CN115747137B - Hek293单克隆细胞群的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种HEK293单克隆细胞群的培养方法。本发明通过采用第一培养基和第二培养基对HEK293细胞进行培养，仅需4‑6周即可完成从单克隆铺板到获得HEK293悬浮单克隆细胞群的步骤，且成克隆率高达50％‑70％，适合商业环境下单克隆细胞株的短时间高通量筛选。
Description
技术领域
本发明涉及单克隆细胞筛选和培养领域，具体涉及HEK293单克隆细胞群的培养方法。
背景技术
复杂的生物药物生产基本上都是依赖于哺乳动物细胞系，其中CHO细胞系因为其技术发展较早相对成熟，成为主流细胞系。CHO细胞表达蛋白转录后修饰与人源蛋白存在明显差别，尤其在糖型修饰方面，对药效存在不利影响。因此并不是所有的重组蛋白都适合用CHO细胞表达(Swiech,Picanco-Castro et al.2012)。人源细胞系表达人源性重组蛋白，其翻译后修饰更接近天然的人源蛋白，所以人源细胞系越来越受到人们的关注。在人源细胞系中，HEK293(The human embryonic kidney cell line)因其转染效率高、生长速度快以及可实现高密度悬浮无血清培养而被广泛关注。自2015年以来FDA批准了7种HEK细胞衍生产品(Tan,Chin et al.2021)。
自1973年以来，通过研究者的不懈努力，目前已经衍生出的HEK393细胞系有11种之多，并且已经能购买到适应无血清悬浮培养的商业化HEK293细胞。不同于CHO细胞系，目前市售商业化HEK293细胞系以瞬时表达为主。近年来对HEK293细胞系的研究不断深入，GS筛选系统和DHFR筛选系统(李景传,薛博夫,袁媛,等,2015)均有报道用于HEK293细胞稳定表达细胞株的筛选(Abaandou,Quan et al.2021)。但与CHO细胞相比，HEK293细胞在重组蛋白表达方面起步较晚，相关技术并不成熟。
在单克隆细胞筛选方面，CHO细胞单克隆细胞株筛选技术相对成熟，市售多款针对悬浮单克隆筛选培养基。HEK293细胞相关技术发展较晚，HEK293细胞多采用贴壁细胞进行稳定转染及单克隆筛选，后经过悬浮驯化，用于蛋白稳定表达。此方法涉及到细胞消化及单克隆驯化，步骤繁琐且耗费时间，不利用HEK293细胞的商业化应用。目前没有针对HEK293悬浮单克隆细胞群的培养方法。
发明内容
本发明提供了一种针对HEK293悬浮细胞的单克隆细胞群的培养方法，旨在解决现有的HEK293单克隆细胞群的筛选和培养存在耗时长、成本高的问题。
相应地，本发明提供了一种HEK293单克隆细胞群的培养方法，其包括如下步骤：
(1)利用有限稀释法，将HEK293细胞进行单克隆铺板，以第一培养基进行培养；
(2)选取阳性克隆孔；
(3)以第二培养基对所述阳性克隆孔中的细胞进行扩增培养，得到HEK293单克隆细胞群；
其中，所述第一培养基为添加有FBS(胎牛血清)的DMEM培养基和/或MEM培养基；
所述第二培养基包含FreeStyle293培养基(FreeStyle293表达培养基(FreeStyle293Expression medium)，本文简称“FreeStyle293培养基”)。
本发明的发明人发现，以DMEM培养基和/或MEM培养基培养HEK293细胞时，细胞贴壁紧密且细胞间边界不清晰，细胞传代培养时需要用到PBS冲洗、胰酶消化等实验步骤；如以FreeStyle293培养基培养HEK293细胞时，又存在细胞成克隆率太低，难以满足单克隆细胞的高通量筛选的问题。对此，发明人经深入研究，得到了适用于培养HEK293单克隆细胞群的培养基组合。具体地，本发明先使用DMEM培养基和/或MEM培养基对HEK293单细胞进行贴壁培养，以满足单克隆生长，实现单克隆细胞的早期分裂并提高成克隆率；然后采用包含FreeStyle293培养基的第二培养基进行扩增培养，使细胞处于容易重悬的状态，可在不经胰酶消化的情况下直接吹起重悬，省去了胰酶消化和额外的悬浮驯化步骤，确保传代培养细胞的生长状态，最终获得细胞状态均一、活率高的HEK293单克隆细胞群。
在一些实施方案中，所述第一培养基为DMEM培养基，以提高HEK293细胞的成克隆率。优选地，所述第一培养基中所述FBS的含量为5％-20％，更优选15％。随着血清含量的增加，细胞生长更快。
在一些实施方案中，所述第二培养基还包含DMEM培养基和/或MEM培养基。即，在扩增培养时，既可以将所述第一培养基一次性全部替换为FreeStyle293培养基，也可以逐步替换为FreeStyle293培养基。从方便操作的角度出发，优选在扩增培养时一次性替换为FreeStyle293培养基。从提高细胞成克隆率的角度出发，优选先将所述第一培养基的一部分(例如四分之三)替换为FreeStyle293培养基，然后逐渐增加FreeStyle293培养基的比例，最终仅使用FreeStyle293培养基。在本发明一具体实施例中，通过逐步替换为FreeStyle293培养基的方式，细胞成克隆率为50-70％。
在一些实施方案中，所述第二培养基中还包含0-5％的FBS，以使细胞状态好、生长速度快，成克隆率更高。
在一些实施方案中，以所述第一培养基进行培养的天数为5-8天，例如5天、6天、7天或8天，优选7天。培养天数太短，会影响最终的成克隆率；培养天数太长，会影响细胞转到24孔板后的生长状态。
在一些实施方案中，以所述第二培养基进行扩增培养的天数为13天以上。此时，HEK293单克隆细胞群已经形成一定规模，存活率高。优选地，所述扩增培养的天数为18-25天，例如18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天。
在一些实施方案中，所述单克隆铺板中，所述HEK293细胞为0.5个细胞/孔。采用有限稀释法进行单克隆铺板是本领域已知方法，在本发明中，例如对96孔板进行铺板时，可以通过以下方式进行：选定一96孔板，每孔加液量(150μL)，所需总培养基量为：96*0.15＝14.4mL，所需总细胞数为：96*0.5＝48个细胞，即配制14.4mL含48个细胞的培养基，然后进行单克隆铺板。
在一些实施方案中，所述板为96孔板。可以理解的是，也可以使用其他孔数的培养板，包括但不限于48孔板、384孔板、1536孔板等。
在一些实施方案中，所述HEK293细胞为HEK293悬浮细胞或HEK293贴壁细胞。在一些实施方案中，所述HEK293细胞为HEK293悬浮细胞。
在一些实施方案中，可以在扩增培养以使HEK293单克隆细胞扩增为细胞群，而无需进行额外的悬浮驯化步骤，此时所述扩增培养包括：
(i)在96孔板中对所述阳性克隆进行扩增培养，直至细胞汇合率为40％-100％，优选90％；
(ii)将步骤(i)所得细胞群转移至24孔板中进行扩增培养，直至细胞汇合率为80％-100％，优选90％；
(iii)将步骤(ii)所得细胞群转移至6孔板中进行扩增培养，直至细胞汇合率为80％-100％，优选90％，得到HEK293单克隆细胞群。
在一些优选实施方案中，为了进一步提升细胞活率，便于后续冻存等使用，所述扩增培养还进一步包括：
(iv)将步骤(iii)所得细胞群转移至培养瓶中进行扩增培养，直至细胞活率大于90％，得到HEK293单克隆细胞群。
其中，所述培养瓶包括但不限于摇管、摇瓶。
在一些优选实施方案中，步骤(i)的扩增培养时间为7-14天。
在一些优选实施方案中，步骤(ii)的扩增培养时间为4-7天。
在一些优选实施方案中，步骤(iii)的扩增培养时间为2-4天。
在一些优选实施方案中，步骤(iv)的扩增培养时间为3-10天，每2-3天传代细胞，待细胞活率大于90％时，可选地进行细胞冻存。
在一些优选实施方案中，步骤(i)中，所述扩增培养中，所述第二培养基为添加有5％FBS的FreeStyle293培养基。
在一些优选实施方案中，步骤(ii)中，所述扩增培养中，所述第二培养基为添加有2％-5％FBS的FreeStyle293培养基，例如添加有2％FBS的FreeStyle293培养基、添加有3％FBS的FreeStyle293培养基、添加有4％FBS的FreeStyle293培养基、添加有5％FBS的FreeStyle293培养基。
在一些优选实施方案中，所述步骤(iii)中，所述扩增培养中，所述第二培养基为添加有0-2％FBS的FreeStyle293培养基，例如不添加FBS的FreeStyle293培养基、添加有1％FBS的FreeStyle293培养基、添加有2％FBS的FreeStyle293培养基。
在一些优选实施方案中，所述步骤(iv)中，所述扩增培养中，所述第二培养基为不添加血清的FreeStyle293培养基或其他HEK293无血清培养基。
在一些实施方案中，以所述第一培养基进行培养和/或以所述第二培养基进行扩增培养是在37℃、5-8％CO2环境下进行。在一些具体实施方案中，在5％CO2环境下进行；在一些具体实施方案中，在8％CO2环境下进行。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供的培养方法通过采用第一培养基(DMEM培养基和/或MEM培养基)和第二培养基(含FreeStyle293培养基)对HEK293细胞进行培养，一方面解决了DMEM培养基和/或MEM培养基、FreeStyle293培养基各自在培养HEK293悬浮单克隆细胞群时存在的问题，既可以获得HEK293悬浮单克隆细胞群，又可以提高成克隆率；另一方面省去了胰酶消化和额外的悬浮驯化步骤，确保传代培养细胞的生长状态，最终获得细胞状态均一、活率高的HEK293单克隆细胞群。
采用本发明提供的培养方法极大地缩减了时间、降低了成本，仅需约4-6周即可完成从单克隆铺板到获得HEK293悬浮单克隆细胞群的步骤，且成克隆率高达50％-70％，适合商业环境下单克隆细胞株的短时间高通量筛选。
附图说明
图1显示了本发明实施例2中A组、B组和D组与传统培养方法的工艺路线及所需时间进行对比的图，其中，A组、B组对应路线A/B，D组对应路线D；
图2为本发明实施例2中，细胞转到24孔板当天在10X显微镜下拍摄的图片，其中，A对应A组，B对应B组，D对应D组；
图3为本发明实施例2中，细胞转到24孔板3天后在4X显微镜下拍摄的图片，其中，A对应A组，B对应B组，D对应D组；
图4为本发明实施例2中，细胞转到6孔板2天后在10X显微镜下拍摄的图片，其中，A对应A组(FreeStyle293+5％FBS)，B对应B组(FreeStyle293+2％FBS)，D对应D组(FreeStyle293+2％FBS)；
图5为本发明实施例2中，细胞转到6孔板2天后在10X显微镜下拍摄的图片，其中，A对应A组(FreeStyle293且不加FBS)，B对应B组(FreeStyle293且不加FBS)，D对应D组(FreeStyle293且不加FBS)；
图6为本发明实施例3中96孔板斑点杂交检测结果，其中每个点加样2μL，每张膜添加标准品作为对照，上样量为125ng；
图7为本发明实施例3中24孔板斑点杂交检测结果，其中每个点加样2μL，每张膜添加标准品作为对照，上样量为125ng；
图8本发明实施例3中6孔板斑点杂交检测结果，其中每个点加样2μL，每张膜添加标准品作为对照，上样量为125ng；
图9为本发明实施例3中对第58号单克隆细胞株进行补料批培养的SDS-PAGE图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1培养基筛选
经过调研，尚未发现适合HEK 293悬浮细胞单克隆筛选的培养基，因此本实施例选出多款主流的、使用较多的HEK293悬浮细胞无血清培养基(培养基具体信息见表1)，期望能从中筛选到合适单克隆生长的培养基。步骤如下：
HEK293悬浮细胞(青岛大学赠予)复苏后传代两次，细胞活率大于90％后进行梯度铺板，1周后观察是否有克隆形成。
梯度铺板，96孔板8排，第一排(12孔)加入100个细胞/孔，200μL培养基。接下来每排倍比稀释，依次为50个细胞/孔、25个细胞/孔、12.5个细胞/孔、6.25个细胞/孔、3.125个细胞/孔、1.5625个细胞/孔、0.78125个细胞/孔。
培养条件：37℃，8％CO2，静置培养1周观察细胞生长状况。
结果见表1，除FreeStyle293 Expression medium之外其他11款培养基均无克隆形成。FreeStyle293培养基在高细胞密度下细胞可生长，随细胞数降低成克隆率直线下降。当细胞数低于12.5个细胞/孔，两块板均未发现克隆孔形成。以FreeStyle293进行细胞静置培养过程中，细胞状态差，生长速度慢。汇总实验结果，发现11款培养基都无法满足HEK293悬浮细胞的单克隆生长。
表1培养基筛选-无血清
因此，计划在培养基中添加部分血清，观察是否有利于单克隆的形成。同时选择两款常用的基础培养基MEM和DMEM一同进行实验，具体实验设计见表2。如表2所示，除FreeStyle293培养基外，其他悬浮培养基加血清并没有作用。FreeStyle293培养基添加5％FBS细胞生长得到有效改善，细胞状态好，生长速度快。100个细胞/孔、50个细胞/孔细胞的成克隆率可达到100％。此外两款基础培养基MEM和DMEM可见明显克隆形成，并且DMEM成克隆率(70％)明显高于MEM(23％)。在低细胞密度条件下，1.5625个细胞/孔、0.78125个细胞/孔成克隆率良好。因此选择悬浮培养基FreeStyle293和基础培养基DMEM进行下一轮实验。
表2培养基筛选-含血清
根据上述实验结果，选取FreeStyle293和DMEM进行优化实验。调节血清浓度和铺板时细胞数，观察单克隆形成率，结果见表3。结果表明，随着添加血清的增加，细胞生长明显更优。DMEM培养基添加15％FBS成克隆率略高于10％FBS，并且细胞生长更快。但是DMEM培养基为传统添加血清贴壁培养基，实验中观察到，以DMEM添加血清培养得到的细胞贴壁紧密且细胞间边界不清晰。细胞传代培养需用到PBS冲洗、胰酶消化等实验步骤。实验操作繁琐且复杂，费时费力，难以实现单克隆细胞的高通量筛选。
FreeStyle293培养基添加15％FBS，细胞成克隆率为6.6％，明显高于FreeStyle293+5％FBS(成克隆率：0％)。但是以FreeStyle293为基础培养基培养单克隆细胞，细胞成克隆率太低，难以满足工业条件下单克隆细胞的高通量筛选。通过前期实验发现，当每孔细胞数达到100个细胞/孔，以FreeStyle293为基础培养基细胞成克隆率可达到100％，并且FreeStyle293+5％FBS细胞状态良好，细胞边界清晰，细胞可在不经胰酶消化细胞直接吹起重悬，传代后细胞生长良好。
结合以上实验结果，重新设计实验。选取DMEM+15％FBS为第一培养基，实现单克隆细胞的早期分裂以提高成克隆率；选取FreeStyle293+5％FBS为第二培养基，实现单克隆的扩培，以简化细胞消化等操作，确保传代培养细胞的生长状态。
表3培养基优化
实施例2
为简化实验操作，省略胰酶消化过程，进一步增加单克隆培养的成克隆率，本实施例进一步优化培养方法。DMEM成克隆率高，细胞贴壁紧密，不利于细胞进一步的转板扩培及悬浮培养。FreeStyle293培养基细胞成克隆率低，但细胞贴壁不紧，易于重悬及悬浮培养。前面实验观察到，当每孔细胞数达到100时，FreeStyle293培养基细胞成克隆率可达100％。因此设计实验：先用DMEM+15％FBS铺板(0.5个细胞/孔)，培养7天左右(此时每孔细胞数约100)，在把细胞换液到FreeStyle293+5％FBS；在克隆扩培过程中(24孔板、6孔板、培养瓶)逐步降低血清，更换为悬浮培养基(FreeStyle293)，让细胞在培养瓶中进行悬浮培养，不再进行额外悬浮驯化。具体实验设计见表4。
表4单克隆细胞培养实验设计与结果
单克隆生长约3周，开始转板。转板过程中不使用胰酶消化，直接吹起悬浮，转移到新的孔板。A、B两组96孔板使用DMEM，24孔板、6孔板到摇瓶扩培过程中，逐步把DMEM置换成FreeStyle293，血清逐步降为0。D组96孔板DMEM培养7天后置换为FreeStyle293+5％FBS，24孔板、6孔板到摇瓶扩培过程中使用FreeStyle293添加0-5％FBS维持血清。
实验结果见表4。细胞生长约3周，细胞转到24孔板。通过显微镜观察发现，A、B两组重悬过程中细胞被机械力破坏，出现大量细胞碎片，并且细胞不易被吹散，细胞结团率高成坨分布。生长3-4天后，细胞成片分布，汇合率30-50％。D组重悬后细胞呈圆形或椭圆形，边界清晰状态良好，培养3-4天后细胞汇合率约80-90％，结果见图2、3。
细胞转到6孔板。A、B两组分别添加4％FBS、2％FBS，均表现为细胞直径逐渐变小死亡，少数存活细胞生长速度变慢。细胞培养第二天，细胞汇合率只有20-30％，约一周后细胞汇合率可达90％以上(图4)。A、B两组不添加FBS(平行实验，见表4、图5)，细胞状态极差，最终未得到培养物。说明以DMEM为基础培养基扩培起的细胞，想要重新适应悬浮培养模式更为困难。D组细胞生长状态良好，添加2％FBS实验组的细胞呈贴壁状态，汇合率达到100％(图4-D)；不添加FBS的实验组，部分细胞呈半贴壁状态，分布均一，成团生长，为正常悬浮细胞生长状态(图5-D)。说明以FreeStyle293为基础培养基(第二培养基)生长起的克隆，其悬浮特性完美保留，后期悬浮培养无压力。
悬浮适应培养：经扩培后，对得到的单克隆细胞群进行悬浮培养。分别从A、B、D实验组细胞群中随机选取5-6个单克隆细胞群进行悬浮培养，开始培养时记为D0，随培养天数增加命名。期间每2-3天进行传代培养，结果见表5。结果表明D实验组经过2-3次细胞传代，细胞活率可恢复到90％以上；A、B两组结果较差，第9天后分别选取两个表现较好单克隆细胞株继续培养。经多次传代后细胞略有恢复，但整体差于D实验组。
表5
从成克隆率分析：A、B组成克隆率均为63％；D组成克隆率为52％，略低于A、B两组。分析原因为，不能适应悬浮培养基的细胞直接死亡，导致成克隆率的下降。但52％的克隆率已远远高于FreeStyle293直接铺板(6％)方案。因此以DMEM为第一培养基支持单细胞生长，以FreeStyle293为第二培养基扩培单克隆，既可以提高成克隆率，又可以保持细胞悬浮特性，为最优实验方案。
实施例3
HEK293细胞经PEI转染，培养48小时后，添加博来霉素筛选得到稳定细胞池(cellpool-Tran11-1)。所用质粒为：pcDNA3.1/Zeo(+)-proNGF，在商业化质粒pcDNA3.1/Zeo(+)中插入神经生长因子(NGF)基因。酶切位点为：HindIII和BamHI。将细胞池的细胞复苏，每两天传代细胞，待活率大于90％时，利用有限稀释法，按0.5个细胞/孔进行单克隆铺96孔板，铺板培养基为DMEM+15％FBS，每孔150μL，共铺板6块。培养板放入二氧化碳培养箱，37℃、8％CO2培养约1周后观察细胞生长状况并换液。吸出96孔板中全部培养基，替换为150μLFreeStyle293+5％FBS培养基，继续培养1-2周。用显微镜观察细胞生长状况，当细胞汇合率达到40％-100％时统计细胞成克隆率，并取上清进行斑点杂交(DotBlot)检测。检测方法：用硝酸纤维素膜，每点点样2μL，每张膜添加标准品(人β-NGF蛋白，义翘神州，货号：11050-HNAC)作为对照，上样量为125ng；抗体:一抗：人β-NGF抗体(Abcam，货号：Ad6199)，二抗：山羊抗兔IgG HL(HRP)(Abcam，货号：Ad205718)。
经统计，本次共生成单克隆164株，成克隆率约57％。单克隆细胞株按顺序编号，并命名为1-164。96孔板Dotblot检测结果见图6，按显色深浅选择表达量高的单克隆细胞共72株，编号分别为：1、2、3、5、8、10、13、16、17、18、20、23、25、33、34、35、36、37、39、40、42、44、47、50、52、53、55、56、57、58、61、63、67、70、72、76、79、80、81、82、83、86、92、95、98、100、102、103、104、108、120、124、125、127、128、129、131、134、135、137、144、146、147、148、153、155、156、157、159、160、161、163。
72株单克隆转到24孔板继续培养，培养基为FreeStyle293+5％FBS。培养4天后，细胞汇合率为80％-100％，取样进行新一轮Dotblot检测。结果见图7。按显色深浅选择表达量高的单克隆细胞共36株，编号分别为：1、3、10、16、17、18、20、23、36、39、40、42、44、52、53、55、56、57、58、61、63、72、79、86、102、103、104、129、131、134、135、148、153、155、157、163。
36株单克隆转到6孔板继续培养，培养基为FreeStyle293+2％FBS。培养3天后，细胞汇合率为80％-100％，取样进行新一轮Dotblot检测。结果见图8。按显色深浅选择表达量高的单克隆细胞共24株，编号分别为：3、10、17、18、23、36、39、53、56、57、58、61、63、79、86、102、103、129、134、135、148、153、157、163。
对24个单克隆细胞株进行悬浮培养，每2-3天传代一次，命名规则同上文。经2-3次传代细胞活率恢复到90％以上，得到HEK293单克隆细胞群，进行细胞冻存。单克隆细胞株18、103、129恢复速度慢，最终舍弃。经过此轮单克隆细胞筛选实验，共得到21个单克隆细胞株，且细胞状态均一、活率良好，结果见表6。选取58号单克隆细胞株进行补料批培养。培养基Expi293(GibcoTM)，从第三天开始，隔天取样、补料(葡萄糖、谷氨酰胺)，第14天收获，所得样品由SDS-PAGE进行检测(图9)。本发明实施例所得单克隆细胞株经ELISA检测(达优β-NGF ELISA试剂盒，货号：1117632)，NGF蛋白生产能力约为100mg/L。
表6
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (15)
1.一种HEK293单克隆细胞群的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用有限稀释法，将HEK293细胞进行单克隆铺板，以第一培养基进行培养5-8天；
选取阳性克隆孔；
以第二培养基对所述阳性克隆孔中的细胞进行扩增培养，得到HEK293单克隆细胞群；
其中，所述第一培养基为添加有FBS的DMEM培养基和/或MEM培养基；
所述第二培养基的基础培养基为FreeStyle293培养基；
所述单克隆铺板中，所述板为96孔板。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述第一培养基中，所述FBS的含量为5％-20％。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述第一培养基中，所述FBS的含量为15％。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述第二培养基还包含DMEM培养基和/或MEM培养基。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述第二培养基中还包含0-5％的FBS。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，以所述第一培养基进行培养的天数为7天；和/或
以所述第二培养基进行扩增培养的天数为13天以上。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，以所述第二培养基进行扩增培养的天数为18-25天。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述扩增培养包括：
(i)在96孔板中对所述阳性克隆进行扩增培养，直至细胞汇合率为40％-100％；
(ii)将步骤(i)所得细胞群转移至24孔板中进行扩增培养，直至细胞汇合率为80％-100％；
(iii)将步骤(ii)所得细胞群转移至6孔板中进行扩增培养，直至细胞汇合率为80％-100％，得到HEK293单克隆细胞群。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，步骤(i)中，所述细胞汇合率为90％。
10.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述细胞汇合率为90％。
11.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，步骤(iii)中，所述细胞汇合率为90％。
12.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述培养进一步包括：
将步骤(iii)所得细胞群转移至培养瓶中进行培养，直至细胞活率大于90％，得到HEK293单克隆细胞群。
13.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，步骤(i)中，所述扩增培养中，所述第二培养基为添加有5％FBS的FreeStyle293培养基；
步骤(ii)中，所述扩增培养中，所述第二培养基为添加有2％-5％FBS的FreeStyle293培养基；和/或
所述步骤(iii)中，所述扩增培养中，所述第二培养基为添加有0-2％FBS的FreeStyle293培养基。
14.根据权利要求12所述的培养方法，其特征在于，所述培养瓶中的培养基为不添加血清的FreeStyle293培养基或其他HEK293无血清培养基。
15.根据权利要求1-14任一项所述的培养方法，其特征在于，以所述第一培养基进行培养和/或以所述第二培养基进行扩增培养是在37℃、5％-8％CO2环境下进行。
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