯和黄花蒿都属于菊科，且化合物AA、DB、香精烯A酸和木香烯内酯都为骨架相同的倍半萜类化合物(图1)，所以推测在黄花蒿中催化AA生成DB的活性酶和COS具有同源性。
以COS的氨基酸序列为诱饵，在黄花蒿转录组数据库(NCBI)中进行Blast，从Blast的结果中筛选内酯合酶，然后把筛选到的候选酶与植物中一些常见的内酯合酶进行氨基酸序列比对(图3)和进化树分析(图4)。
结果如图2的Blast结果所示，以COS为诱饵，在黄花蒿转录组数据库中Blast到许多与其相关的候选酶，通过分析发现只有前2个属于内酯合酶，其蛋白的ID号分别为：A0A2U1PPI9，A0A2U1POS5(DBS)。从图3的氨基酸序列比对结果可知，黄花蒿中的2个内酯合酶与已报到的内酯合酶具有较高的序列相似性。从图4的进化树分析结果中可知，DBS与向日葵中的2个内酯合酶具有较高的同源性，而A0A2U1PPI9与已报到内酯合酶的同源性较差。
实施例2：候选酶的表达和功能验证
(1)质粒pESC-His的提取和双酶切
在超净工作台中取10μL pESC-His的甘油菌加入到5mL含有氨苄霉素(Ampicillin，Amp)抗性的LB液体培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600＝0.6，然后采用擎科质粒提取试剂盒提取质粒pESC-His。
采用超微量生物检测仪对提取得到的质粒进行浓度测定，然后按照表1配制反应体系对质粒pESC-His进行双酶切，把配制好的体系置于37℃水浴锅中酶切2h。结束后把酶切反应体系进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，切下对应分子量的凝胶块保存在1.5mL EP管中，最后采用胶回收试剂盒(生工)回收双酶切之后的质粒。
表1.质粒pESC-His的双酶切体系配置表
质粒提取过程如下所示：
向吸附柱中(吸附柱提前放入收集管中)加入250uL Buffer BL，4℃、13500rpm离心1min,活化硅胶膜；
取培养好的菌液，25℃、3500rpm离心10min，弃上清；
加入250μL Buffer S1重悬菌体，涡旋振荡至无菌快为止；
加入250μL Buffer S2，温和地上下反转6-8次，使菌体充分裂解；
加入350μL Buffer S3，温和地上下反转6-8次，25℃、13500rpm离心10min；
将上清转移至吸附柱中，25℃、13500rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
向吸附柱中加入700μL Buffer W2，25℃、13500rpm离心1min，弃废液，重复操作一次；
将吸附柱放回收集管中，25℃、13500rpm离心2min；
取出吸附柱，放入干净的1.5mL EP管中，25℃静置5min，使残留的乙醇充分挥发；
向吸附膜中央加入35μL dd H2O(65℃预热)，25℃静置5min，25℃、13500rpm离心2min；
此时EP管底部的溶液即为提取得到的质粒，可立即用于下游实验或保存于-20℃冰箱中备用。
胶回收过程如下所示：
用干净的手术刀片将含目的片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL EP管中，称重；
按照每100mg琼脂糖加入500μL Buffer B2的比例加入适量Buffer B2；
置于65℃水浴锅中水浴5-10min，直至胶块完全融化；
将融化后的溶液全部转移至吸附柱中，25℃、9000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
向吸附柱中加入300μL Buffer B2，25℃、10000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；
向吸附柱中加入500μL Wash Solution，25℃、10000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，重复操作一次；
将空吸附柱和收集管放入离心机中，25℃、10000rpm离心1min；
取出吸附柱，放入干净的1.5mL EP管中，25℃静置5min，使残留的乙醇充分挥发；
向吸附膜中央加入20μL dd H2O(65℃预热)，25℃静置2min，25℃、10000rpm离心1min；
将所得到的DNA回收液置于-20℃冰箱中保存备用或立即用于下有实验。
结果显示：经质粒提取、双酶切和胶回收得到被SalI和BamHI酶切后的质粒pESC-His，如图5-A的葡聚糖凝胶电泳电泳检测结果所示。
(2)目的基因DBS的扩增
采用植物总RNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)从黄花蒿植株中提取RNA，采用反转录试剂盒(TOYOBO)反转录得到cDNA。根据质粒pESC-His和酶切位点SalI、BamHI对候选酶DBS进行引物设计(表2)，然后候选酶进行PCR扩增，扩增体系和PCR扩增程序如表3、表4所示。PCR扩增结束后把反应体系进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，切下对应分子量的凝胶块保存在1.5mL EP管中，采用胶回收试剂盒(生工)回收扩增的目的基因。
表2.候选酶DBS进行PCR扩增时的引物列表
表3.候选酶DBS的PCR扩增体系
表4.候选酶DBS的PCR扩增程序
注：变性、复性、延伸共进行33个循环。
结果显示：由图5中A的葡聚糖凝胶电泳检测结果可知，均从黄花蒿植株中扩增出相对应的目的基因。
(3)质粒与目的基因的同源重组和转化
采用“Hieff Clone Universal One Step Cloning Kit”试剂盒进行同源重组，50℃重组30min,重组结束后立即转化到大肠杆菌DH5α感受态中。次日，从转化的抗性平板上挑取单克隆进行菌落PCR验证。
结果显示：如图5中B所示，对候选酶的重组质粒进行菌落PCR验证，出现阳性条带，表明重组和转化成功。
(4)片段pESC-His-DBS的克隆、重组到质粒pCDF-DPP1UD上及整合到酵母BY4741基因组中
根据质粒pCDF-DPP1UD选用SacI和HindIII酶切位点，把pESC-His-DBS中的His3promoter—CYC1 terminater片段克隆下来，采用实施例2中步骤(3)的方法重组到pCDF-DPP1UD质粒中，命名为pCDF-DPP1UD-His-DBS。然后克隆pCDF-DPP1UD-His-DBS中的T7promoter—T7 terminater片段，最后把克隆到的片段整合到酵母BY4741基因组中。
(5)候选酶DBS的表达
在超净工作台中吸取步骤(4)中已经整合成功的菌种10μL，加入到5mL葡萄糖为碳源的YPD培养基中，30℃、220rpm条件下培养至菌液OD值为0.4-0.6。取菌液1mL接种到半乳糖诱导的YPD培养基中进行表达，30℃、220rpm条件下培养96小时后采收，采用高压细胞破碎仪(25Pa)破碎菌液，收集菌液立即用于下游实验或保存于-20℃备用。
(6)候选酶DBS的功能验证
建立体外酶催化反应体系：取2mL EP管，依次加入候选蛋白10μM、底物青蒿酸(Artemisinic acid,AA)400μM、辅助因子NADPH 1mM，PBS溶液补齐至1.0mL，在30℃、220rpm条件下避光反应16h。煮沸的候选蛋白(Boiled DBS+Buffer+AA)做为对照组。反应结束后向EP管中加入800μL乙酸乙酯终止反应，25℃、12000rpm离心2min，收集上层有机相。重复萃取3次，合并有机相，浓缩至干，然后加入100μL甲醇(HPLC级)进行UPLC(209nm)、GC-MS检测，UPLC、GC-MS检测条件如表5和表6所示。
结果显示：由图6的UPLC检测结果可知，候选酶DBS催化AA后有产物生成，通过与去氧青蒿素B(Deoxyarteannuin B,DB)标准品对比发现出峰时间相同，推测酶催化产物为DB。但为了进一步验证结果，把相同样品又进行GC-MS检测，如图7所示，发现酶DBS催化组(DBS+Buffer+AA)也有一个产物峰与DB标准品处于同一出峰时间处。通过质谱对比证明酶DBS的催化产物即为DB(图8)，即DBS是活性酶，可以催化AA生成DB。
表5.UPLC的洗脱条件
A：0.1％三氟乙酸水溶液；B：乙腈(HPLC级)。
表6.GC-MS检测条件
实施例3：DBS催化青蒿酸生成去氧青蒿素B的最佳时间考察
首先建立去氧青蒿素B(Deoxyarteannuin B,DB)的标准曲线。采用单一变量法考查DBS发挥催化活性时的最佳反应时间，反应温度为30℃，底物青蒿酸(Artemisinic acid,AA)的浓度为1mM。反应时间考察范围分别为：8、16、24、32、40、48、56和64h，每组设置3个平行。按照实施例2的方法建立关于DBS的体外活性实验，在不同反应时间后终止反应，根据产物DB的生成量确定活性酶DBS催化AA生成DB的最佳反应时间。
结果显示：如图9所示，建立DB的标准曲线，y＝0.5058x+0.3028,R2＝0.9994。如图10和图11所示，DBS催化AA生成DB的最适反应时间为40h。
实施例4：DBS催化青蒿酸生成去氧青蒿素B的最佳反应温度考察
采用单一变量法考察DBS发挥催化活性时的最佳反应温度，反应时间为40h，底物青蒿酸(Artemisinic acid,AA)的浓度为1mM。反应温度的考察范围分别为：20、30、40、50和60℃，每组设置3个平行。在不同温度下分别建立关于DBS的体外活性实验，根据产物去氧青蒿素B(Deoxyarteannuin B,DB)的生成量确定活性酶DBS催化AA生成DB的最佳反应温度。
结果显示：由图12和图13可知，DBS催化AA生成DB的最佳反应温度为30℃。
实施例5：DBS催化青蒿酸的酶促动力学参数
根据实施例3和实施例4研究结果已知DBS催化青蒿酸(Artemisinic acid,AA)生成去氧青蒿素B(Deoxyarteannuin B,DB)的最佳反应时间为40h，最佳反应温度为30℃。故在最佳条件下考察活性酶DBS催化AA的动力学参数，底物AA的浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0和3.0mM，在最佳反应时间和最佳反应温度条件下进行体外活性验证，分别加入不同浓度底物，每组设置3个平行。反应结束后通过产物DB的生成量和反应时间计算不同底物浓度对应DBS的反应速率，根据底物浓度和反应速率绘制米氏方程曲线，得出DBS催化AA的Kcat/Km值。
结果显示：由图14可知，DBS催化AA的Kcat/Km值为1.43×10-5min-1.μM-1。
Claims (9)
1.去氧青蒿素B合酶在催化青蒿酸生成去氧青蒿素B中的应用，所述去氧青蒿素B合酶（Deoxyarteannuin B synthase, DBS），其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述的去氧青蒿素B合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述去氧青蒿素B合酶的异源表达具体为在原核生物或真核生物中的异源表达。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述去氧青蒿素B合酶催化青蒿酸生成去氧青蒿素B时的反应时间为8-64 h，反应温度为20-60℃。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述去氧青蒿素B合酶催化青蒿酸生成去氧青蒿素B时的反应时间为16-56 h，反应温度为20-40℃。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述去氧青蒿素B合酶催化青蒿酸的Kcat/Km值为1.43×10-5 min-1.μM-1。
7.去氧青蒿素B合酶在产青蒿素类化合物底盘菌株构建中的应用，所述去氧青蒿素B合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.一种去氧青蒿素B的催化合成方法，其特征在于：以青蒿酸为底物，利用权利要求1所述的去氧青蒿素B合酶催化生成去氧青蒿素B。
9.去氧青蒿素B合酶在食品工业、医药业或合成生物学领域中的应用，所述去氧青蒿素B合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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