CN113980920B

CN113980920B - 一种碳碳双键还原酶及其用途

Info

Publication number: CN113980920B
Application number: CN202111289703.7A
Authority: CN
Inventors: 杨华; 周少华; 曾茜垚; 黄妤; 吴飞驰; 仇萍; 黄宇明; 熊兴耀; 曾建国; 谢瑞
Original assignee: Hunan Zhengqing Pharmaceutical Group Co ltd
Current assignee: Hunan Zhengqing Pharmaceutical Group Co ltd
Priority date: 2021-11-02
Filing date: 2021-11-02
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2041-11-02
Also published as: CN113980920A

Abstract

本发明提供了一种碳碳双键还原酶及其用途。本发明提供了一种碳碳双键还原酶，所述还原酶包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其编码所述的碳碳双键还原酶。本发明还提供了一种用于制备青藤碱的方法，所述方法包括使用所述碳碳双键还原酶将清风藤碱催化为异青藤碱的步骤。本发明提供的碳碳双键还原酶为青藤碱生物合成的关键酶基因，为实现青藤碱的合成生物学研究及产业化应用奠定坚实的基础。

Description

一种碳碳双键还原酶及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体地涉及一种碳碳双键还原酶，本发明还涉及碳碳双键还原酶在制备青藤碱中的用途。

背景技术

青风藤(Sinomenium acutum)属于毛茛目防己科(Menispermaceae)风龙属(Sinomenium Diels)植物，是我国沿用多年的传统中药材。在从青风藤分离提取得到众多的化学成分中，青藤碱是青风藤药材中的最重要的药理活性成分。目前，青藤碱主要通过化学方法从青风藤中提取，而青风藤的获取大部分通过开发青风藤自然资源。由于近年来对青藤碱的需求量急剧增加，青风藤被盗挖滥挖的现象十分严重。同时，青风藤具有生长周期长、受环境影响大、采集困难和难以大规模种植等问题。因此，一味通过开发青风藤自然资源来获取青藤碱终究不是长久之计。除此之外，青藤碱化学分子结构比较复杂，化学合成需要多步反应，很难确定实际可行的化学合成方法。

为了解决这些问题，可以采取合成生物学的方法，将青藤碱生物合成途径相关基因整合到大肠杆菌、酿酒酵母等工程菌中，以简单碳源和氮源作为底物进行目的产物青藤碱的生产，或者按照需要对相关基因进行基因沉默和过表达，得到青风藤青藤碱高产植株。

当前，青藤碱生物合成途径的研究中还有存疑之处。例如，曾茜垚(曾茜垚.青风藤转录组分析及青藤碱生物合成通路相关基因的挖掘.湖南农业大学,2019)发现青风藤材料存在L-酪氨酸到(S)-网状番荔枝碱BIAs生物合成途径中的一系列中间产物和吗啡生物合成途径中的1,2-去氢网状番荔枝碱、(R)-网状番荔枝碱和salutaridine，据此预测出青风藤在青风藤中的生物合成途径，青风藤合成途径中的前半段可能和吗啡的生物合成途径重叠，salutaridine在碳碳双键还原酶的催化下加氢还原生成8,14-Dihydrosalutaridine，再经过青藤碱O-去甲基酶(Sinomenine-O-demethylase，SNOD)作用生成O-去甲基青藤碱，之后通过异构酶(isomerase,ISO)的催化生成青藤酮，最后在甲基转移酶(O-methyltransferase,OMT)的催化下生成青藤碱。但是，salutaridine和清风藤碱虽然结构非常相似，但并非同一种物质，两者存在旋光性的差异，8,14-Dihydrosalutaridine和异青藤碱这两种物质也是如此。

因此，当前对青藤碱生物合成途径的解析和相关基因的功能验证存在需求，挖掘青藤碱生物合成调控的关键位点以及合成的关键酶基因，能够为实现青藤碱的合成生物学研究及产业化应用奠定坚实的基础。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种从青风藤中筛选得到的碳碳双键还原酶，本发明还提供了所述还原酶的制备方法及其用途。本发明的发明人通过无细胞蛋白合成体系对所述碳碳双键还原酶进行表达，并验证了所述酶的生物活性和底物独特性，为实现青风藤青藤碱的合成生物学研究及产业化应用奠定坚实的基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供了一种碳碳双键还原酶，所述还原酶包含选自以下的氨基酸序列：

1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；或

3)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有69％、79％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1

MASITSSNSSGEDDEQVMMTSNKQIIFRDYITSGSPKETDMVARTSSIRLKVPEGSNGVLVKNLYLSCDPYMRFRMSAKGNCVVSAFTPGLPIVGYGVARVLDSGNLEFKEDDLVWGFTGWEEYSLIMDTQSLIKIKFTDIPLSYYAGILGKAGMTAYAGFYEICSPKKGEYVFVSSAAGSVGQLVGQFAKLMGCYVVGSAGSNEKVNLLKSKLGFDEAFNYNEEDDLNATLQRYFPEGIDIYFENVGGEMLDAVLLNMRIHGRIAMCGTISQYNVDQSYGVQNLFCLISKRIRMEGFVVLDYYNQYYTKFVELIRQYIKDEKIVYMEDVVEGLESGPAALVGLFNGCNMGKQVVVVARE

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽或蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽或蛋白的片段、或肽或蛋白的变体与前述氨基酸序列同源性在69％以上，均属于本发明的保护范围之列。具体的变体可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述的肽或蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持与本发明所述的碳碳双键还原酶相同的生物学功能或活性的肽或蛋白，可以是下列情形：(I)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(II)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(III)成熟肽或蛋白与另一种化合物(比如延长肽或蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融合到成熟的肽或蛋白而形成的肽或蛋白序列(如用来纯化此肽蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方法所用的宿主，本发明的肽或蛋白可以是糖基化的。本发明的肽或蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

另一方面，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其编码所述的碳碳双键还原酶；

所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的同源性为70％以上。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的变体，只要其与该核苷酸序列具有70％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述核苷酸序列的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的核苷酸序列。此核苷酸序列的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是核苷酸序列的替换形式，它可能是核苷酸序列的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽或蛋白的功能。

另外，可与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的肽或蛋白与SEQ ID NO:1所示的肽或蛋白有相同的生物学功能和活性。

优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

ATGGCGAGTATTACTAGTAGTAATAGCAGTGGTGAGGATGATGAACAGGTGATGATGACGAGCAACAAGCAGATCATATTCCGAGATTACATCACATCTGGTTCTCCAAAAGAGACGGACATGGTTGCGAGAACAAGCAGTATAAGACTGAAGGTTCCAGAGGGATCTAATGGAGTTTTGGTGAAAAACCTCTACTTGTCTTGTGATCCTTACATGCGATTTCGAATGAGCGCCAAGGGTAACTGCGTTGTCTCTGCCTTCACTCCTGGTTTACCAATTGTGGGATATGGTGTGGCTAGGGTTTTGGATTCTGGGAATCTAGAGTTCAAGGAGGATGATTTGGTGTGGGGATTCACAGGATGGGAAGAATATAGCCTCATTATGGACACTCAATCGTTAATTAAAATCAAGTTCACTGATATCCCACTTTCCTATTATGCAGGAATTCTTGGAAAGGCTGGTATGACAGCCTATGCAGGTTTTTATGAGATTTGCAGTCCAAAGAAAGGAGAGTATGTTTTTGTATCATCAGCAGCTGGTTCAGTGGGCCAGCTTGTTGGACAATTTGCTAAGCTGATGGGTTGCTATGTGGTTGGTAGTGCTGGATCCAATGAAAAGGTCAATCTATTAAAGAGCAAGCTTGGGTTTGATGAGGCTTTTAACTACAATGAAGAGGACGATCTCAATGCAACATTGCAAAGGTACTTCCCCGAAGGTATTGATATATACTTTGAGAACGTAGGAGGTGAGATGCTCGACGCAGTCCTACTCAACATGAGAATTCATGGTAGAATTGCAATGTGTGGAACTATTTCTCAGTATAATGTTGACCAATCTTATGGAGTACAAAATTTGTTTTGCCTCATCTCAAAGCGTATTCGTATGGAAGGATTTGTAGTCCTAGATTACTATAATCAGTATTATACTAAGTTTGTGGAATTAATTCGACAGTACATAAAGGACGAGAAGATAGTATATATGGAAGATGTTGTAGAGGGACTCGAAAGTGGACCTGCAGCCCTCGTAGGACTGTTTAATGGTTGCAACATGGGAAAACAAGTAGTTGTAGTTGCTCGTGAATGA

本发明还提供了一种表达载体，其包含所述的多核苷酸；

优选地，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体；优选地，所述表达载体为用于无细胞蛋白合成体系的质粒载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含所述的表达载体；

优选地，所述宿主细胞选自真核细胞或原核细胞；

更优选地，所述真核细胞是真菌细胞，更进一步优选为酵母菌；

更优选地，所述原核细胞选自大肠杆菌、分枝杆菌、假单胞菌、红球菌、节杆菌、枯草杆菌或放线菌细胞。

本发明还提供了一种体外无细胞蛋白合成体系，其包含用于无细胞蛋白合成体系的表达载体；

优选地，所述体外无细胞蛋白合成体系为原核体系或真核体系；

更优选地，所述原核体外无细胞蛋白合成体系包含大肠杆菌提取物；

更优选地，所述真核体外无细胞蛋白合成体系包含兔网织红细胞裂解液或麦芽提取物。

本发明还提供了一种制备所述的碳碳双键还原酶的方法，所述方法包括以下步骤：

在有助于生产所述碳碳双键还原酶的条件下培养所述的宿主细胞，从得到的培养液中获得所述碳碳双键还原酶；或

使用体外无细胞蛋白合成体系制备所述碳碳双键还原酶。

本发明的要点在于提供了SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

本发明还提供了所述的碳碳双键还原酶、所述的多核苷酸、所述的表达载体所述的宿主细胞或所述的体外无细胞蛋白合成体系在制备异青藤碱或2-壬酮或青藤碱中的用途。

本发明还提供了一种用于制备异青藤碱或2-壬酮的方法，其包括使用所述的碳碳双键还原酶、所述的多核苷酸、所述的表达载体、所述的宿主细胞或所述的体外无细胞蛋白合成体系催化清风藤碱或3-壬烯-2-酮，获得异青藤碱或2-壬酮。

本发明还提供了一种用于制备青藤碱的方法，所述方法包括将清风藤碱催化为异青藤碱的步骤。

根据本发明所述的制备青藤碱的方法，包括以下步骤：

1)使用所述方法，将清风藤碱制备为异青藤碱；

2)异青藤碱经SNOD酶的作用生成去甲基青藤碱；

3)去甲基青藤碱经ISO酶的作用生成青藤酮；

4)青藤酮经OMT酶的作用生成青藤碱。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了青藤碱生物合成调控的关键位点以及合成的关键酶基因，为实现青藤碱的合成生物学研究及产业化应用奠定坚实的基础。

附图说明

下面将参考附图来描述本申请示例性实施例的特征、优点和技术效果：

图1是根据本发明的实施例2使用的无细胞表达载体pD2P_1.06e-8His-eGFP的质粒图谱；

图2是根据本发明的实施例2扩增的ScDBR1基因的凝胶电泳；

图3是根据本发明的实施例2扩增得到的ScDBR1基因与表达载体连接转化后获得的菌落PCR检测的凝胶电泳图；

图4是根据本发明的实施例2获得的ScDBR1重组蛋白的SDS-PAGE图，其中M：蛋白标记；1：粗蛋白；2：纯化重组蛋白；3和4：对照；

图5是根据本发明的实施例2获得的ScDBR1蛋白酶催化反应获得的产物的气相色谱图；其中，图5A：ScDBR1催化产物气相色谱图；图5B：催化产物中的2-壬酮的质谱图；图5C：催化产物中的3-壬烯-2-酮的质谱图；图5D：ScDBR1催化产物液相色谱图；图5E：催化产物中异青藤碱质谱图；图5F：催化产物中清风藤碱质谱图。

具体实施方式

下面将详细描述本发明的各个方面的特征和示例性实施例。在下面的详细描述中，提出了许多具体细节，以便提供对本发明的全面理解。但是，对于本领域技术人员来说很明显的是，本发明可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本发明的示例来提供对本发明的更好的理解。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合附图对实施例进行详细描述。

实施例1碳碳双键还原酶ScDBR1基因的发现和鉴定

1.1青风藤ScDBR1基因基因合成

根据NCBI中其他物种中已知功能的碳碳双键还原酶，对已建立的青风藤转录组数据库信息进行检索，得到ScDBR1基因序列(SEQ ID NO:1所示)，由上海生工完成基因合成以及克隆载体的构建。

其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

1.2青风藤ScDBR1基因的生物信息分析

通过ExPASy Protparam生物信息学工具对ScDBR1基因编码蛋白的氨基酸序列进行理化性质分析。分析结果显示ScDBR1基因编码360个氨基酸，ScDBR1蛋白分子质量是39.95kDa，推测ScDBR1蛋白的分子式为C₁₇₈₆H₂₇₇₅N₄₅₃O₅₄₁S₂₂，等电点PI为4.87；不稳定系数为27.69，一般认为不稳定系数小于40为稳定蛋白，因此ScDBR1蛋白为稳定蛋白；平均亲水性为-0.025，为亲水蛋白。

用SignalP 3.0Server在线软件对青风藤ScDBR1蛋白的信号肽进行预测，可知在ScDBR1蛋白的氨基酸序列中不存在信号肽，ScDBR1蛋白是一种非分泌蛋白。

通过Prot Scale在线程序进行亲水性分析，发现ScDBR1蛋白的肽链总体表现为亲水性，因此可以认为青风藤ScDBR蛋白质属于亲水性蛋白。

采用SWISS-MODEL对青风藤ScDBR1蛋白的氨基酸序列进行分析，同源建模预测ScDBR1蛋白的三级结构，ScDBR1蛋白三级结构与覆盆子酮合酶(raspberry ketonesynthase)三级结构最为相似，相似性达到了68.30％。

使用DNAMAN将已知的碳碳双键还原酶与青风藤ScDBR1蛋白进行氨基酸序列多重序列比对。发现ScDBR1蛋白与其他物种的碳碳双键还原酶有相似的保守区域，序列保守性较高。使用MEGA7.0构建的系统进化树显示ScDBR1与黄花蒿中的AaDBR1关系较近。

实施例2碳碳双键还原酶ScDBR1蛋白的表达纯化及功能验证

2.1材料

2.1.1表达载体

表达载体采用康码(上海)生物科技有限公司所设计构建pD2P_1.06e-8His-eGFP无细胞表达载体，表达载体质粒图谱见图1。

2.1.2验试剂和仪器

试剂和所使用仪器详见表1。

表1主要试剂和仪器

2.1.3主要溶液配制方法

本章试验所使用的主要溶液的配制方法如表2。

表2主要溶液配制方法

2.1.4引物

采用Vazyme CE Design引物在线设计软件(https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html)进行含有BamHI、HindⅢ酶切位点的无缝克隆特异性引物的设计，如表3所示，扩增含有载体15-25nt重叠序列的目的片段。菌落PCR和测序的引物采用pDP无细胞表达载体的通用引物D2P-1.06e-F和D2P-1.06e-R。

表3引物序列

2.2实验方法

2.2.1目的片段克隆

以含有ScDBR1基因的克隆载体为模板，采用表3中的无缝克隆特异性引物进行PCR扩增得到5’端和3’端带有pDP无细胞表达载体重叠序列的目的片段。PCR反应体系和反应条件如表4和表5所示。

表4 PCR反应体系

表5 PCR反应条件

用1％琼脂糖凝胶120V电泳25min检测PCR产物。由于质粒模板的和重组载体具有相同的抗性，因此使用改良型DpnI限制性内切酶(DMT Enzyme)对质粒模板进行消化。每50μL PCR产物加入1μL DpnI酶，37℃孵育1h。反应结束后用EasyPure PCR Purification Kit进行PCR产物的纯化，具体步骤参照说明书如下：

(1)取50μL PCR产物，加入250μL Binding缓冲液，混匀后加入离心柱，室温静置1min，10 000×g离心1min，流出液。

(2)离心柱加入650μL Wash缓冲液，10 000×g离心1min，去除流出液。

(3)10 000×g离心2min，彻底除去残留的Wash缓冲液，在超净工作台中开盖5min挥发乙醇。

(4)将离心柱转置于新的离心管中，在离心柱中央加入40μL去离子水，室温静置1min，10 000×g离心1min洗脱DNA，洗脱出的DNA保存于-20℃备用。

2.2.2表达载体质粒酶切线性化

pD2P无细胞表达载体质粒采用限制性内切酶BamH I和HindⅢ进行酶切，酶切体系如表6所示。按照酶切体系加入各组分，置于37℃孵育15分钟，加入10×DNA Loading缓冲液使酶失活。

表6酶切反应体系

酶切产物通过1％琼脂糖凝胶120V电泳30min检测，采用EasyPure Quick GelExtraction Kit切胶回收纯化酶切产物，具体步骤参照试剂盒说明如下：

(1)在紫外灯下切取线性载体质粒DNA目的条带，放入离心管中称重。

(2)根据所切凝胶的质量加入GSB溶液，每100mg加入300μL，置于55℃水浴融胶10min，每2min间断混合以确保凝胶块完全融化，当凝胶完全融化后观察溶液的颜色，如颜色为紫色时加入适量的3M醋酸钠(pH5.2),调整溶液颜色至和GSB溶液颜色相同的黄色。

(3)融化的凝胶溶液降至室温之后，加入离心柱中静置1min，10000×g离心1min，弃去流出液。

(4)加入650μL WB溶液，10 000g离心1min，弃去流出液。

(5)10 000×g离心2min，弃去流出液。

(6)将离心柱置于新的离心管中，开盖静置1min，使残留的乙醇挥发干净，在离心柱的中央加入30μL 60℃预热的去离子水，室温静置1min。

(7)10 000×g离心1min洗脱DNA，得到的DNA置于-20℃保存备用。

2.2.3无细胞表达载体的构建

用微量分光光度计测定纯化后的线性载体质粒DNA和目的片段的浓度和质量，按摩尔比1：2的比例将线性载体质粒DNA和目的片段加入PCR管中进行无缝克隆，无缝克隆反应体系如表7，将各组分轻轻混合，50℃反应15分钟。反应结束后，将反应管置于冰上冷却数秒钟，反应产物保存于-20℃备用。

表7无缝克隆体系

2.2.4重组载体转化

将重组产物用于转化DH5α感受态细胞，具体步骤参考试剂盒说明书如下：

(1)从-80℃超低温冰箱中取出DH5α感受态细胞置于冰上冻融。

(2)取4.2.3中得到5μL连接产物加入到50μL刚刚解冻的感受态细胞中，轻轻混合，冰浴30min。

(3)反应管置于42℃热激30sec，然后立即转移至冰上2min。

(4)加入450μL LB培养基，置于摇床中200rpm，37℃培养1h。

(5)取100μL菌液均匀涂布在LB抗性平板上，恒温培养箱中37℃过夜培养。

2.2.5重组载体鉴定

采用通用引物D2P-1.06e-F和D2P-1.06e-R进行菌落PCR鉴定阳性克隆，挑取单克隆接种于LB抗性培养基中，置于摇床中200rpm，37℃培养14h。新鲜的重组菌液送往上海生工进行测序。至此获得ScDBR1基因无细胞表达重组载体，即为pD2P-ScDBR1。

2.2.6重组质粒提取

将重组菌株接种于LB抗性培养基中，在恒温摇床中37℃，200rpm振荡培养16h，使用提取重组质粒，具体步骤参照说明试剂盒说明书如下：

(1)取2mL过夜培养的菌液，10 000×g离心1min，吸尽上清。

(2)加入250μL RB(含RNase A)，振荡，悬浮菌体沉淀。

(3)加入250μL LB，上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解。

(4)加入350μL NB，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，置于室温下静置2min。

(5)12 000×g离心5min，吸取上清加入离心柱中，12 000×g离心1min，弃流出液。

(6)加入650μLWB(提前加入4倍体积的乙醇)，12 000×g离心1min，弃流出液。

(7)12 000×g离心1-2min，彻底去除残留的WB。

(8)将离心柱置于新的离心管中，在离心柱的中央加入50μL 60℃预热去离子水，室温静置1min。

(9)10 000×g离心1min洗脱DNA，洗脱得到的DNA置于-20℃保存备用。

2.2.7蛋白表达

将重组质粒加入已经溶解好的无细胞蛋白表达反应液中，使蛋白反应液中的质粒的终浓度达到20ng/μL，涡旋混匀后将蛋白反应液分装到24孔板中，用透气膜进行封口，置于恒温摇床中30℃，150rpm振荡反应3h。

2.2.8聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)聚丙烯酰胺凝胶的制备

将干净晾干的玻璃板放入电泳槽支架上，架好和固定好胶板。按表8分别配制聚丙烯酰胺凝胶的分离胶和浓缩胶。分离胶混合后立即加入到电泳槽两玻璃板之间，距上口约3cm停止，再加一薄层水进行水封，约40min，分离胶常温下自然凝固后将水吸去。浓缩胶混合后立即加到分离胶上，在两玻璃板之间垂直插入梳子，浓缩胶凝固后将梳子小心拔出。

表8聚丙烯酰胺凝胶配制体系

(2)电泳

待测蛋白样品与蛋白上样缓冲液混匀，100℃水浴保温5min，12000r/min，离心10min，取上清液进行SDS-PAGE分析。将预染蛋白Marker和待测蛋白样品逐一加入各点样孔中。向电泳槽中加入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液，然后连接电源，负极在上，正极在下，电泳电压150V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。

(3)显色

电泳结束后，取下凝胶用蒸馏水冲洗干净后，加入50-100mL考马斯亮蓝染色液中，置于水平摇床上60rpm染色3h。染色结束后，倒掉染色液，用蒸馏水清洗，然后加入50-100mL考马斯亮蓝脱色液，置于水平摇床上60rpm脱色过夜。脱色结束后，弃去脱色液，加入50-100mL蒸馏水，60rpm清洗10min，根据蛋白预染Maker对目的蛋白条带进行比对，凝胶保存在蒸馏水。

2.2.9蛋白纯化

(1)取1.5mL无细胞蛋白表达反应液于2mL离心管中，置于4000rpm离心3min，收集上清。

(2)取20μL His-Monster beads，用1000μL Binding缓冲液洗涤两次，用磁力架磁吸收集beads，备用。

(3)向上述上清液中加入洗涤好的His-Monster beads，充分震荡30sec，在四维旋转混合仪上旋转混合1h。

(4)孵育完成后，磁力架磁吸收集beads，吸弃上清。

(5)再加入1000μL Washing缓冲液,充分震荡30sec，磁吸收集beads，吸弃上清；重复洗3次。

(6)向beads中加入30-50μL Elution缓冲液，用枪头吸吹至混匀，室温静置1min后，用磁力架磁吸beads，收集上清，得到目标蛋白。

2.2.10蛋白透析

样品经磁珠法纯化后含有一定量的咪唑，需要通过透析予以去除。用无菌水清洗透析袋内部后，将透析袋一端夹紧，用移液枪缓慢加入纯化后样品，将另一端也用夹子夹紧，置于25mM Tris·HCl(PH 8.0)透析液中透析9h(每3h更换一次透析液)，将透析后的蛋白在-80℃条件下保存备用。

2.2.11酶催化反应

参考刘丽萍等报道的方法进行酶催化反应，取重组蛋白溶液，加入0.1mol/L MES缓冲液调节pH至6.0，加入0.1mmol/L NADPH作为还原反应的供氢体，加入0.1mmol/L底物，以灭活后的重组蛋白作为对照，30℃孵育3h。分别选择以3-壬烯-2酮、胡薄荷酮和清风藤碱作为底物进行酶催化反应。反应结束后，置于100℃水浴20min使重组蛋白灭活以终止催化反应。以3-壬烯-2酮、胡薄荷酮作为底物的催化产物使用乙酸乙酯进行萃取；以清风藤碱作为底物的催化产物使用真空冷冻干燥机进行干燥，然后用乙醇对干粉进行重悬。待测样品分别过0.22μm有机相滤膜，置于进样小瓶中，保存在4℃条件下备用。

2.2.12催化产物的检测

以3-壬烯-2酮和胡薄荷酮作为底物的催化产物使用GC-MS/MS进行检测。运用GCMS-TQ8050进行分析测定。配备SH-Rxi-5Sil MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。以高纯度氦气作为载气，纯度≥99.99％；汽化室温度：250℃；程序升温：初始温度80℃，保持l min，以15℃/min升温至180℃，再以5℃/min升温至230℃，保持3min；进样方式：不分流；恒流模式，柱流量：1mL/min。离子源：EI(electron ionization)源；离子源温度：200℃；四极杆温度：150℃；电压70eV；传输线温度(接口温度)：200℃。溶剂延迟：3min。选择离子SCAN模式。在上述条件下，目标物可达到良好的分离度和准确度。以清风藤碱作为底物的催化产物使用LC-MS/MS进行检测。色谱条件：色谱柱：AgilentPoroshell 120EC-C18 4.6×100mm，2.7μm；流动相A：0.1％甲酸水流动相B：甲醇检测器DAD参数：210nm；柱温：35℃；进样量：10μL；洗脱程序：0-20min A：95％-5％；20-30min A：5％-5％。质谱条件：电喷雾离子化源(ESI)；毛细管电压：4kV；干燥气温度：250℃；干燥气流速：11L/min；碎裂电压：100V；正离子模式扫描检测，一级质谱扫描范围：m/z100-1000；二级质谱扫描范围：m/z 100-1000。

2.3结果与分析

2.3.1 ScDBR1基因PCR扩增

以ScDBR1基因克隆载体质粒为模板，用含有无细胞表达载体15-25nt重叠序列的无缝克隆特异性引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，测序鉴定后目的片段的长度为1113bp，包含了同源臂序列和基因序列。

2.3.2表达载体构建和鉴定

ScDBR1基因与表达载体连接后，重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用抗性平板进行筛选。挑取单克隆进行菌落PCR检测，1％琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR结果如图3所示。将鉴定正确的重组质粒送往擎科生物技术有限公司进行测序，测序结果表明ScDBR1基因成功插入pD2P无细胞表达载体的MCS区域。

2.3.3 ScDBR1蛋白SDS-PAGE检测

将重组载体质粒加入到无细胞蛋白表达反应液中，产生在N-末端含有His标签的重组蛋白，将空载体对照。表达后，蛋白纯化获得纯化蛋白，通过SDS-PAGE分析粗蛋白和纯化的重组蛋白。SDS-PAGE结果如图4所示，显示ScDBR1重组蛋白成功得到表达，分子量约为43.4KDa。纯化后蛋白条带单一，没有出现杂带。

2.3.4 ScDBR1蛋白酶催化实验及检测

为验证得到ScDBR1重组蛋白是否具有双键还原酶催化活性，分别以3-壬烯-2酮、胡薄荷酮和清风藤碱作为催化底物，加入NADPH和MES缓冲液，30℃反应3h。通过GC-MS/MS和LC-MS/MS检测酶催化产物，结果如图5所示，催化产物气相色谱图(图5A)中，4.897min出现预期产物2-壬酮的特征峰，催化底物3-壬烯-2酮的特征峰出现在5.632min。催化产物中的2-壬酮的质谱图(图5B)显示对应特征离子(m/z)分别为为58，71，142，催化产物中的3-壬烯-2酮的质谱图(图5C)显示对应特征离子(m/z)为55，97，125，与标品一致，而以胡薄荷酮作为底物的催化产物中没有发现可能的产物L-薄荷酮；催化产物液相色谱图(图5D)中，9.942min出现催化底物清风藤碱的特征峰，21.285min出现催化产物异青藤碱的特征峰，两种生物碱的质谱图(图5E和图5F)也出现了相应特征离子。结果表明ScDBR1重组蛋白能够分别催化3-壬烯-2酮和清风藤碱的碳碳双键还原生成2-壬酮和异青藤碱。

本申请通过无细胞蛋白合成体系完成了青风藤双键还原酶ScDBR1蛋白的表达，pD2P无细胞表达载体具有T7强启动子，能够对严谨调控、高效表达目的基因，N端具有8×His标签，方便后续的检测和纯化，具有便捷、快速、高效的特点，蛋白质表达水平较高。

ScDBR1重组蛋白经过磁珠纯化和蛋白透析脱盐后进行酶催化实验，以清风藤碱、3-壬烯-2-酮和胡薄荷酮作为催化底物，以NADPH作为还原反应的供氢体进行催化，催化产物经过预处理后采用LC-MS/MS和GC-MS/MS进行检测。结果表明，ScDBR1重组蛋白能够催化清风藤碱和3-壬烯-2-酮的碳碳双键还原生成异青藤碱和2-壬酮，但不能催化胡薄荷酮生成L-薄荷酮，这进一步说明了碳碳双键还原酶的底物独特性，ScDBR1重组蛋白具有碳碳双键还原酶活性。

虽然已经参考优选实施例对本申请进行了描述，但在不脱离本申请的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件，尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本申请并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

序列表

<110> 湖南正清制药集团股份有限公司

<120> 一种碳碳双键还原酶及其用途

<130> 21NI1565

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> Sinomenium acutum

<400> 1

Met Ala Ser Ile Thr Ser Ser Asn Ser Ser Gly Glu Asp Asp Glu Gln

1 5 10 15

Val Met Met Thr Ser Asn Lys Gln Ile Ile Phe Arg Asp Tyr Ile Thr

20 25 30

Ser Gly Ser Pro Lys Glu Thr Asp Met Val Ala Arg Thr Ser Ser Ile

35 40 45

Arg Leu Lys Val Pro Glu Gly Ser Asn Gly Val Leu Val Lys Asn Leu

50 55 60

Tyr Leu Ser Cys Asp Pro Tyr Met Arg Phe Arg Met Ser Ala Lys Gly

65 70 75 80

Asn Cys Val Val Ser Ala Phe Thr Pro Gly Leu Pro Ile Val Gly Tyr

85 90 95

Gly Val Ala Arg Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Glu Phe Lys Glu Asp

100 105 110

Asp Leu Val Trp Gly Phe Thr Gly Trp Glu Glu Tyr Ser Leu Ile Met

115 120 125

Asp Thr Gln Ser Leu Ile Lys Ile Lys Phe Thr Asp Ile Pro Leu Ser

130 135 140

Tyr Tyr Ala Gly Ile Leu Gly Lys Ala Gly Met Thr Ala Tyr Ala Gly

145 150 155 160

Phe Tyr Glu Ile Cys Ser Pro Lys Lys Gly Glu Tyr Val Phe Val Ser

165 170 175

Ser Ala Ala Gly Ser Val Gly Gln Leu Val Gly Gln Phe Ala Lys Leu

180 185 190

Met Gly Cys Tyr Val Val Gly Ser Ala Gly Ser Asn Glu Lys Val Asn

195 200 205

Leu Leu Lys Ser Lys Leu Gly Phe Asp Glu Ala Phe Asn Tyr Asn Glu

210 215 220

Glu Asp Asp Leu Asn Ala Thr Leu Gln Arg Tyr Phe Pro Glu Gly Ile

225 230 235 240

Asp Ile Tyr Phe Glu Asn Val Gly Gly Glu Met Leu Asp Ala Val Leu

245 250 255

Leu Asn Met Arg Ile His Gly Arg Ile Ala Met Cys Gly Thr Ile Ser

260 265 270

Gln Tyr Asn Val Asp Gln Ser Tyr Gly Val Gln Asn Leu Phe Cys Leu

275 280 285

Ile Ser Lys Arg Ile Arg Met Glu Gly Phe Val Val Leu Asp Tyr Tyr

290 295 300

Asn Gln Tyr Tyr Thr Lys Phe Val Glu Leu Ile Arg Gln Tyr Ile Lys

305 310 315 320

Asp Glu Lys Ile Val Tyr Met Glu Asp Val Val Glu Gly Leu Glu Ser

325 330 335

Gly Pro Ala Ala Leu Val Gly Leu Phe Asn Gly Cys Asn Met Gly Lys

340 345 350

Gln Val Val Val Val Ala Arg Glu

355 360

<210> 2

<211> 1083

<212> DNA

<213> Sinomenium acutum

<400> 2

atggcgagta ttactagtag taatagcagt ggtgaggatg atgaacaggt gatgatgacg 60

agcaacaagc agatcatatt ccgagattac atcacatctg gttctccaaa agagacggac 120

atggttgcga gaacaagcag tataagactg aaggttccag agggatctaa tggagttttg 180

gtgaaaaacc tctacttgtc ttgtgatcct tacatgcgat ttcgaatgag cgccaagggt 240

aactgcgttg tctctgcctt cactcctggt ttaccaattg tgggatatgg tgtggctagg 300

gttttggatt ctgggaatct agagttcaag gaggatgatt tggtgtgggg attcacagga 360

tgggaagaat atagcctcat tatggacact caatcgttaa ttaaaatcaa gttcactgat 420

atcccacttt cctattatgc aggaattctt ggaaaggctg gtatgacagc ctatgcaggt 480

ttttatgaga tttgcagtcc aaagaaagga gagtatgttt ttgtatcatc agcagctggt 540

tcagtgggcc agcttgttgg acaatttgct aagctgatgg gttgctatgt ggttggtagt 600

gctggatcca atgaaaaggt caatctatta aagagcaagc ttgggtttga tgaggctttt 660

aactacaatg aagaggacga tctcaatgca acattgcaaa ggtacttccc cgaaggtatt 720

gatatatact ttgagaacgt aggaggtgag atgctcgacg cagtcctact caacatgaga 780

attcatggta gaattgcaat gtgtggaact atttctcagt ataatgttga ccaatcttat 840

ggagtacaaa atttgttttg cctcatctca aagcgtattc gtatggaagg atttgtagtc 900

ctagattact ataatcagta ttatactaag tttgtggaat taattcgaca gtacataaag 960

gacgagaaga tagtatatat ggaagatgtt gtagagggac tcgaaagtgg acctgcagcc 1020

ctcgtaggac tgtttaatgg ttgcaacatg ggaaaacaag tagttgtagt tgctcgtgaa 1080

tga 1083

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgcccttgc tcaccaagct ttcattcacg agcaactaca actacttg 48

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accatcacgg gagcggcgga tccatggcga gtattactag tagtaatagc agt 53

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtgatgtcg gcgatatagg 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttattgctca gcggtggc 18

Claims

1.一种碳碳双键还原酶，其特征在于，所述还原酶的氨基酸序列如下：

SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列。

2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的碳碳双键还原酶。

3. 根据权利要求2所述的多核苷酸，其多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种表达载体，其包含权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体。

6.根据权利要4或5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为用于无细胞蛋白合成体系的质粒载体。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求4-6中任一项所述的表达载体。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自真核细胞或原核细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞是真菌细胞。

10.根据权利要求8或9所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为酵母菌。

11.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞选自大肠杆菌、分枝杆菌、假单胞菌、红球菌、节杆菌、枯草杆菌或放线菌细胞。

12.一种体外无细胞蛋白合成体系，其包含权利要求4-6中任一项所述的表达载体。

13.根据权利要求12所述的体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于，所述体外无细胞蛋白合成体系为原核体系或真核体系。

14.根据权利要求13所述的体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于，所述原核体外无细胞蛋白合成体系包含大肠杆菌提取物。

15.根据权利要求13所述的体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于，所述真核体外无细胞蛋白合成体系包含兔网织红细胞裂解液或麦芽提取物。

16. 一种制备权利要求1所述的碳碳双键还原酶的方法，所述方法包括以下步骤：

在有助于生产所述碳碳双键还原酶的条件下培养权利要求7-11中任一项所述的宿主细胞，从得到的培养液中获得所述碳碳双键还原酶；或

使用如权利要求12-15中任一项所述的体外无细胞蛋白合成体系制备所述碳碳双键还原酶。

17.权利要求1所述的碳碳双键还原酶、权利要求2或3所述的多核苷酸、权利要求4-6中任一项所述的表达载体、权利要求7-11中任一项所述的宿主细胞或权利要求12-15中任一项所述的体外无细胞蛋白合成体系在制备为异青藤碱、2-壬酮或青藤碱中的用途。

18.一种用于制备异青藤碱或2-壬酮的方法，其包括使用权利要求1所述的碳碳双键还原酶、权利要求2或3所述的多核苷酸、权利要求4-6中任一项所述的表达载体、权利要求7-11中任一项所述的宿主细胞或权利要求12-15中任一项所述的体外无细胞蛋白合成体系催化清风藤碱或3-壬烯-2-酮，获得异青藤碱或2-壬酮。

19.一种用于制备青藤碱的方法，所述方法包括使用如权利要求18所述的方法，将清风藤碱催化为异青藤碱的步骤。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

1）使用如权利要求18所述的方法，将清风藤碱制备为异青藤碱；

2）异青藤碱经SNOD酶的作用生成去甲基青藤碱；

3）去甲基青藤碱经ISO酶的作用生成青藤酮；

4）青藤酮经OMT酶的作用生成青藤碱。