CN114561337B - 一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法 - Google Patents

一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法，涉及HepG2细胞克隆技术领域。单克隆增强培养基的组分包括RPMI‑1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子‑1；提高HepG2细胞克隆形成率的方法如下：将HepG2细胞依次进行原代培养和传代培养后，采用有限稀释法制备单克隆，且在培养至24～48h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，继续培养形成单克隆。使用本发明的单克隆增强培养基，HepG2细胞的单克隆形成率显著提高，这一发明解决了常规培养条件下HepG2细胞的单克隆形成率较低的问题。

Description

一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法
技术领域
本发明涉及HepG2细胞克隆技术领域，尤其涉及一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法。
背景技术
HepG2细胞分离自一个15岁的男性的肝组织，该男性患有分化良好的肝细胞癌，HepG2细胞所含的生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞具有同源性，常用于药物代谢和肝毒性研究，具体为通过ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，从而建立基因敲除、敲入、点突变等细胞株是常用的对HepG2 细胞的研究手段，HepG2细胞的药物代谢和肝毒性研究为后来治疗肝癌疾病研究出了一个巨大的成果。
随着药物代谢和肝毒性研究的深入，利用CRISPR/Cas9技术介导基因编辑构建HepG2细胞系已经成为研究的主流手段。因此，HepG2细胞单克隆的形成显得越来越重要。目前，HepG2细胞的常规培养条件为：在添加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，并于37℃、5％二氧化碳的环境下进行贴壁培养，在该常规培养条件下，HepG2细胞的单克隆形成率较低，单克隆生长状态不佳，难获得足够的单克隆进行基因型鉴定，制约了基因编辑细胞株的制备效率。
发明内容
针对背景技术提出的问题，本发明的目的在于提出一种单克隆增强培养基，采用该单克隆增强培养基，HepG2细胞的单克隆形成率显著提高，这一发明解决了常规培养条件下HepG2细胞的单克隆形成率较低的问题。
本发明的另一目的在于提出一种提高HepG2细胞克隆形成率的方法，能显著提高HepG2细胞的单克隆形成率，解决了常规培养条件下HepG2细胞的单克隆形成率较低的问题。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，所述单克隆增强培养基的组分包括RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1。
进一步的，按照总原料的体积百分比计算，所述胎牛血清的添加量为10％；
所述肝细胞生长因子的添加量为1～10ng/mL，所述胰岛素样生长因子-1的添加量为1～10ng/mL。
优选的，所述RPMI-1640培养基与DMEM培养基的体积比为1：1。
优选的，按照总原料的体积百分比计算，所述单克隆增强培养基的组分还包括1％的非必需氨基酸溶液。
一种提高HepG2细胞克隆形成率的方法，使用上述的提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，包括以下步骤：
(1)将HepG2细胞依次进行原代培养和传代培养；
(2)将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液进行有限稀释后加入到96孔细胞培养板中进行培养；
(3)待步骤(2)中的HepG2细胞培养至24～48h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，继续培养形成单克隆。
进一步的，所述步骤(2)的操作如下：将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，按照每次10倍的稀释比例将细胞悬液逐级稀释至1个细胞/100μL基础培养基的浓度，然后将稀释后的细胞悬液按100μL每孔加入到96孔细胞培养板中，于37℃和5％CO2的环境下进行培养。
进一步的，所述步骤(3)的操作如下：待步骤(2)中的HepG2细胞培养至24～48h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，于37℃和5％CO2的环境下进行培养，每4～6d更换新鲜的单克隆增强培养基，培养15～17d后形成单克隆。
进一步的，在所述步骤(1)中，HepG2细胞进行原代培养的操作如下：将冻存的HepG2细胞融化后移至完全培养液中，离心后收集HepG2细胞；用新鲜的完全培养液重悬细胞至单细胞悬液后，转移至装有完全培养液的培养瓶中进行培养。
进一步的，在所述步骤(1)中，HepG2细胞进行传代培养的操作如下：用胰酶将原代培养后的HepG2细胞消化成单细胞后，离心收集HepG2细胞，用完全培养基重悬HepG2细胞；将重悬后的HepG2细胞按照1:3的接种比例进行传代，并于37℃和5％CO2的环境下进行培养。
以上技术方案的有益效果为：
1、本技术方案中的单克隆增强培养基为由RPMI-1640培养基和DMEM培养基组成的复合培养基，采用该复合培养基对HepG2细胞进行单细胞克隆能不仅有效提高单克隆形成率，而且在单细胞克隆过程中，HepG2细胞形态正常，生长速度快，同时在单克隆增强培养基中添加胎牛血清、肝细胞生长因子(HGF) 和胰岛素样生长因子-1(IGF1)，通过RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、HGF和IGF1的协同作用，能进一步的提高HepG2细胞的单克隆形成率。
2、本技术方案通过在单克隆增强培养基中添加1％非必需氨基酸溶液，能进一步提高HepG2细胞的克隆形成率，使得HepG2细胞的克隆形成率增加1％～3％。
附图说明
图1是采用现有常规培养基培养7d后的HepG2细胞单克隆形态(常规培养基是指添加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基)；
图2是采用实施例2中的单克隆增强培养基培养7d后HepG2细胞单克隆形态。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，单克隆增强培养基的组分包括RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1。
通过采用本技术方案中的单克隆增强培养基对HepG2细胞进行单细胞克隆培养，能有效提高HepG2细胞的单克隆形成率。
具体来说，本技术方案中的单克隆增强培养基为由RPMI-1640培养基和 DMEM培养基组成的复合培养基，采用该复合培养基对HepG2细胞进行单细胞克隆能不仅有效提高单克隆形成率，而且在单细胞克隆形成过程中，HepG2 细胞形态正常，生长速度快，同时在单克隆增强培养基中添加胎牛血清、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF1)，通过RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、HGF和IGF1的协同作用，能进一步的提高HepG2细胞的单克隆形成率。
值得说明的是，HGF是一种旁分泌细胞生长、运动和形态发生因子，它由间充质细胞分泌，主要作用于上皮细胞和内皮细胞，也作用于造血祖细胞和T 细胞，HGF通过与原致癌c-Met受体结合激活酪氨酸激酶信号级联反应，能够调节HepG2细胞生长、细胞运动和形态发生，HGF由间充质细胞分泌，对HepG2 细胞能起到多功能细胞因子的作用，它刺激有丝分裂、细胞运动和基质侵入的能力，在组织再生中发挥核心作用，通过在单克隆增强培养基加添加HGF能大幅度增加单克隆形成率，若单克隆增强培养基仅由RPMI-1640培养基和DMEM培养基组成，并且培养基中仅添加胎牛血清，此时，HepG2细胞的单克隆形成率只能达到10％左右(培养14d后的单克隆形成率)，添加HGF后，HepG2 细胞的单克隆形成率能达到17％～22％。
IGF1是生长激素(GH)作用的主要介质，生长激素在垂体前叶产生，释放到血液中，然后刺激肝脏产生IGF1，通过IGF1刺激能使人体和动物体全身身体的增长，并且几乎对在体内的每一个细胞均能起到生长促进效应，特别是骨骼肌肉、软骨细胞、骨细胞、肝细胞、肾细胞、神经细胞、皮肤细胞、造血细胞和肺细胞，而且IGF1还可以调节细胞DNA合成，IGF1与至少两种细胞表面受体酪氨酸激酶结合，例如IGF1受体(IGF1R)和胰岛素受体，它的主要作用是通过与其特异性受体IGF1R结合，IGF1R存在于许多组织中的多种细胞类型的表面，IGF1与IGF1R的结合能启动细胞内信号传导，IGF1是AKT信号通路最有效的天然激活剂之一，是细胞生长和增殖的刺激剂，也是程序性细胞死亡的有效抑制剂，本技术方案通过在单克隆增强培养基中进一步添加IGF1，能刺激HepG2细胞生长和增殖，从而形成单克隆，能进一步增加HepG2细胞的单克隆形成率，使得HepG2细胞的单克隆形成率能达到24％～26％(培养14d后的单克隆形成率)。
进一步的说明，按照总原料的体积百分比计算，胎牛血清的添加量为10％；
肝细胞生长因子的添加量为1～10ng/mL，胰岛素样生长因子-1的添加量为 1～10ng/mL。
需要特别说明的是，本技术方案的单克隆增强培养基中HGF和IGF1的添加量分别为1～10ng/mL，若HGF和IGF1的添加量分别少于1ng/mL，则增加 HepG2细胞的单克隆形成率的效果不显著，在1～10ng/mL这个范围内，随着 HGF和IGF1的添加量的增加，HepG2细胞的单克隆形成率不断增加，当HGF 和IGF1的添加量分别为10ng/mL时，HepG2细胞的单克隆形成率最高，而当 HGF和IGF1的添加量大于10ng/mL时，HepG2细胞的单克隆形成率增加不明显，甚至会有所下降和影响HepG2细胞的形态，而且添加量过大也会成本增加。
优选的，单克隆增强培养基中HGF和IGF1的添加量分别为10ng/mL，此时，HepG2细胞的单克隆形成率较高。
进一步的说明，RPMI-1640培养基与DMEM培养基的体积比为1：1。
当RPMI-1640培养基和DMEM培养基的体积比为1：1时，在培养过程中， HepG2细胞形态正常，生长速度较快，2～3天便可进行传代培养。
具体来说，RPMI-1640培养基是洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell ParkMemorial Institute)所研发的一类细胞培养基，培养基代号为1640；DMEM培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的，本技术方案中所用到的RPMI-1640培养基和DMEM培养基均可以从市面上直接购买得到。
进一步的说明，按照总原料的体积百分比计算，单克隆增强培养基的组分还包括1％的非必需氨基酸溶液。
值得说明的是，非必需氨基酸溶液(Non-EssentialAminoAcids,NEAA)源自MEM培养基配方，包括L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天(门)冬酰胺、L-天(门) 冬氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸7种必需氨基酸，能有效改善单克隆增强培养基配比，降低细胞培养时HepG2细胞自身生产非必需氨基酸的副作用，促进HepG2细胞增殖代谢，本技术方案通过在单克隆增强培养基中添加1％非必需氨基酸溶液，能进一步提高HepG2细胞的克隆形成率，使得HepG2细胞的克隆形成率增加1％～3％。
具体的，本技术方案中的非必需氨基酸溶液可以直接从市面上购买得到，本技术方案中的非必需氨基酸溶液的厂家为Thermofisher，货号为11140050，该型号的非必需氨基酸溶液包含标准最小必需培养基(MEM)中100X浓度的非必需氨基酸，故在选用工作浓度为1％。
一种提高HepG2细胞克隆形成率的方法，使用上述的提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，包括以下步骤：
(1)将HepG2细胞依次进行原代培养和传代培养；
(2)将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液进行有限稀释后加入到96孔细胞培养板中进行培养；
(3)待步骤(2)中的HepG2细胞培养至24～48h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，继续培养形成单克隆。
在现有常规培养条件下，HepG2细胞的单克隆形成率较低，一般为3％～5％左右，单克隆生长状态不佳，难获得足够的单克隆进行基因型鉴定，制约了基因编辑细胞株的制备效率。
值得说明的是，本技术方案先将HepG2细胞依次进行原代培养和传代培养后，使得HepG2细胞状态稳定后，再使用有限稀释法制备单克隆，而且在96 孔细胞培养板中培养24～48h后，将基础培养基更换为本技术方案中的单克隆增强培养基继续培养，本技术方案中的单克隆增强培养基为由RPMI-1640培养基和DMEM培养基组成的复合培养基，采用该复合培养基对HepG2细胞进行单细胞克隆能不仅有效提高单克隆形成率，而且在单细胞克隆过程中，HepG2细胞形态正常，生长速度快，同时在单克隆增强培养基中添加有体积百分比为10％的胎牛血清、1～10ng/mL的HGF和1～10ng/mL的IGF1，通过RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF1)的协同作用，能进一步的提高HepG2细胞的单克隆形成率。
具体来说，步骤(3)中的基础培养基为现有常规的能够用来培养HepG2 细胞的培养基，如DMEM培养基。
进一步的说明，步骤(2)的操作如下：将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，按照每次10倍的稀释比例将细胞悬液逐级稀释至1个细胞/100μL基础培养基的浓度，然后将稀释后的细胞悬液按100μL每孔加入到96孔细胞培养板中，于37℃和5％CO2的环境下进行培养。
进一步的说明，步骤(3)的操作如下：待步骤(2)中的HepG2细胞培养至24～48h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，于37℃和5％CO2的环境下进行培养，每4～6d更换新鲜的单克隆增强培养基，培养15～17d后形成单克隆。
在培养过程中HepG2细胞会吸收单克隆增强培养基中的营养物质，因此，需要每4～6d更换新鲜的单克隆增强培养基，从而促进HepG2细胞生长和增殖，从而形成单克隆。
进一步的说明，在步骤(1)中，HepG2细胞进行原代培养的操作如下：将冻存的HepG2细胞融化后移至完全培养液中，离心后收集HepG2细胞；用新鲜的完全培养液重悬细胞至单细胞悬液后，转移至装有完全培养液的培养瓶中进行培养。
具体来说，在步骤(1)中，HepG2细胞进行原代培养的操作步骤如下：
(1)准备工作：将完全培养液置37℃水浴锅预热30min，随后将冻存的细胞从液氮中取出，转移到-80℃冰箱，放置5～10分钟让残余液氮挥发；
(2)在超净台内用吸管吸取6～7mL完全培养液至15mL离心管中；
(3)将HepG2细胞从-80℃冰箱取出暂时放置于干冰里，复苏时稍稍甩动，去除残留的干冰和液氮，再迅速用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动(注意：水不能没过盖子)，使其在1min左右完全融化；
(4)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，稍稍晾干，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，盖上盖子，在1100rpm的转速下室温离心4min收集HepG2细胞；
(5)超净台内小心倒去上清液，倒时管口不要太靠近废液缸，用吸管吸取 2mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移至装有3mL完全培养液的 T25cm培养瓶中，写上细胞名称、复苏日期、代次，放置于37℃、体积分数为 5％CO2的饱和湿度培养箱中进行培养。
进一步的说明，在步骤(1)中，HepG2细胞进行传代培养的操作如下：用胰酶将原代培养后的HepG2细胞消化成单细胞后，离心收集HepG2细胞，用完全培养基重悬HepG2细胞；将重悬后的HepG2细胞按照1:3的接种比例进行传代，并于37℃和5％CO2的环境下进行培养。
值得说明的是，待原代培养中的HepG2细胞长至80％～90％融合度即可传代，HepG2细胞进行传代培养的操作步骤如下：
(1)在超净台内把原代培养的培养瓶里的培养液倒至废液缸，用1×PBS 缓冲液洗涤细胞1次(T25培养瓶中添加5mL的1×PBS缓冲液，T75培养瓶添加8mL的1×PBS缓冲液)，以去除残余的培养液和血清(血清含有胰酶的抑制因子)；
(2)加入1～3mL胰酶溶液，轻轻晃动培养瓶并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育2～3min(若HepG2细胞难以消化，可适当延长孵育时间)，待在显微镜下观察到大部分HepG2细胞变圆不贴壁，轻轻晃动和敲击培养瓶两侧有大量HepG2细胞脱离时，立即终止消化；
(3)加入2倍胰酶体积的完全培养液终止消化，并轻吹打HepG2细胞3-5 次，使所有HepG2细胞彻底脱壁(由于HepG2细胞聚团生长，难吹散，需将它吹散成单细胞培养)；
(4)用10mL血清移液管转移细胞悬浮液到一支50mL离心管中，同一批次的细胞合并收集在一起，用适量PBS将培养瓶里的残余细胞洗下来，一起加到支50mL离心管中，盖上盖子，做好标记；
(5)在1100rpm的转速下于室温离心4min，离心后，打开盖子倒去上清，加2mL完全培养基重悬细胞；
(6)HepG2细胞按照1：3接种比例进行传代；
(7)摇晃均匀后，写上细胞名称、代次、日期，放置于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱内进行培养。
具体来说，1×PBS缓冲液、胰酶溶液、完全培养液和完全培养基均可以直接从市面上购买得到。
下面通过实施例和对比例进一步阐述本技术方案。
实施例1-7
一种提高HepG2细胞克隆形成率的方法，包括以下步骤：
(1)将HepG2细胞按照以下依次进行原代培养和传代培养；
具体的，在步骤(1)中，对HepG2细胞进行原代培养的操作步骤如下：
(1.1.1)准备材料：DMEM完全培养液、T25培养瓶、15mL离心管、10mL 血清移液管、废液缸、酒精棉等；
准备工作：将完全培养液置37℃水浴锅预热30min，随后将冻存的细胞从液氮中取出，转移到-80℃冰箱，放置5分钟让残余液氮挥发；
(1.1.2)在超净台内用吸管吸取6mL完全培养液至15mL离心管中；
(1.1.3)将HepG2细胞从-80℃冰箱取出暂时放置于干冰里，复苏时稍稍甩动，去除残留的干冰和液氮，再迅速用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动(注意：水不能没过盖子)，使其在1min左右完全融化；
(1.1.4)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，稍稍晾干，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，盖上盖子，在1100rpm 的转速下室温离心4min收集HepG2细胞；
(1.1.5)超净台内小心倒去上清液，倒时管口不要太靠近废液缸，用吸管吸取2mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移至装有3mL完全培养液的T25cm培养瓶中，写上细胞名称、复苏日期、代次，放置于37℃、体积分数为5％CO2的饱和湿度培养箱中进行培养。
具体的，在步骤(1)中，对HepG2细胞进行传代培养的操作步骤如下：
(1.2.1)准备材料：DMEM完全培养液、T25或T75培养瓶、0.25％的胰酶、1×PBS、50mL离心管、血清移液管(10mL，25mL)、废液缸；
在超净台内把原代培养的培养瓶里的培养液倒至废液缸，用1×PBS缓冲液洗涤细胞1次(T25培养瓶中添加5mL的1×PBS缓冲液，T75培养瓶添加8mL 的1×PBS缓冲液)，以去除残余的培养液和血清(血清含有胰酶的抑制因子)；
(1.2.2)加入2mL胰酶溶液，轻轻晃动培养瓶并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育3min，待在显微镜下观察到大部分HepG2细胞变圆不贴壁，轻轻晃动和敲击培养瓶两侧有大量HepG2细胞脱离时，立即终止消化；
(1.2.3)加入2倍胰酶体积的完全培养液终止消化，并轻吹打HepG2细胞 5次，使所有HepG2细胞彻底脱壁；
(1.2.4)用10mL血清移液管转移细胞悬浮液到一支50mL离心管中，同一批次的细胞合并收集在一起，用适量1×PBS将培养瓶里的残余细胞洗下来，一起加到支50mL离心管中，盖上盖子，做好标记；
(1.2.5)在1100rpm的转速下于室温离心4min，离心后，打开盖子倒去上清，加2mL完全培养基重悬细胞；
(1.2.6)HepG2细胞按照1：3接种比例进行传代，以下是各培养器皿中培养基用量：
培养皿类别 培养液总体积
T25培养瓶 5ml
T75培养瓶 12mL
T175培养瓶 25mL
6孔板 2mL/孔
12孔板 1mL/孔
(1.2.7)摇晃均匀后，写上细胞名称、代次、日期，放置于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱内进行培养。
(2)将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，按照每次10倍的稀释比例将细胞悬液逐级稀释至1个细胞/100μL 基础培养基的浓度，然后将稀释后的细胞悬液按100μL每孔加入到96孔细胞培养板中，于37℃和5％CO2的环境下进行培养；
(3)待步骤(2)中的HepG2细胞培养至36h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，于37℃和5％CO2的环境下进行培养，每5d更换新鲜的单克隆增强培养基，培养15d后形成单克隆，其中，单克隆增强培养基的组分如下表1所示。
对比例1-7
对比例1-7中提高HepG2细胞克隆形成率的方法和实施例1基本相同，不同之处在于，对比例1-7中单克隆增强培养基的原料组成和实施例1中单克隆增强培养基的原料组成不同，具体的，对比例1-7中单克隆增强培养基的组分如下表1所示。
具体的，在步骤(3)中，当实施例和对比例中的HepG2细胞培养7d及14d 后，观察统计单克隆形成孔数，并根据以下公式计算HepG2细胞单克隆形成率，实施例1-7和对比例1-7中HepG2细胞的单克隆形成率如下表1所示；
单克隆形成率＝14d单克隆形成孔数/单克隆铺板总数。
表1实施例和对比例中单克隆增强培养基的原料组成及单克隆形成率
具体的，由表1可知，实施例1-7中HepG2细胞的单克隆形成率达到 24％～29％，而且从实施例7的检测结果可知，当单克隆增强培养基中HGF和 IGF1的添加量分别为10ng/mL时，HepG2细胞的单克隆形成率最大，从实施例2-6的检测结果可知，当单克隆增强培养基中HGF或IGF1的添加量增加时， HepG2细胞的单克隆形成率会有所增加，而当单克隆增强培养基中HGF或IGF1 的添加量减少时，HepG2细胞的单克隆形成率会有所下降。
从对比例1的计算结果可知，当单克隆增强培养基中不添加HGF、IGF1 和NEAA时，HepG2细胞的单克隆形成率只能达到10％；从对比例2-4的计算结果可知，但单克隆增强培养基中仅添加HGF、IGF1和NEAA中的其中一种， HepG2细胞的单克隆形成率不高，仅为11％～18％；从对比例5-6的计算结果可知，当单克隆增强培养基仅添加HGF和IGF1中的任意一种和NEAA时，采用该单克隆增强培养基进行单细胞克隆，HepG2细胞的单克隆形成率也较低；从实施例2和对比例7的计算结果可知，当单克隆增强培养基中的基础培养基仅使用了DMEM，而不是RPMI 1640和DMEM的组合，尽管在单克隆增强培养基中添加了HGF、IGF1和NEAA，HepG2细胞的单克隆形成率相对于实施例2 下降了6％，由此可见，本技术方案的单克隆增强培养基通过复合使用RPMI 1640和DMEM，以及在单克隆增强培养基中添加了适量的HGF、IGF1和NEAA，能显著提高HepG2细胞的单克隆形成率，能够获得足够的单克隆进行基因型鉴定，加快基因编辑细胞株的制备效率，从而给药物代谢和肝毒性研究带来突出的效果。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于，所述单克隆增强培养基的组分由RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1组成；
按照总原料的体积百分比计算，所述胎牛血清的添加量为10%；
所述肝细胞生长因子的添加量为1~10 ng/mL，所述胰岛素样生长因子-1的添加量为1~10 ng/mL；
所述RPMI-1640培养基与DMEM培养基的体积比为1：1。
2.根据权利要求1所述的提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于，所述单克隆增强培养基的组分由RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和非必需氨基酸溶液组成；
按照总原料的体积百分比计算，所述非必需氨基酸溶液的添加量为1%；
按照总原料的体积百分比计算，所述胎牛血清的添加量为10%；
所述肝细胞生长因子的添加量为1~10 ng/mL，所述胰岛素样生长因子-1的添加量为1~10 ng/mL；
所述RPMI-1640培养基与DMEM培养基的体积比为1：1。
3.一种提高HepG2细胞克隆形成率的方法，其特征在于，使用如权利要求1-2中任意一项所述的提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，包括以下步骤：
（1）将HepG2细胞依次进行原代培养和传代培养；
（2）将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，将细胞悬液进行有限稀释后加入到96孔细胞培养板中进行培养；
（3）待步骤（2）中的HepG2细胞培养至24~48h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，继续培养形成单克隆。
4.根据权利要求3所述的提高HepG2细胞克隆形成率的方法，其特征在于，所述步骤（2）的操作如下：将传代培养后的HepG2细胞消化成单细胞并用基础培养基重悬，得到细胞悬液，按照每次10倍的稀释比例将细胞悬液逐级稀释至1个细胞/100 μL基础培养基的浓度，然后将稀释后的细胞悬液按100μL每孔加入到96孔细胞培养板中，于37℃和5% CO2的环境下进行培养。
5.根据权利要求3所述的提高HepG2细胞克隆形成率的方法，其特征在于，所述步骤（3）的操作如下：待步骤（2）中的HepG2细胞培养至24~48h后，将基础培养基更换为单克隆增强培养基，于37℃和5% CO2的环境下进行培养，每4~6d更换新鲜的单克隆增强培养基，培养15~17 d后形成单克隆。
6.根据权利要求3所述的提高HepG2细胞克隆形成率的方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，HepG2细胞进行原代培养的操作如下：将冻存的HepG2细胞融化后移至完全培养液中，离心后收集HepG2细胞；用新鲜的完全培养液重悬细胞至单细胞悬液后，转移至装有完全培养液的培养瓶中进行培养。
7.根据权利要求6所述的提高HepG2细胞克隆形成率的方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，HepG2细胞进行传代培养的操作如下：用胰酶将原代培养后的HepG2细胞消化成单细胞后，离心收集HepG2细胞，用完全培养基重悬HepG2细胞；将重悬后的HepG2细胞按照1:3的接种比例进行传代，并于37℃和5% CO2的环境下进行培养。
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