CN103205396A - 一种hek-293t细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种HEK-293T细胞的悬浮驯化和无血清驯化的方法，属于生物技术领域。本发明分两步进行，先HEK-293T细胞由贴壁培养驯化为在带血清的培养基中悬浮培养，再对适应含血清培养基中悬浮培养的HEK-293T细胞降血清驯化至无血清驯化。本发明培养出的HEK-293T细胞生长状态稳定，分散性好，完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，能够规模化生产。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种HEK-293T细胞的培养方法，具体地涉及一种HEK-293T细胞的悬浮驯化和无血清驯化的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
哺乳动物细胞大规模培养技术是生物制药企业下游通用技术之一，其在该行业发挥极为重要的作用。该项技术的关键在于实现哺乳动物细胞的悬浮，无血清培养，从而提高产能，降低成本。因为小规模细胞培养时的通常做法是在培养基中添加血清，而血清化学成分不确定，且质量不稳定，有批间差，用此种细胞生产的生物制品，质量难以控制，很难通过食品药品监督管理局的审批，而且悬浮培养相对常见的贴壁培养来说，单位体积能长更多的细胞，从而能生产更多的生物制品。
HEK-293T的中文名为人胚肾细胞293T细胞系（humanembryonic kidney293cell）,细胞系作为高转染和高表达的细胞系，广泛应用于科研和工业领域。
现有的HEK-293T的培养是在基础培养基（DMEM）中添加5-10%牛血清（FBS），进行贴壁培养。其缺陷在于：1.血清质量不稳定，有批间差，且血清的化学成分不确定，如果用此种细胞生产的生物制品，质量难以控制，很难通过食品药品监督管理局的审批；2.由于其贴壁的性质，相对悬浮培养的细胞来说，单位体积能生长的细胞数目少，所以难以实现规模化生产。
而使贴壁细胞悬浮生长的方法在本领域是已知的。例如，在Gabriela D.C.等人的专利（HIGH YIELD SUSPENSION CELL LINE,system,and method for make same;US20120171724A1）中，通过驯化，使多种哺乳动物细胞从贴壁状态成为可悬浮生长于含血清的培养基中的细胞系，使得单位体积能长更多的细胞，从而生产更多的生物制品
但现有的悬浮驯化技术缺陷在于：1.有的无法实现完全无血清培养，2.一般采用两步走的方法，先血清断奶再悬浮培养。由于血清断奶所采用的培养基通常为基础培养基加血清，基础培养基营养成分较弱，驯化过程中贴壁培养表面积/体积比通常较小，限制了营养的摄入，整个驯化过程耗时长。
因此，需要对HEK-293T细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法进一步研究，并克服以上两方面缺陷。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种HEK-293T细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法，使该细胞生长状态稳定、分散性好，适用规模化培养。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案：
一种HEK-293T细胞的悬浮驯化方法，其特征在于包括以下步骤：
a、接种HEK-293T细胞于含10ml DMEM完全培养基的10cm培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中培养2天达到100%汇合状态；
b、弃除培养基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293T细胞消化脱离培养皿表面，然后加入3ml DMEM完全培养基终止胰酶消化;
c、将上述消化后的细胞用移液管吸取，并转移到15ml的尖底离心管中，1000rpm离心1min，沉降收集HEK-293T细胞，并用10mlDMEM完全培养基重悬收集的细胞，再将全部细胞接种于10cm康宁培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中；
d、步骤c中放入培养箱中的细胞每培养2天重复步骤b和c，重复7-9次，直至培养皿中同时出现贴壁细胞和悬浮生长的细胞团；吸取及转移过程中注意勿打散细胞团；
e、将最后一次培养的全部细胞消化后转移至摇瓶中培养，每两天按照0.3×106/ml传代一次，每次传代均用0.25%胰酶EDTA消化细胞团至分散状态，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得可连续传代95-105代，并可达到最高密度1.1×107/ml的，适应10%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293T细胞，命名该悬浮培养细胞为HEK-293Ts细胞，以3×106/ml密度冻存即可。
如上所述的步骤a-e中的百分比浓度均为体积浓度。
一种上述方法驯化后的HEK-293Ts悬浮细胞的无血清驯化方法，其特征在于包括以下步骤：
a、用含10%FBS的DMEM培养基于培养皿中培养细胞至密度为1.2×106/ml，活力95%以上，收集细胞于离心管中，于1000rpm离心2min沉降，留沉淀；
b、用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，并在此过程中震荡离心管，使细胞均匀分布；
c、加入5ml含10%FBS的DMEM培养基终止胰酶消化作用，并重悬步骤b得到的HEK-293Ts细胞，按照0.3×106/ml传代；
d、每两天重复a-c步骤一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
e、分步将DMEM培养基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%，重复步骤a-c，每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293Ts细胞；
f、将适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293Ts细胞每两天按照0.3×106/ml传代一次，扩大培养到50ml培养体积，至两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
g、对适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293Ts细胞进行70μm细胞筛过滤处理，观察并记录过滤后的HEK-293Ts细胞团数量及大小；
h、传代g步骤中过滤后的HEK-293Ts细胞于含25%293FFreestyle SFM及75%DMEM的混合培养基中，该DMEM中含1.0%FBS，每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力90%以上；
i、按照50%、75%和100%的比例增加混合培养基中293FFreestyle SFM的比率，增加293F Freestyle SFM比率的同时按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培养基中DMEM中的FBS含量，用此混合培养基依次传代培养步骤h所得的HEK-293Ts细胞，直至所述的HEK-293Ts细胞于含100%293F Freestyle SFM且无FBS存在的培养基中培养两天后能达到1.2×106/ml细胞密度，活力90%以上，且细胞无结团现象；
j、以3×106/ml密度冻存i步骤得到的适应100%293F FreestyleSFM悬浮培养生长条件的HEK-293Ts于-80℃医用低温冰箱中，次日转移冻存管至液氮罐中保存。
如上所述的步骤a-j中的百分比浓度均为体积浓度。
本发明中的HEK-293T细胞具有鉴定为美国典型培养物保藏中心（ATCC）编号为CRL-11268的细胞系的特征，市售可得。
本发明中的HEK-293Ts细胞为适应悬浮培养的HEK-293T细胞。
本发明中的DMEM完全培养基为含10%FBS的DMEM培养基成品。
本发明与现有技术相比，有以下优点：
本发明培养出的HEK-293T细胞生长状态稳定，分散性好，完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，能够规模化生产。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述：
本发明提供了一种高效、高适应性的HEK-293T细胞悬浮驯化和无血清驯化的新方法。本发明分两步进行，先HEK-293T细胞由贴壁培养驯化为在带血清的培养基中悬浮培养，再对适应含血清培养基中悬浮培养的HEK-293T细胞降血清驯化至无血清驯化。具体为：
一种HEK-293T细胞的悬浮驯化方法，其包括以下步骤：
a、接种HEK-293T细胞于含10ml DMEM完全培养基的10cm培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中培养2天达到100%汇合状态；
b、弃除培养基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293T细胞消化脱离培养皿表面，然后加入3ml DMEM完全培养基终止胰酶消化;
c、将上述消化后的细胞用移液管吸取，并转移到15ml的尖底离心管中，1000rpm离心1min，沉降收集HEK-293T细胞，并用10mlDMEM完全培养基重悬收集的细胞，再将全部细胞接种于10cm康宁培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中；
d、步骤c中放入培养箱中的细胞每培养2天重复步骤b和c，重复7-9次，直至培养皿中同时出现贴壁细胞和悬浮生长的细胞团；吸取及转移过程中注意勿打散细胞团；
e、将最后一次培养的全部细胞消化后转移至摇瓶中培养，每两天按照0.3×106/ml传代一次，每次传代均用0.25%胰酶EDTA消化细胞团至分散状态，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得可连续传代95-105代，并可达到最高密度1.1×107/ml的，适应10%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293T细胞，命名该悬浮培养细胞为HEK-293Ts细胞，以3×106/ml密度冻存即可。
上述步骤a-e中的百分比浓度均为体积浓度。
HEK-293Ts细胞是能够悬浮培养的HEK-293T细胞。
对上述驯化后的HEK-293Ts悬浮细胞的无血清驯化方法，其包括以下步骤：
a、用含10%FBS的DMEM培养基于培养皿中培养细胞至密度为1.2×106/ml，活力95%以上，收集细胞于离心管中，于1000rpm离心2min沉降，留沉淀；
b、用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，并在此过程中震荡离心管，使细胞均匀分布；
c、加入5ml含10%FBS的DMEM培养基终止胰酶消化作用，并重悬步骤b得到的HEK-293Ts细胞，按照0.3×106/ml传代；
d、每两天重复a-c步骤一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
e、分步将DMEM培养基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%，重复步骤a-c，每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293Ts细胞；
f、将适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293Ts细胞每两天按照0.3×106/ml传代一次，扩大培养到50ml培养体积，至两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
g、对适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293Ts细胞进行70μm细胞筛过滤处理，观察并记录过滤后的HEK-293Ts细胞团数量及大小；
h、传代g步骤中过滤后的HEK-293Ts细胞于含25%293FFreestyle SFM及75%DMEM的混合培养基中，该DMEM中含1.0%FBS，每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力90%以上；
i、按照50%、75%和100%的比例增加混合培养基中293FFreestyle SFM的比率，增加293F Freestyle SFM比率的同时按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培养基中DMEM中的FBS含量，用此混合培养基依次传代培养步骤h所得的HEK-293Ts细胞，直至所述的HEK-293Ts细胞于含100%293F Freestyle SFM且无FBS存在的培养基中培养两天后能达到1.2×106/ml细胞密度，活力90%以上，且细胞无结团现象；
j、以3×106/ml密度冻存i步骤得到的适应100%293F FreestyleSFM悬浮培养生长条件的HEK-293Ts于-80℃医用低温冰箱中，次日转移冻存管至液氮罐中保存。
上述步骤a-j中的百分比浓度均为体积浓度。
本发明从HEK-293T细胞适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养后继续驯化时，扩大培养体积，以便于后续过细胞筛操作，过筛后，检测HEK-293Ts细胞团数量及大小以去除成团细胞，得到分散性良好的细胞。
本发明中，对降血清程序、最终生长培养基选择及去除细胞团的过程进行了整体优化，一个月时间左右驯化HEK-293T达到1.5%FBS血清浓度下正常传代，一个月时间左右驯化HEK-293T适应无血清无动物材料培养基，达到了在含血清培养基中贴壁培养同样或更佳的生长状态。最终该细胞株生长状态稳定，分散性好，完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，可用于规模化生产。
Claims (4)
1.一种HEK-293T细胞的悬浮驯化方法，其特征在于包括以下步骤：
a、接种HEK-293T细胞于含10ml DMEM完全培养基的10cm培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中培养2天达到100%汇合状态；
b、弃除培养基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293T细胞消化脱离培养皿表面，然后加入3ml DMEM完全培养基终止胰酶消化;
c、将上述消化后的细胞用移液管吸取，并转移到15ml的尖底离心管中，1000rpm离心1min，沉降收集HEK-293T细胞，并用10mlDMEM完全培养基重悬收集的细胞，再将全部细胞接种于10cm康宁培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中；
d、步骤c中放入培养箱中的细胞每培养2天重复步骤b和c，重复7-9次，直至培养皿中同时出现贴壁细胞和悬浮生长的细胞团；吸取及转移过程中注意勿打散细胞团；
e、将最后一次培养的全部细胞消化后转移至摇瓶中培养，每两天按照0.3×106/ml传代一次，每次传代均用0.25%胰酶EDTA消化细胞团至分散状态，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得可连续传代95-105代，并可达到最高密度1.1×107/ml的，适应10%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293T细胞，命名该悬浮培养细胞为HEK-293Ts细胞，以3×106/ml密度冻存即可。
2.根据权利要求1所述的一种HEK-293T细胞的悬浮驯化方法，其特征在于所述步骤a-e中的百分比浓度均为体积浓度。
3.一种权利要求1所述方法驯化后的HEK-293Ts悬浮细胞的无血清驯化方法，其特征在于包括以下步骤：
a、用含10%FBS的DMEM培养基于培养皿中培养细胞至密度为1.2×106/ml，活力95%以上，收集细胞于离心管中，于1000rpm离心2min沉降，留沉淀；
b、用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，并在此过程中震荡离心管，使细胞均匀分布；
c、加入5ml含10%FBS的DMEM培养基终止胰酶消化作用，并重悬步骤b得到的HEK-293Ts细胞，按照0.3×106/ml传代；
d、每两天重复a-c步骤一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
e、分步将DMEM培养基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%，重复步骤a-c，每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293Ts细胞；
f、将适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293Ts细胞每两天按照0.3×106/ml传代一次，扩大培养到50ml培养体积，至两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上；
g、对适应1.5%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293Ts细胞进行70μm细胞筛过滤处理，观察并记录过滤后的HEK-293Ts细胞团数量及大小；
h、传代g步骤中过滤后的HEK-293Ts细胞于含25%293FFreestyle SFM及75%DMEM的混合培养基中，该DMEM中含1.0%FBS，每两天传代一次，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力90%以上；
i、按照50%、75%和100%的比例增加混合培养基中293FFreestyle SFM的比率，增加293F Freestyle SFM比率的同时按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培养基中DMEM中的FBS含量，用此混合培养基依次传代培养步骤h所得的HEK-293Ts细胞，直至所述的HEK-293Ts细胞于含100%293F Freestyle SFM且无FBS存在的培养基中培养两天后能达到1.2×106/ml细胞密度，活力90%以上，且细胞无结团现象；
j、以3×106/ml密度冻存i步骤得到的适应100%293F FreestyleSFM悬浮培养生长条件的HEK-293Ts细胞于-80℃医用低温冰箱中，次日转移冻存管至液氮罐中保存。
4.根据权利要求3所述的一种HEK-293Ts悬浮细胞的无血清驯化方法，其特征在于所述步骤步骤a-j中的百分比浓度均为体积浓度。
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