CN117363635A - 一种催化合成β-水芹烯的基因、生物酶及其在生产β-水芹烯中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种催化合成β‑水芹烯的基因、生物酶及其在生产β‑水芹烯中的应用，属于生物酶催化技术领域，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8任意一项所示；所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID No.9～SEQ ID No.16任意一项所示；本发明提供的生产β‑水芹烯的方法，包括以下步骤：将底物、反应液和所述的生物酶混合孵育，终止反应后，添加小牛肠道碱性磷酸酶进行产物的去磷酸化，获得β‑水芹烯。所述生物酶能够实现高效催化生产β‑水芹烯，以满足高纯度β‑水芹烯的生产需求，并推动β‑水芹烯聚合物材料的研发进程。
Description
技术领域
本发明属于生物酶催化技术领域，尤其涉及一种催化合成β-水芹烯的基因、生物酶及其在生产β-水芹烯中的应用。
背景技术
β-水芹烯(β-phellandrene)是一种无色至微黄色的液体化合物，具有左旋体和右旋体两种形式。右旋体的沸点在66～68℃范围内，而左旋体的沸点在58～59℃(2133Pa)范围内。它具有闪点为49℃的特性。此外，β-水芹烯可溶于乙醇和乙醚，但不能溶于水。右旋体主要存在于肉桂油、姜油、榄香脂油和小茴香油等中，而左旋体则存在于桉叶油、八角茴香油、甘榻油、月桂油和胡椒油等中。
作为单萜化合物的重要成员，β-水芹烯在新型聚合物材料制备中具有巨大潜力。相较于α-水芹烯，β-水芹烯能够得到更高分子量的聚合物。然而，在通过合成化学方法制备β-水芹烯时，往往伴随着α-水芹烯的生成，两者之间的分离过程非常棘手。因此，获得高纯度的β-水芹烯非常具有挑战性，制约了对β-水芹烯聚合物性质的研究进展。
利用生物合成途径制备β-水芹烯相对可行。可以通过香叶基焦磷酸(GPP)合成酶或橙花基二磷酸(NPP)合成酶，将异戊基二磷酸(IPP)引导到香叶基焦磷酸(GPP)或橙花基二磷酸(NPP)进行生物合成。然后，β-水芹烯合成酶可以进一步将GPP或NPP生物转化为β-水芹烯。
在相关专利中，提出了使用含环萜合成酶编码的核酸的C1代谢宿主细胞的转化体制造单萜的方法(CN104797704A)。其中，还包括使用甲基单胞菌属细菌的转化体制造柠檬烯的实例(CN108587934A)。虽然涉及了β-水芹烯合成酶，但并没有公开β-水芹烯合成酶及其基因的获取方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种催化合成β-水芹烯的基因、生物酶及其在生产β-水芹烯中的应用，所述生物酶能够实现高效催化生产β-水芹烯，以满足高纯度β-水芹烯的生产需求，并进一步推动β-水芹烯聚合物材料的研发进程。
本发明提供了一种催化合成β-水芹烯的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1～SEQ IDNo.8任意一项所示。
本发明提供了一种催化合成β-水芹烯的生物酶，所述生物酶的氨基酸序列如SEQID No.9～SEQ IDNo.16任意一项所示。
本发明提供了所述的生物酶的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述的基因克隆连接到初始载体中获得重组载体；
2)将所述重组载体转入初始菌株中获得重组菌株；
3)培养所述重组菌株获得菌体细胞；
4)破碎所述菌体细胞获得细胞裂解液，纯化获得目标生物酶。
优选的，所述初始载体为pCold载体。
本发明提供了一种生产β-水芹烯的方法，包括以下步骤：
将底物、反应液和所述的生物酶混合孵育，终止反应后，添加小牛肠道碱性磷酸酶进行产物的去磷酸化，获得β-水芹烯。
优选的，所述混合孵育的温度为25～35℃，所述混合孵育的时间为10～20min。
优选的，所述底物为香叶基焦磷酸，所述底物在反应体系中的浓度为0.1-10mM；所述生物酶在反应体系中的浓度为0.5～10mg/mL。
优选的，所述反应液包括Tris-HCl、MgCl2、DTT和PMSF。
优选的，所述小牛肠道碱性磷酸酶的体积为反应体系体积的1～2％；所述去磷酸化的温度为36～38℃，所述去磷酸化的时间为50～70min。
优选的，获得β-水芹烯后，还包括提取和GC-MS检测的步骤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的生物酶能够实现高效催化生产β-水芹烯，以满足高纯度β-水芹烯的生产需求，并进一步推动β-水芹烯聚合物材料的研发进程。根据实施例记载，所述生物酶催化生产β-水芹烯的最高产量为31.9mg/L。
附图说明
图1为β-水芹烯的生物合成途径；
图2为实施例中β-水芹烯GC-MS的检测结果，其中a是样品中β-水芹烯的检测峰，出峰位置在7.9min，b是GC-MS检测中，β-水芹烯的质谱信息；c是数据库中β-水芹烯的质谱信息；
图3为不同序列产生β-水芹烯的相对含量。
具体实施方式
本发明提供了一种催化合成β-水芹烯的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1～SEQ IDNo.8任意一项所示。
SEQ ID No.1：
ATGCAGATCTGCCACATCAACGTTTACCCGGTTAAAATGTCTCCGTTCACCTCTATGGCTCTGCCGCTGCAGGCTTCTGTTCCGGTTGCTGCTATCTCTACCCGTCTGCCGTTCCCGTCTTCTTGCACCAAACGTTACGTTCCGTCTCGTGTTACCGAACTGAAACTGTCTAACGAACTGACCATGCGTCGTTCTGCTGACTACAAACCGCCGATCTGGTCTTTCGAAGACATCCAGTCTCTGAAAGTTGACTACGTTGAAGAATCTTTCGGTCGTCGTATCAACAAACTGAAAGAAGACGTTATCCTGATGCTGGAAGAAAAAGAAGTTGACAAAGTTCCGCTGCAGCAGCTGGAACTGATCGACACCCTGCAGCGTCTGGGTCTGTCTTACCACTTCGAAAACGAAATCGACCGTATCCTGGAAAAAGTTTACACCAACAACCAGGGTTACTGCTACGGTTTCGACCGTGAATCTCTGTACGTTGCTGCTCTGGAATTCCGTATCCTGCGTCAGCACGGTTACAAAGTTCCGCAGGAAATCTTCAAATCTTTCCTGAACGAATCTGGTAACTTCAAAGCTTGCCTGAACAAAGACTGCAAAGGTATGCTGTACCTGTACGAAGCTTCTTTCCTGTCTCTGGAAGGTGAATCTACCCTGGACGCTGCTCGTACCTTCGCTCGTAACTACCTGTCTGAATACGTTAAACTGAACGAATCTAAAGACCCGTACCTGTCTACCCTGGTTGAACACGCTCTGGAATTCCCGCTGCGTTGGCGTATGCCGCGTATGGAAGCTCGTTGGTTCGTTGAAGTTTACCAGCGTTGCCCGGACATGAACCCGCTGCTGCTGGACCTGGCTAAACTGGACTTCAACATGGTTCAGGCTATGTACCAGGAAGACCTGAAACACGCTTCTATGTGGTGGAAACGTACCGGTCTGGGTCAGAACCTGGGTTTCATCCGTGACCGTCTGATGGAAAACTTCCTGTGGACCATCGGTGAACTGTTCCAGCCGCAGTACGGTTACTTCCGTCGTATGGCTGCTCAGGTTAACGCTCTGGTTACCACCATCGACGACGTTTACGACGTTTACGGTACCCTGGACGAACTGGAACACTTCACCGACGCTATCGAACGTTGGGACATCAACGCTATCGAACAGCTGCCGGACTACATGAAACTGTGCTTCTTCGCTCTGCACAACTCTATGAACCAGATCGCTTCTGACATCTTCCAGAAACAGGGTATCAACATCCTGCCGTACTCTAAAAAAGCTTGGCTGGACCTGTGCAAAACCTACCTGATCGAAGCTAAATGGTACCACCAGGGTTACACCCCGTCTCTGCAGGAATACATCGACGTTGCTGTTATCTCTATCTCTGCTCCGCTGATCCTGCTGCACGCTTACATCCTGTCTTCTTCTCACATCAAAATCGAAGTTCTGCAGTACCTGGAAGAAGAACTGCCGTCTATCATCCGTTGCTCTTCTATGGTTCTGCGTCTGGCTGACGACCTGGGTACCTCTTCTGACGAAATGCGTCGTGGTGACGTTTCTAAATCTATCCAGTGCACCATCTACGAAACCGGTGTTTCTGAAGACGACGCTCGTGAATACATCCAGGACCTGATCGACAAAACCTGGAAAAAAATGAACAAATACGAATTCGAACCGTCTCTGCTGCCGCAGACCCTGATCGAAGCTGCTATCAACCTGGCTCGTATGGCTCAGTTCATGTACAAACACGGTGACGGTCACTCTTCTCAGGACGACGTTATGCGTCACCGTATCCTGTCTCTGCTGATCAACCCGATCGCTCTGCCGCGTCGTGAAGAATCTTACATCACCGCT
SEQ ID No.2：
ATGAAAATGTCTGCTTTCACCTCTATGGCTCTGCCGCTGCAGGCTTCTCTGCCGGTTACCGCTATCTCTACCCGTCTGATCTTCCCGTCTTCTTGCACCAAACGTTACGTTCCGCGTCGTGTTACCGCTCTGAAACTGTCTAACGAACTGACCATGCGTCGTTCTGCTTACTACAAACCGCCGATCTGGTCTTTCGAATACATCCAGTCTCTGAAACTGGAATACGTTGGTGGTGAATCTTTCAAACGTCACATCAACAAACTGAAAGAAGACGTTATCGCTATGCTGGAAGGTGAAGAAATGGACAAAGACCCGTCTCACCAGCTGGAACTGATCGACACCCTGCAGCGTCTGGGTCTGTCTTACCACTTCGAAAACGAAATCAACCGTATCCTGAAAAAAGTTTACACCAAACACCAGGGTTACTACGGTCTGGAACGTCACTCTCTGTACGTTGCTGCTCTGGAATTCCGTATCCTGCGTCAGCACGGTTACAAAGTTCCGCAGGAAATCTTCAAATCTTTCCTGAACGAACGTGGTAACTTCAAACCGTGCCTGAAAAACGACTGCAAAGGTATGCTGTTCCTGTACGAAGCTTCTTTCCTGTCTCTGGAAGGTGAATCTATCCTGGACGCTGCTCGTACCTTCGCTCGTAACTACCTGTCTGAATACGTTAAACTGAACGAAACCAAAGACCCGTACCTGTCTACCCTGGTTGAACACGCTCTGGAATTCCCGCTGCACTGGCGTATGCCGCGTATGGAAGCTCGTTGGTTCATCGAAGTTTACAAACAGTCTCCGGACATGAACCCGGTTCTGCTGGACCTGGCTAAACTGGACTTCAACATGGTTCAGGCTACCTACCAGGAAGACCTGAAAGACGCTTCTCGTTGGTGGAACAAATCTGGTCTGGGTCAGAACCTGGAATTCATCCGTGACCGTCTGGTTGAAAACTTCCTGTGGACCACCGGTGTTCTGTTCCAGCCGCAGTACGCTTACTACCGTCGTATGGCTACCCAGGTTAACGCTCTGCTGACCACCATCGACGACGTTTACGACGTTTACGGTACCCTGGACGAACTGGAACTGTTCACCGACGTTATCGAACGTTGGGACATCAACGCTATCGAACAGCTGCCGGACTACATGAAACTGTGCTTCTTCGCTGTTCACAACTCTATGAACCAGATCGCTTCTGACATCTTCCAGGAACAGGGTATCAACATCCTGCCGTACTCTAAAAAAGCTTGGCTGGACCTGTGCAAATCTTACCTGATCGAAGCTAAATGGTACCACCAGGGTTACAAACTGTCTCTGCACGAATACATCGACAACGCTGTTATCTCTATCGCTGCTCCGCTGATGCTGATCCACGCTTACATCCTGTCTTCTAACCACATCACCACCGAAGTTCTGCAGTACCTGGAAGAAGAACTGCCGAACATCATCCGTTGCTCTTCTATGGTTCTGCGTCTGGCTGACGACCTGGGTACCTCTCCGGACGAAATGCGTCGTGGTGACGTTCCGAAATCTATCCAGTGCTACATGCACGAAACCGGTGCTTCTGAAGAAAACGCTCGTGAATACATCCAGGACCTGATCGACAAAACCTGGAACAAAATGAACAAAGACCAGTTCGAACACTCTCCGCTGCCGCAGACCCTGATCGAAGCTGCTATGAACCTGGCTCGTATGGCTCAGTTCATGTACAAACACGGTGACGGTCACTCTTCTCAGGACGACGTTATGCGTCACTCTGTTCTGTCTCTGCTGATCAACCCGATCCCGCTGCCGGCTCCGGAAGAATCTCACATCACCGCT
SEQ ID No.3：
ATGCGTCGTTCTGCTAACTACAAACCGCCGATCTGGTCTTTCGAATACATCCAGTCTCTGAAACTGGAATACGTTGAAGGTGAATCTTTCAAACGTCACATCAACAAACTGAAAGAAGACGTTATCGCTATGCTGGAAGGTGAAGAAATGGACAAAGACCCGTCTCACCAGCTGGAACTGATCGACACCCTGCAGCGTCTGGGTCTGTCTTACCACTTCGAAAACGAAATCAACCGTATCCTGGAAAAAGTTTACACCAAACACCAGGGTTACTACGGTCTGGAACGTGACTCTCTGTACATGGCTGCTCTGGAATTCCGTATCCTGCGTCAGCACGGTTACAAAGTTCCGCAGGAAATCTTCAAATCTTTCCTGAACGAACGTGGTAACTTCAAACCGTGCCTGAAAAACGACTGCAAAGGTATGCTGTTCCTGTACGAAGCTTCTTTCCTGTCTCTGGAAGGTGAATCTACCCTGGACGCTGCTCGTACCTTCGCTCGTAACTACCTGTCTGAATACGTTAAACTGAACGAAACCAAAGACCCGTACCTGTCTACCCTGGTTGAACACGCTCTGGAATTCCCGCTGCACTGGCGTATGCCGCGTGTTGAAGCTCGTTGGTTCATCGAAGTTTACCAGCAGTCTCCGAACATGAACCCGGTTCTGCTGGACCTGGCTAAACTGGACTTCAACATGGTTCAGGCTACCTACCAGGAAGACCTGAAAGACGCTTCTCGTTGGTGGAAACGTTCTGGTCTGGGTCAGAACCTGGAATTCATCCGTGACCGTCTGGTTGAAAACTTCCTGTGGACCGCTGGTGTTCTGTTCCAGCCGCAGTACGCTTACTTCCGTCGTATGGCTACCCAGGTTGCTGCTCTGGTTACCACCATCGACGACGTTTACGACGTTTACGGTACCCTGGACGAACTGGAACTGTTCACCGACGCTATCGAACGTTGGGACATCAACGCTATCGAACAGCTGCCGGACTACATGAAACTGTGCTTCTTCGCTGTTCACAACTCTATGAACCAGATCGCTCTGGACATCTTCCAGGAACAGGGTATCAACATCCTGCCGTACTCTAAAAAAGCTTGGCTGGACCTGTGCAAAACCTACCTGATCGAAGCTAAATGGTACCACCGTGGTTACAAACCGTCTCTGCACGAATACATCGAAAACGCTGTTGTTTCTATCGCTGCTCCGCTGGTTCTGCTGCACGCTTACATCCTGTCTTCTAACCACATCACCGCTGAAGTTCTGCAGTACCTGGAAGAAGAACTGCCGAACATCATCCGTTGCTCTTCTATGGTTATGCGTCTGGCTGACGACCTGGGTACCTCTCCGGACGAAATGCGTCGTGGTGACGTTCCGAAATCTATCCAGTGCTACATGCACGAAACCGGTGCTTCTGAAGAAATCGCTCGTGAATACATCCAGGACCTGATCGACAAAACCTGGAACAAAATGAACAAAGACCAGTTCGAACACTCTCCGCTGCCGCAGACCCTGATCGAAGCTGCTATGAACCTGGCTCGTATGGCTCAGTTCATCTACAAACACGGTGACGGTCACTCTTCTCAGGACGACGTTATGCGTCACCGTGTTCTGTCTCTGCTGATCAACCCGATCCCGCTGCCGGGTCCGGAAGAATCTCACATCACCGCT
SEQ ID No.4：
ATGCGTCGTTCTGCTGACTACAAACCGCCGATCTGGTCTTTCGAATACATCCAGTCTCTGAAACTGGAATACGTTGAAGGTGAATCTTTCAAACGTCACATCAACAAACTGAAAGAAGACGTTATCGCTATGCTGGAAGGTGAAGAAATGGACAAAGACCCGTCTCACCAGCTGGAACTGATCGACACCCTGCAGCGTCTGGGTCTGTCTTACCACTTCGAAAACGAAATCAACCGTATCCTGGAAAAAGTTTACACCAAACACCAGGGTTACTACGGTCTGGAACGTGACTCTCTGTACGTTGCTGCTCTGGAATTCCGTATCCTGCGTCAGCACGGTTACAAAGTTCCGCAGGAAATCTTCAAATCTTTCCTGAACGAACGTGGTAACTTCAAAGCTCCGCTGAAACGTGACTGCAAAGAAATGCTGTTCCTGTACGAAGCTTCTTTCCTGTCTCTGGAAGGTGAATCTACCCTGAACGTTGCTCGTACCTTCGCTCGTAACTACCTGTCTGAATACGTTAAACTGAAAGAATCTAAAGACCCGTACCTGTCTACCCTGGTTGAACACGCTCTGGAATTCCCGCTGCACTGGCGTATGCCGCGTATGGAAACCCGTTGGTTCATCGAATTCTACCAGCAGGGTCCGAACATGAACCCGGTTCTGCTGGACCTGGCTAAACTGGACTTCAACATGGTTCAGGCTACCTACCAGGAAGACCTGAAAGACGCTTCTCGTTGGTGGAAACGTTCTGGTCTGGGTCAGAACCTGAACTTCATCCGTGACCGTCTGATGGAAAACTTCCTGTGGACCGTTGGTATCCTGTTCCAGCCGCAGTACGCTTACTTCCGTCGTATGATCACCCAGGTTGCTGCTCTGGGTACCACCATCGACGACGTTTACGACGTTTACGGTACCCTGGACGAACTGGAACTGTTCACCGACGCTATCGAACGTTGGGACATCAACGCTATCGAAGAACTGCCGGACTACATGAAACTGTGCTTCTTCGCTGTTCACAACTCTATGAACCAGATCGTTTCTGACATCTTCCAGGAACAGGGTATCAACATCCTGCCGTACTCTAAAAAAGCTTGGCTGAACCTGTGCAAATCTTACCTGATCGAAGCTAAATGGTACCACCAGGGTTACACCCCGTCTCTGCACGAATACATCGACAACGCTGTTGTTTCTATCGTTGGTCCGCTGGCTCTGCTGCACGCTTACATCTGCTCTTCTAACCACATCACCTCTGAAGTTCTGCAGTACCTGGTTGAAGAACTGCCGAACATCATCCGTTGCTCTTCTATGATCATGCGTCTGGCTGACGACCTGGGTACCTCTCCGGACGAAATGCGTCGTGGTGACGTTCCGAAATCTATCCAGTGCTACATGCACGAAACCGGTGCTTCTGAAGAAATCGCTCGTGAATACATCCAGGACCTGATCGACAAAACCTGGAACAAAATGAACAAAGACCAGTTCGAACACTCTCCGCTGCCGCAGACCCTGATCGAAGCTGCTATGAACATCGCTCGTATGGCTCAGTTCATGTACAAACACGGTGACGGTTTCTCTTCTCAGGACGACGTTATGCGTCACCGTGTTCTGTCTCTGCTGATCAACCCGATCCCGTCTCCGGGTCCGGAAGAATCTCACACCACCGCT
SEQ ID No.5：
ATGGCTCTGCCGCTGCAGGCTTCTGTTCCGGCTCCGAAACTGTCTAACAAATTCACCATGCGTCGTTCTGCTGACTACAAACCGCCGATCTGGTCTTTCGAAGACATCCAGTCTCTGAAAGCTGACTACGTTGAAGAATCTTTCCGTCGTCACATCAACAAACTGAAAGAAGACGTTAAAGTTATCCTGGAAGAAAAAGAAATGGCTAAAGTTCCGCTGCAGCAGCTGGAACTGATCGACACCCTGCAGCGTCTGGGTCTGTCTTACCACTTCGAAAACGAAATCAACCGTATCCTGGAAAAAGTTTACACCAACAACCAGGGTTACTACTACGGTTTCGAAAAAGAATCTCTGTACATGGCTGCTCTGGAATTCCGTATCCTGCGTCAGAACGGTTACAAAGTTCCGCAGGAAATCTTCAAATCTTTCCTGAACGAATCTGGTAACTTCAAAGCTTGCCTGAACAAAGACTGCAAAGGTATGCTGTACCTGTACGAAGCTTCTTTCCTGTCTCTGGAAGGTGAATCTACCCTGGACGCTGCTCGTACCTTCGCTCGTAACTACCTGTCTGAATACGTTAAACTGAACGAATCTAAAAACCCGTACCTGTCTACCCTGGTTGAACACGCTCTGGAATTCCCGCTGCGTTGGCGTATGCCGCGTATGGAAGCTCGTTGGTTCATCGAAGTTTACCAGCGTTCTCCGGACATGAACCCGCTGCTGCTGGACCTGGCTAAACTGGACTTCAACATGGTTCAGGCTATGAACCAGGAAGACCTGAAACACGCTTCTCGTTGGTGGAAACGTACCGGTCTGGGTCAGAACCTGGGTTTCATCCGTGACCGTCTGATGGAAAACTTCCTGTGGACCACCGGTATCCTGTTCCAGCCGCAGTACGAATACTTCCGTCGTATGGCTACCCAGCTGGGTGCTCTGATCACCACCATCGACGACGTTTACGACGTTTACGGTACCCTGGACGAACTGGAAATCTTCACCGACGCTATCGAACGTTGGGACATCAACGCTATCGAACAGCTGCCGGACTACATGAAACTGTGCTTCTTCGCTCTGCACAACTCTATGAACCAGATCGCTTCTGACATCTTCCAGAAACAGGGTATCAACATCCTGCCGTACTCTAAAAAAGCTTGGCTGGACCTGTGCAAAACCTACCTGATCGAAGCTAAATGGTACCACCAGGGTTACACCCCGTCTCTGCAGGAATACATCGACGTTGCTGTTATCTCTATCTCTGCTCCGCTGATCCTGCTGTACGCTTACATCCTGTCTTCTACCCACATCAAAATCGAAATCCTGCAGTACCTGGAAGAAGAACTGCCGTCTATCATCCGTTGCTCTTCTATGGTTGTTCGTCTGGCTGACGACCTGGGTACCTCTTCTGACGAAATGTCTCGTGGTGACGTTTCTAAATCTATCCAGTGCTACATGCACGAAACCGGTGTTTCTAAAGAAGACGCTCGTGAATACATGCAGGACCTGATCGACAAAACCTGGAAAAAAATGAACAAAGACGAATTCGAACCGTCTCTGCTGCCGCAGACCCTGATCGAAGCTACCATCAACTTCGCTCGTATGGCTCAGTTCATGTACAAATACGGTGACGGTCACTCTTCTCAGGACGACGTTATGCGTCACCGTATCCTGTCTCTGCTGATCAACCCGATCCCGTTCCCGCGTCCGGAAGAATCTCACATCACCGCT
SEQ ID No.6：
ATGTCTGCTTTCACCTCTATGGCTCTGCCGCTGCAGGCTTTCATCCCGTCTCAGGTTACCACCCTGAAATCTTCTAACGAACTGACCATGCGTCGTTCTGCTGACTACAAACCGTCTATCTGGTCTTTCGAATACATCCAGTCTCTGAAACTGGAATACGTTGAAGAAGAATCTTTCCGTCGTCACGTTAACAAACTGAAAGAAGACGTTATCGCTATGCTGGAAGGTGAAGAAATGGACAAAGACCCGTCTCACCAGCTGGAACTGATCGACACCCTGCGTCGTCTGGGTCTGTCTTACCACTTCGAAAACGAAATCAACAAAATCCTGGAAAAAGTTTACACCAAACACCAGGGTTACTACGGTCTGGAACGTGACAACCTGTACATGGCTGCTCTGGAATTCCGTATCCTGCGTCAGCACGGTTACAAAGTTTCTCAGGAAATCTTCAAATCTTTCGTTAACGAACGTGGTAACTTCAAAGCTCTGCTGAAACGTAACTGCAAAGGTATGCTGTTCCTGTACGAAGCTTCTTTCCTGTCTCTGGAAGGTGAATCTACCCTGAACGCTGCTCGTACCTTCATGCGTAACTACCTGTCTGAATACGTTAAACTGAAAGAATCTAAAGACCCGTACCTGTCTACCCTGGTTGAACACGCTCTGGAATTCCCGCTGCACTGGCGTATGCCGCGTATGGAAACCCGTTGGTTCATCGAAGTTTACCAGCAGTCTCCGGACATGAACCCGGTTCTGCTGGACCTGGCTAAACTGGACTTCAACATGGTTCAGGCTACCTACCAGGAAGACCTGAAAGACGCTTCTCGTTGGTGGAAACGTTCTGGTCTGGGTCAGAACCTGAACTTCATCCGTGACCGTCTGATGGAAAACTTCCTGTGGTCTACCGGTATCCTGTTCCAGCCGCAGTACGCTTACTTCCGTCGTATGATCACCCAGGTTGGTGCTCTGGGTACCACCATCGACGACGTTTACGACGTTTACGGTACCCTGGACGAACTGGAACTGTTCACCGACGCTATCGAACGTTGGGACATCAACGCTATCGAAGAACTGCCGGACTACATGAAACTGTGCTTCTTCGCTGTTCACAACTCTATGAACCAGATCGTTTCTGACATCTTCCAGGAACAGGGTATCAACATCCTGCCGTACTCTAAAAAAGCTTGGCTGAACCTGTGCAAATCTTACCTGATCGAAGCTAAATGGTACCACCAGGGTTACACCCCGTCTCTGCACGAATACATCGACAACGCTGTTGTTTCTATCGTTGGTCCGCTGATCCTGCTGCACGCTTACATCCTGTCTTCTAACCACATCACCACCGAAGTTCTGCAGTACCTGGAAGAAGAACTGCCGAACATCATCCGTTGCTCTTCTATGGTTCTGCGTCTGGCTGACGACCTGGGTACCTCTCCGGACGAAATGCGTCGTGGTGACGTTCCGAAATCTATCCAGTGCTACATGCACGAAACCGGTGCTTCTGAAGAAATCGCTCGTGAATACATCCAGGACCTGATCGACGAAACCTGGAACAAAATGAACAAAGACCAGTTCGAACACTCTACCCTGCCGCAGACCCTGATCGAAGCTGCTATGAACCTGGCTCGTATGGCTCAGTTCATGTACAAACACGGTGACGGTCACTCTTCTCAGGACGACGTTATGCGTCACCGTGTTCTGTCTCTGCTGATCAACCCGATCCCGCTGCCGGGTCCGGAAGAATCTCACATCACCGCT
SEQ ID No.7：
ATGCGTTCTGTTTCTATGGCTCTGTCTGTTCCGCTGCCGCTGCACACCTACGTTCCGCGTGTTATCCTGTCTCGTCGTATGCTGCCGCCGTCTTCTCGTTCTTGCTACGCTTCTTCTCAGGTTCGTTCTATGTCTGCTATCAACATGTCTGACCAGGCTATCGCTCGTCGTTCTGCTGACTACCAGCCGCCGATCTGGTCTTTCGAATACATCCAGTCTCTGAAAACCGAATACGCTGAAGAATCTTTCCGTCGTCACATCAACAAACTGAAAGAAGACGTTATCGTTATGCTGGAAGAAAAAGAAATGGACAAAGTTCCGCTGCAGCAGCTGGAACTGATCGACACCCTGCAGCGTCTGGGTCTGTCTTACCACTTCGAAAACGAAATCAACCGTATCCTGGAAAAAGTTTACACCAACAACCAGGGTTACTACTACGGTTTCGAACGTGAATCTCTGTACATGGCTGCTCTGGAATTCCGTATCCTGCGTCAGAACGGTTACAAAGTTCCGCAGGAAATCTTCAAATCTTTCCTGAACGAATCTGGTAACTTCAAAGCTTGCCTGAACAAAGACTGCAAAGGTATGCTGTACCTGTACGAAGCTTCTTTCCTGTCTCTGGAAGGTGAATCTACCCTGGACGCTGCTCGTACCTTCGTTCGTAACTACCTGTCTGAATACGTTAAACTGAACGAATCTAAAAACCCGTACCTGTCTACCCTGGTTGAACACGCTCTGGAATTCCCGCTGCGTTGGCGTATGCCGCGTATGGAAGCTCGTTGGTTCATCGAAGTTTACCAGCGTTCTCCGGACATGAACCCGCTGCTGCTGGACCTGGCTAAACTGGACTTCAACATGGTTCAGGCTATGCACCAGGAAGACCTGAAACACGCTTCTATGTGGTGGAAACGTACCGGTCTGGGTCAGAACCTGGGTTTCATCCGTGACCGTCTGATGGAAAACTTCCTGTGGGCTATCGGTATCCTGTTCCAGCCGCAGTACGAATACTTCCGTCGTATGGTTACCCAGCGTGGTGCTCTGATCACCACCATCGACGACGTTTACGACGTTTACGGTACCCTGGACGAACTGGAACTGTTCACCGACGCTATCGAACGTTGGGACATCAACGCTACCGAACAGCTGCCGGACTACATGAAACTGTGCTTCTTCGCTCTGCACAACTCTATGAACCAGATCGCTTCTGACATCTTCCAGGAACAGGGTATCAACATCCTGCCGTACTCTAAAAAAGCTTGGCTGGACCTGTGCAAAGCTTACCTGATCGAAGCTAAACTGTACCACCAGGGTTACACCCCGTCTCTGCAGGAATACATCGACGTTGCTGTTGTTTCTATCTCTGCTCCGATCGTTCTGTCTCACGTTTACATCCTGTCTTCTAACCAGATCACCATCGAAGTTCTGCAGTACCTGGAAGAAGAACTGCCGTCTATCATCCGTTGCTCTTCTATGGTTTCTCGTCTGGCTGACGACCTGGGTACCTCTTCTGACGAAATGCGTCGTGGTGACGTTTCTAAATCTATCCAGTGCTACATGCACGAAACCGGTGTTTCTGAAGAAGACACCCCGGAATACATGCAGAACTCTATCGACAAAACCTGGAAAAAAATGAACAAAGACGAATTCGAACCGTCTCTGCTGCCGCAGACCCTGATCGAAGCTACCATCAACTTCGCTCGTATGGCTCAGTTCATGTACAAATACGGTGACGGTCACTCTTCTCAGGACGACGTTACCCGTCACCGTATCCTGTCTCTGCTGATCAACCCGATCCCGCTGCCGCGTCCGGAAGAATCTCACATCACCGCT
SEQ ID No.8：
ATGTTCGTTCAGGTTACCGCTTCTATCCCGCCGGCTCCGCCGTCTCAGAACTCTAAACCGGAAATCAACCGTCGTTCTGCTGGTTTCCACCCGTCTATCTGGGGTGCTCACTTCCTGTCTTACGCTTCTAACGACATCATGGAATCTGAAGAAGAAAAACGTGAACACCTGAAACTGAAAGAAGAACTGAAAGAAAAACTGATGGCTGTTGTTGACGCTCCGTGGAAAAAACTGGAACTGATCGACGCTATCCAGCGTCTGGGTGTTTCTTACCACTTCCACAAAGAAATCGACGAAATCCTGGGTCAGATCATGCAGGTTATGAACCAGTCTGACTTCAAAGCTGGTTCTTCTGAAGACGACGACCTGTACACCATCTCTCTGACCTTCCGTCTGCGTCGTCAGCACGGTTACCGTATCTCTTGCGAAATCTTCAAAAAATTCAAAGACAAAGGTGGTAACTTCAAAGAATCTCTGATCGACGACGTTAAAGGTATGCTGTCTCTGTACGAAGCTACCCACCTGCGTGCTCACGGTGAAGACATCCTGGACCAGGCTCTGTCTTTCACCACCACCCACCTGGGTTCTATGGTTACCTCTCTGTCTAACCCGTCTCTGGCTGCTCAGGTTACCAACGCTCTGCACCAGCCGGTTCACACCGGTATGCCGCGTCTGGAAGCTCGTCGTTTCATCCCGGCTTACCAGGCTGACCCGTCTCACGACAAAACCCTGCTGTCTTTCGCTCGTCTGGACTTCAACATGCTGCAGCGTCTGCACCAGAAAGAAATCTCTGACATCGCTAAATGGTGGAAAGACCTGGACTTCTCTACCAAACTGCCGTTCGCTCGTGACCGTCTGATCGAATGCTACTTCTGGATCCTGGGTCTGTACTCTGAACCGGAATACCTGCTGGCTCGTCGTTTCTCTACCAAAGTTATCATCTTCGCTTCTGTTATCGACGACATCTACGACGTTTACGGTACCCTGGACGAACTGGAACTGCTGACCGAAGCTATCCAGCGTTGGGACATCAACGCTATCGACCAGATGCCGGAATACATGCAGATCTACTTCCAGGCTTTCCTGGACATCTACCGTGAAATCGAAGAACAGATGGCTGCTCAGGGTAAACTGTACCGTGTTCACTACGCTAAAGAAGCTATGAAACGTCTGGTTCGTGCTTACTTCCAGGAAGCTAAATGGTTCCACGAAAAATGCACCCCGACCCTGGACGAATACATGCCGGTTGCTCTGATCTCTTCTGGTTACGAAATGATGGCTGTTACCTCTATCGTTGGTCTGGGTGACATCGCTACCGAAGACTCTTTCAACTGGCTGCTGTCTCGTCCGAAAATCGTTACCGCTTCTGAAGCTATCGCTCGTCTGATGGACGACATCGCTTCTCACAAATTCGAACAGAAACGTGGTCACGTTGCTTCTTCTATCGAATGCTACATGCTGCAGTACGGTGGTACCGAAGAAGAAGCTGTTGAAGAACTGCGTAAACTGATCACCAAAGCTTGGATGGACATCAACGAAGAATGCCTGCGTCCGACCGCTGTTCCGATGCCGCTGCTGACCTGCATCCTGAACCTGGCTCGTGTTATCGAAGTTCTGTACAAAGCTGAAGACGGTTACACCCACGTTGGTAAACGTATCAAAGAATCTGTTGCTTCTCTGCTGATCGACCCGGTTCCGGAAAAATGCATCTCTGCTGGTTCTGGT
本发明提供了一种催化合成β-水芹烯的生物酶，所述生物酶的氨基酸序列如SEQID No.9～SEQ IDNo.16任意一项所示；具体如下：
MQICHINVYPVKMSPFTSMALPLQASVPVAAISTRLPFPSSCTKRYVPSRVTELKLSNELTMRRSADYKPPIWSFEDIQSLKVDYVEESFGRRINKLKEDVILMLEEKEVDKVPLQQLELIDTLQRLGLSYHFENEIDRILEKVYTNNQGYCYGFDRESLYVAALEFRILRQHGYKVPQEIFKSFLNESGNFKACLNKDCKGMLYLYEASFLSLEGESTLDAARTFARNYLSEYVKLNESKDPYLSTLVEHALEFPLRWRMPRMEARWFVEVYQRCPDMNPLLLDLAKLDFNMVQAMYQEDLKHASMWWKRTGLGQNLGFIRDRLMENFLWTIGELFQPQYGYFRRMAAQVNALVTTIDDVYDVYGTLDELEHFTDAIERWDINAIEQLPDYMKLCFFALHNSMNQIASDIFQKQGINILPYSKKAWLDLCKTYLIEAKWYHQGYTPSLQEYIDVAVISISAPLILLHAYILSSSHIKIEVLQYLEEELPSIIRCSSMVLRLADDLGTSSDEMRRGDVSKSIQCTIYETGVSEDDAREYIQDLIDKTWKKMNKYEFEPSLLPQTLIEAAINLARMAQFMYKHGDGHSSQDDVMRHRILSLLINPIALPRREESYITA(SEQ ID No.9)
MKMSAFTSMALPLQASLPVTAISTRLIFPSSCTKRYVPRRVTALKLSNELTMRRSAYYKPPIWSFEYIQSLKLEYVGGESFKRHINKLKEDVIAMLEGEEMDKDPSHQLELIDTLQRLGLSYHFENEINRILKKVYTKHQGYYGLERHSLYVAALEFRILRQHGYKVPQEIFKSFLNERGNFKPCLKNDCKGMLFLYEASFLSLEGESILDAARTFARNYLSEYVKLNETKDPYLSTLVEHALEFPLHWRMPRMEARWFIEVYKQSPDMNPVLLDLAKLDFNMVQATYQEDLKDASRWWNKSGLGQNLEFIRDRLVENFLWTTGVLFQPQYAYYRRMATQVNALLTTIDDVYDVYGTLDELELFTDVIERWDINAIEQLPDYMKLCFFAVHNSMNQIASDIFQEQGINILPYSKKAWLDLCKSYLIEAKWYHQGYKLSLHEYIDNAVISIAAPLMLIHAYILSSNHITTEVLQYLEEELPNIIRCSSMVLRLADDLGTSPDEMRRGDVPKSIQCYMHETGASEENAREYIQDLIDKTWNKMNKDQFEHSPLPQTLIEAAMNLARMAQFMYKHGDGHSSQDDVMRHSVLSLLINPIPLPAPEESHITA(SEQ ID No.10)
MRRSANYKPPIWSFEYIQSLKLEYVEGESFKRHINKLKEDVIAMLEGEEMDKDPSHQLELIDTLQRLGLSYHFENEINRILEKVYTKHQGYYGLERDSLYMAALEFRILRQHGYKVPQEIFKSFLNERGNFKPCLKNDCKGMLFLYEASFLSLEGESTLDAARTFARNYLSEYVKLNETKDPYLSTLVEHALEFPLHWRMPRVEARWFIEVYQQSPNMNPVLLDLAKLDFNMVQATYQEDLKDASRWWKRSGLGQNLEFIRDRLVENFLWTAGVLFQPQYAYFRRMATQVAALVTTIDDVYDVYGTLDELELFTDAIERWDINAIEQLPDYMKLCFFAVHNSMNQIALDIFQEQGINILPYSKKAWLDLCKTYLIEAKWYHRGYKPSLHEYIENAVVSIAAPLVLLHAYILSSNHITAEVLQYLEEELPNIIRCSSMVMRLADDLGTSPDEMRRGDVPKSIQCYMHETGASEEIAREYIQDLIDKTWNKMNKDQFEHSPLPQTLIEAAMNLARMAQFIYKHGDGHSSQDDVMRHRVLSLLINPIPLPGPEESHITA(SEQ ID No.11)
MRRSADYKPPIWSFEYIQSLKLEYVEGESFKRHINKLKEDVIAMLEGEEMDKDPSHQLELIDTLQRLGLSYHFENEINRILEKVYTKHQGYYGLERDSLYVAALEFRILRQHGYKVPQEIFKSFLNERGNFKAPLKRDCKEMLFLYEASFLSLEGESTLNVARTFARNYLSEYVKLKESKDPYLSTLVEHALEFPLHWRMPRMETRWFIEFYQQGPNMNPVLLDLAKLDFNMVQATYQEDLKDASRWWKRSGLGQNLNFIRDRLMENFLWTVGILFQPQYAYFRRMITQVAALGTTIDDVYDVYGTLDELELFTDAIERWDINAIEELPDYMKLCFFAVHNSMNQIVSDIFQEQGINILPYSKKAWLNLCKSYLIEAKWYHQGYTPSLHEYIDNAVVSIVGPLALLHAYICSSNHITSEVLQYLVEELPNIIRCSSMIMRLADDLGTSPDEMRRGDVPKSIQCYMHETGASEEIAREYIQDLIDKTWNKMNKDQFEHSPLPQTLIEAAMNIARMAQFMYKHGDGFSSQDDVMRHRVLSLLINPIPSPGPEESHTTA(SEQ ID No.12)
MALPLQASVPAPKLSNKFTMRRSADYKPPIWSFEDIQSLKADYVEESFRRHINKLKEDVKVILEEKEMAKVPLQQLELIDTLQRLGLSYHFENEINRILEKVYTNNQGYYYGFEKESLYMAALEFRILRQNGYKVPQEIFKSFLNESGNFKACLNKDCKGMLYLYEASFLSLEGESTLDAARTFARNYLSEYVKLNESKNPYLSTLVEHALEFPLRWRMPRMEARWFIEVYQRSPDMNPLLLDLAKLDFNMVQAMNQEDLKHASRWWKRTGLGQNLGFIRDRLMENFLWTTGILFQPQYEYFRRMATQLGALITTIDDVYDVYGTLDELEIFTDAIERWDINAIEQLPDYMKLCFFALHNSMNQIASDIFQKQGINILPYSKKAWLDLCKTYLIEAKWYHQGYTPSLQEYIDVAVISISAPLILLYAYILSSTHIKIEILQYLEEELPSIIRCSSMVVRLADDLGTSSDEMSRGDVSKSIQCYMHETGVSKEDAREYMQDLIDKTWKKMNKDEFEPSLLPQTLIEATINFARMAQFMYKYGDGHSSQDDVMRHRILSLLINPIPFPRPEESHITA(SEQ ID No.13)
MSAFTSMALPLQAFIPSQVTTLKSSNELTMRRSADYKPSIWSFEYIQSLKLEYVEEESFRRHVNKLKEDVIAMLEGEEMDKDPSHQLELIDTLRRLGLSYHFENEINKILEKVYTKHQGYYGLERDNLYMAALEFRILRQHGYKVSQEIFKSFVNERGNFKALLKRNCKGMLFLYEASFLSLEGESTLNAARTFMRNYLSEYVKLKESKDPYLSTLVEHALEFPLHWRMPRMETRWFIEVYQQSPDMNPVLLDLAKLDFNMVQATYQEDLKDASRWWKRSGLGQNLNFIRDRLMENFLWSTGILFQPQYAYFRRMITQVGALGTTIDDVYDVYGTLDELELFTDAIERWDINAIEELPDYMKLCFFAVHNSMNQIVSDIFQEQGINILPYSKKAWLNLCKSYLIEAKWYHQGYTPSLHEYIDNAVVSIVGPLILLHAYILSSNHITTEVLQYLEEELPNIIRCSSMVLRLADDLGTSPDEMRRGDVPKSIQCYMHETGASEEIAREYIQDLIDETWNKMNKDQFEHSTLPQTLIEAAMNLARMAQFMYKHGDGHSSQDDVMRHRVLSLLINPIPLPGPEESHITA(SEQ ID No.14)
MRSVSMALSVPLPLHTYVPRVILSRRMLPPSSRSCYASSQVRSMSAINMSDQAIARRSADYQPPIWSFEYIQSLKTEYAEESFRRHINKLKEDVIVMLEEKEMDKVPLQQLELIDTLQRLGLSYHFENEINRILEKVYTNNQGYYYGFERESLYMAALEFRILRQNGYKVPQEIFKSFLNESGNFKACLNKDCKGMLYLYEASFLSLEGESTLDAARTFVRNYLSEYVKLNESKNPYLSTLVEHALEFPLRWRMPRMEARWFIEVYQRSPDMNPLLLDLAKLDFNMVQAMHQEDLKHASMWWKRTGLGQNLGFIRDRLMENFLWAIGILFQPQYEYFRRMVTQRGALITTIDDVYDVYGTLDELELFTDAIERWDINATEQLPDYMKLCFFALHNSMNQIASDIFQEQGINILPYSKKAWLDLCKAYLIEAKLYHQGYTPSLQEYIDVAVVSISAPIVLSHVYILSSNQITIEVLQYLEEELPSIIRCSSMVSRLADDLGTSSDEMRRGDVSKSIQCYMHETGVSEEDTPEYMQNSIDKTWKKMNKDEFEPSLLPQTLIEATINFARMAQFMYKYGDGHSSQDDVTRHRILSLLINPIPLPRPEESHITA(SEQ ID No.15)
MFVQVTASIPPAPPSQNSKPEINRRSAGFHPSIWGAHFLSYASNDIMESEEEKREHLKLKEELKEKLMAVVDAPWKKLELIDAIQRLGVSYHFHKEIDEILGQIMQVMNQSDFKAGSSEDDDLYTISLTFRLRRQHGYRISCEIFKKFKDKGGNFKESLIDDVKGMLSLYEATHLRAHGEDILDQALSFTTTHLGSMVTSLSNPSLAAQVTNALHQPVHTGMPRLEARRFIPAYQADPSHDKTLLSFARLDFNMLQRLHQKEISDIAKWWKDLDFSTKLPFARDRLIECYFWILGLYSEPEYLLARRFSTKVIIFASVIDDIYDVYGTLDELELLTEAIQRWDINAIDQMPEYMQIYFQAFLDIYREIEEQMAAQGKLYRVHYAKEAMKRLVRAYFQEAKWFHEKCTPTLDEYMPVALISSGYEMMAVTSIVGLGDIATEDSFNWLLSRPKIVTASEAIARLMDDIASHKFEQKRGHVASSIECYMLQYGGTEEEAVEELRKLITKAWMDINEECLRPTAVPMPLLTCILNLARVIEVLYKAEDGYTHVGKRIKESVASLLIDPVPEKCISAGSG(SEQ ID No.16)
本发明提供了所述的生物酶的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述的基因克隆连接到初始载体中获得重组载体；
2)将所述重组载体转入初始菌株中获得重组菌株；
3)培养所述重组菌株获得菌体细胞；
4)破碎所述菌体细胞获得细胞裂解液，纯化获得目标生物酶。
在本发明中，将所述的基因克隆连接到初始载体中获得重组载体；所述初始载体优选为pCold载体；所述pCold载体包含可诱导启动子，能够在低温条件下启动目标蛋白的表达，优选的采购于淼灵生物公司。在本发明中，所述基因优选的克隆于pCold载体的Nde1和EcoR1酶切位点之间；在本发明中，所述重组载体优选的采用双酶切、连接的方法构建完成，本发明对具体的操作参数没有特殊限定，能够构建获得所述重组载体即可。
本发明在获得所述重组载体后，将所述重组载体转入初始菌株中获得重组菌株。在本发明中，所述初始菌株优选为大肠杆菌BL21(DE3)菌株，本发明对所述重组菌株的构建方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组菌株的构建方法即可。
本发明获得所述重组菌株后，培养所述重组菌株获得菌体细胞。本发明在培养所述重组菌株的过程中，采用IPTG诱导剂诱导目标蛋白的表达。
本发明在获得所述菌体细胞后，破碎所述菌体细胞获得细胞裂解液，纯化获得目标生物酶。
在本发明中，优选的采用高压破碎的方法进行破碎，所述破碎的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；所述破碎的压力优选为800-1000bar；所述破碎的时间为3-5min；进一步优选的采用高压低温破碎仪进行。本发明在所述破碎后，将破碎后的菌液进行离心，收集上清；然后进行纯化，所述纯化优选的采用Ni亲和层析柱进行。
本发明还提供了一种生产β-水芹烯的方法，包括以下步骤：
将底物、反应液和所述的生物酶混合孵育，终止反应后，添加小牛肠道碱性磷酸酶进行产物的去磷酸化，获得β-水芹烯。
在本发明中，将底物、反应液和所述的生物酶混合孵育；所述混合孵育的温度优选为25～35℃，更优选为28～32℃，最优选为30℃；所述混合孵育的时间优选为10～20min，更优选为12～18min，最优选为15min。在本发明中，所述底物优选为香叶基焦磷酸，所述底物在反应体系中的浓度优选为0.1-10mM，更优选为0.3-5mM，最优选为1mM；所述生物酶在反应体系中的浓度优选为0.5～10mg/mL。在本发明中，所述反应液包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、PMSF；所述Tris-HCl在反应体系中的浓度优选为40～60mM，更优选为45～55mM，最优选为50mM；所述Tris-HCl的pH值优选为7.2；所述MgCl2在反应体系中的浓度优选为8～12mM，更优选为9～11mM，最优选为10mM；所述DTT在反应体系中的浓度优选为3～7mM，更优选为4～6mM，最优选为5mM；所述PMSF在反应体系中的浓度优选为0.5～1.5mM，更优选为0.8～1.2mM，最优选为1mM。
本发明在所述混合孵育后，终止反应；所述终止反应的方式优选为将所述反应体系置于冰上猝灭。
在本发明中，添加小牛肠道碱性磷酸酶进行产物的去磷酸化，所述小牛肠道碱性磷酸酶的体积优选为反应体系体积的1～2％，更优选为1.5％；所述去磷酸化的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述去磷酸化的时间优选为50～70min，更优选为55～65min，最优选为60min。
本发明在获得所述β-水芹烯后，优选的还包括对所述β-水芹烯提取和GC-MS检测的过程。在本发明中，所述提取优选的以正己烷为提取溶剂，所述正己烷的体积为反应体系体积的1～2倍，所述提取的时间优选为10～20min，所述提取的过程中优选的伴随搅拌；所述提取结束后，优选的进行GC-MS检测。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
表达生物酶的重组菌株的构建
从武汉金开瑞生物工程有限公司合成了SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的基因序列。
为了实现目标蛋白的高效表达，选择了广泛应用于蛋白表达的pCold载体(采购于淼灵生物公司)，用于构建重组载体。
具体步骤：
首先使用限制性内切酶Nde1和EcoR1双酶切线性化pCold载体，电泳分离、回收纯化线性化载体；
将纯化的载体与基因片段(SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示)按照摩尔比1:1的比例混合，利用Gibson assembly方法进行连接，50℃孵育1h，从而构建出重组表达载体(共8种重组表达载体，针对SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示每个序列构建一种)。
从超低温冰箱取出DH5α感受态细胞(约100μL)，立即置于冰上，融化后加入5μL构建好的载体，冰浴30min，后于42℃金属浴热激45s，立即插入冰中冷却2min。后加入1mL LB培养，220rpm 37℃基复苏45min。后将其全部涂布于氨苄霉素(Amp，100μg/mL)抗性固体平板上。恒温培养箱37℃过夜培养。然后挑取过夜培养的平板上的阳性克隆子3个，转接于5mLLB培养基，培养8h后提取质粒。测序验证，保存正确菌株。
利用重组菌株表达生物酶
1.利用重组菌株表达目的蛋白生物酶
a)将保存的重组菌株接种到含有5mL LB液体培养基(Amp含量100μg/mL)的小试管中，在37℃、220rpm条件下过夜培养，作为种子液。
b)将种子液转移至50mL含有LB液体培养基(Amp含量100μg/mL)的瓶中，在37℃、220rpm条件下摇床培养，以再次激活菌液。
c)用1％(v/v)的接种量，将再次激活的菌液转移到含有800mL 2YT液体培养基(Amp含量100μg/mL)的瓶中，在37℃、220rpm条件下摇床培养至OD600为0.6-0.8。
d)将摇床温度降至16-18℃，添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至最终浓度0.5mM，诱导表达14-16h。
e)表达完成后，将培养菌液收集到瓶中，将离心机预冷至4℃，以5500rpm离心10min。
f)倾倒掉上清液，加入30mL蛋白纯化缓冲液，并用旋涡振荡器将菌体重悬。再次以5500rpm离心10min。倒掉上清液，再次加入30mL蛋白纯化缓冲液，用旋涡振荡器将菌体重悬(确保没有固体颗粒状)，并倒入50mL离心管中，存储于-80℃冰箱。
2.进行高压破碎，并离心收集上清。
a)取收集好的菌液，使用高压低温破碎仪在4℃、800-1000bar的压力下破菌3-5min，以充分裂解细胞，将目的蛋白释放到蛋白缓冲液中。
b)离心：将破碎后的菌液放入事先预冷好的4℃离心机中，以8000rpm离心60min，将离心后的沉淀和上清液分离，收集上清液。
3.使用Ni亲和层析柱进行蛋白纯化。
a)对上清液进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：
首先，用双蒸水洗2倍柱体积，然后，用蛋白缓冲液平衡一倍的Ni亲和层析柱。
b)取50mL样品缓慢通过Ni亲和层析柱，收集前几滴经过的样品。
c)用包含20mM、50mM、100mM、200mM和300mM咪唑的蛋白缓冲液进行洗脱，以去除结合的杂蛋白，取前几滴流穿的样品进行制样，并使用12％SDS-PAGE进行检测。
d)浓缩和换液：将含有目的蛋白的洗脱液使用10kDa的Amicon超滤管(Millipore公司)进行离心浓缩(4℃、3400rpm)，浓缩至1mL。然后，再加入10mL蛋白缓冲液进行再次浓缩至1mL，重复该步骤1次，以确保蛋白中的咪唑被除去，并获得纯化的蛋白样品。
4.蛋白浓度测定
使用Pierce BCAProteinAssay Kit(Thermo Fisher Scientific)进行蛋白浓度的测定。
首先，通过蛋白在280nm处的吸光值进行初步测定蛋白浓度，并根据初步测定结果将蛋白稀释至0.5-1mg/mL的范围内。然后按照50:1的比例配置了试剂A和试剂B以制备反应液。
在酶标板中取200μL的反应液，并向其中加入25μL稀释后的蛋白样品。通过用枪吹吸混匀，将反应液置于37℃下孵育30min。
随后，将酶标板放入酶标仪中测定562nm的吸光值，并根据蛋白标准曲线进行数据处理，从而确定蛋白的浓度。
实施例2
利用实施例1中制备获得的目的蛋白生物酶催化合成β-水芹烯
采用200mL的反应混合物，包含底物1mM GPP、50mM Tris-HCl(pH值7.2)、10mMMgCl2、5mM DTT和1mM PMSF。
在催化反应开始时加入不同浓度的纯化的目的蛋白(0.5mg/mL，1mg/mL，5mg/mL，10mg/mL)，并将反应混合物在30℃下孵育15min。
反应孵育后的5min停止，并立即在冰上淬灭。
为了促进产物的去磷酸化，冰上猝灭后加入3mL由TaKaRa公司制造的小牛肠道碱性磷酸酶，并在37℃下孵育1h。
随后，加入300mL的正己烷，搅拌混合物15min，以提取单萜类化合物。将萃取后的正己烷过0.22μm滤膜，随后进行GC-MS分析。
GC-MS分析使用Agilent 7890A气相色谱仪系统进行，该系统配备了DB-5MS毛细管气相色谱柱，该柱涂覆了5％二苯基和95％二甲基聚硅氧烷(长30m，内径250μm，膜厚0.25mm，J&W Scientific，美国)。烘箱温度程序设置为：初始温度为50℃，保持2min，然后以每分钟5℃的速度升温至180℃(保持5min)，随后以每分钟10℃的速度升至230℃。注入口、传输线和离子源的温度分别控制在250℃、290℃和230℃。仅在分流模式下添加1mL的样品，并将进样比调整为10:1。最后，采用全扫描模式获取质谱数据，覆盖的m/z范围为35-650，并设置了7.5min的溶剂延迟。
GC-MS检测结果如图2所示，β-水芹烯的出峰位置为7.9min，GC-MS检测结果显示β-水芹烯的质谱信息与数据库中的β-水芹烯质谱信息完全对应。其中SEQ ID No.9～SEQ IDNo.16所示的生物酶催化合成β-水芹烯的相对产量如图3所示(图中对应的为基因序列编号SEQ ID No.1～SEQ ID No.8，简写为SEQ1～SEQ8)，其中SEQ1最高产量达到31.99mg/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种催化合成β-水芹烯的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ IDNo.8任意一项所示。
2.一种催化合成β-水芹烯的生物酶，其特征在于，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.8～SEQ ID No.16任意一项所示。
3.权利要求2所述的生物酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将权利要求1所述的基因克隆连接到初始载体中获得重组载体；
2)将所述重组载体转入初始菌株中获得重组菌株；
3)培养所述重组菌株获得菌体细胞；
4)破碎所述菌体细胞获得细胞裂解液，纯化获得目标生物酶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述初始载体为pCold载体。
5.一种生产β-水芹烯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将底物、反应液和权利要求2所述的生物酶混合孵育，终止反应后，添加小牛肠道碱性磷酸酶进行产物的去磷酸化，获得β-水芹烯。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合孵育的温度为25～35℃，所述混合孵育的时间为10～20min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述底物为香叶基焦磷酸，所述底物在反应体系中的浓度为0.1-10mM；所述生物酶在反应体系中的浓度为0.5～10mg/mL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应液包括Tris-HCl、MgCl2、二硫苏糖醇DTT和苯甲基磺酰氟PMSF。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述小牛肠道碱性磷酸酶的体积为反应体系体积的1～2％；所述去磷酸化的温度为36～38℃，所述去磷酸化的时间为50～70min。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，获得β-水芹烯后，还包括提取和GC-MS检测的步骤。
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