CN1935985A - 一种获得鸡EPGCs单细胞克隆的方法 - Google Patents
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Abstract
一种获得鸡EPGCs单细胞克隆的方法，其特征是利用第四代的鸡EPGCs进行单细胞克隆制备，并对克隆制备的单细胞进行培养和传代，获得遗传均一的鸡EPGCs细胞。本发明方法简便易行，无需特殊的仪器要求，采用常规的细胞培养操作即可完成单细胞克隆的制作过程。通过对获得的细胞进行形态学和染色鉴定，证明所培养的细胞仍保持其原有特性。单细胞克隆培养获得的细胞可以直接应用于发育生物学研究、基因组印记研究和医学功能研究领域。由于经单细胞克隆制备培养后的细胞遗传可变性减小，所以可用于研究不同因素对于细胞的影响。
Description
技术领域
本发明公开了一种获得鸡EPGCs单细胞克隆的方法，属于组织与细胞工程领域。
技术背景
胚胎原始生殖细胞(EPGCs)是生殖母细胞的前体细胞，是精子或卵子的祖先细胞，在多能干细胞研究领域中已成为一个新的干细胞资源，亦是近年来干细胞研究的又一个热点。单细胞克隆技术的蓬勃发展是在上世纪80年代以后，一方面是由于理论研究的需要，另一方面是为了适应细胞工程研究的发展。细胞系中的细胞类型是不均一的，通过单细胞克隆，能使培养物从不均一转为均一，使培养物的遗传可变性减少。通过单细胞克隆获得的细胞可以应用于细胞特性和功能研究、发育生物学和生产医用领域，并且由于其遗传相对均一，利于不同因素影响的比较。目前，对于单细胞克隆技术的研究主要集中在哺乳动物的胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓细胞等多能细胞，迄今未见有关禽类胚胎生殖细胞单细胞克隆的报道。已有报道小鼠和人的单细胞克隆胚胎干细胞系已经建立，但这些研究都是在已经获得的胚胎干细胞系的基础上进行的一系列体外操作。
发明内容
本发明的目的是发明一种操作简单且可获得遗传均一的鸡EPGCs单细胞克隆的方法。
本发明的技术方案，一种获得鸡EPGCs单细胞克隆的方法，其特征是利用第四代的鸡EPGCs(胚胎原始生殖细胞)制备单细胞克隆，通过单细胞克隆获得遗传均一并保持其原有特性的鸡EPGCs克隆。
所述的克隆步骤包括：
1)鸡EPGCs的分离、培养和传代
采用单独酶解离法在鸡胚发育的第19期或第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs，将提取出的细胞接种到已制备的饲养层上，用添加血清和细胞因子的高糖DMEM培养液培养，培养2～3天时开始出现鸟巢状的EPGCs集落，以多次离散法进行传代；
2)鸡EPGCs的单细胞克隆制作
采用传至四代的鸡EPGCs，培养2～3天后采用G带法进行染色体组型分析：加入秋水仙素30g/L，在38℃、5％CO2的培养箱中孵育0.5小时后，离心收集细胞，按常规方法制片处理，对核型正常的细胞用口吸管将形成的克隆吸出，0.25％胰蛋白酶及0.04％EDTA消化成小细胞团，再轻缓吹打成单细胞悬液，计数后采用有限稀释法：先将细胞用培养液稀释到40个细胞/ml，接种到96孔板中，每孔50μl，再将新鲜培养液与原代培养的上清液按1∶3的比例混合，然后每孔再加入这种混合的培养液100μl，将培养板置于38℃，5％CO2的培养箱中培养2小时后在倒置显微镜下观察，将仅有1个细胞的培养孔作标记，以后每天换液一半并观察，待克隆形成后，按照常规方法进行培养和传代。
本发明方法简便易行，无需特殊的仪器要求，采用常规的细胞培养操作即可完成单细胞克隆的制作过程。通过单细胞克隆技术可获得遗传相对均一的鸡EPGCs细胞，可以应用于基因组印记研究、细胞特性和功能研究、发育生物学和医学功能研究领域，并且易于比较。本发明的方法同样适用于其它禽类及其它类型的干细胞上，为其提供简单易行的操作。
附图说明
图1为鸡EPGC单细胞培养7～10天后形成的集落图片；
图2为第19期鸡EPGCs单细胞克隆呈AKP染色图片；
图3为第28期鸡EPGCs单细胞克隆呈AKP染色图片；
图4为第19期鸡EPGCs单细胞克隆SSEA-1染色图片；
图5为第28期鸡EPGCs单细胞克隆SSEA-1染色图片；
图6为第19期鸡EPGCs单细胞克隆Hoechst33342染色图片；
图7为第28期鸡EPGCs单细胞克隆Hoechst33342染色图片。
具体实施方式
1、鸡EPGCs的分离、培养和传代
采用单独酶解离法在鸡胚发育的第19期或第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs，将提取出的细胞接种到已制备的饲养层上，用添加10％的胎牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/L β-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、10IU/ml鼠白血病抑制因子(mLIF)、5ng/ml人干细胞生长因子(hSCF)、10ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)、0.04ng/ml人白细胞介素-11(hIL-11)，10ng/ml胰岛素样生长因子(hIGF)的高糖DMEM培养液培养，培养约2～3天时开始出现鸟巢状的EPGCs集落，以多次离散法进行传代。
2、鸡EPGCs的单细胞克隆的制作
采用传至四代的鸡EPGCs，培养2~3天后采用G带法进行染色体组型分析：加入秋水仙素30g/L，在38℃、5％CO2的培养箱中孵育0.5小时后，离心收集细胞，按常规方法制片处理。核型正常的细胞用口吸管将形成的克隆吸出，0.25％胰蛋白酶及0.04％EDTA消化成小细胞团，再轻缓吹打成单细胞悬液，计数后采用有限稀释法：先将细胞用培养液稀释到40个细胞/ml，接种到96孔板中，每孔50μl.再将新鲜培养液与原代培养的上清液按1∶3的比例混合，然后每孔再加入这种混合的培养液100μl(即每孔含有新鲜培养液和原代培养液各75μl)。将培养板置于38℃，5％CO2的培养箱中培养2小时后在倒置显微镜下观察，将仅有1个细胞的培养孔作标记，以后每天换液一半并观察，待克隆形成后，按照常规方法进行培养和传代。
3、鸡EPGCs的单细胞克隆的鉴定
AKP(碱性磷酸酶)活性检测：选取生长良好的鸡EPGCs单细胞克隆进行AKP活性检测。用PBS清洗3次后加入25％戊二醛固定30分钟，再用PBS清洗3次去除固定液，加入新鲜配置的α萘酚磷酸钠-FastBlue B染色液染色30分钟(4℃，避光)，PBS清洗后在倒置显微镜下观察。
SSEA-1染色：将培养在96孔板中的EPGCs细胞用冷丙酮和无水乙醇(3∶2)固定30min，PBS漂洗。用含10％FCS的PBS封闭2小时，PBS漂洗后用标记的SSEA-1抗体稀释液(抗体原液用10％FCS的PBS进行50倍稀释)，37℃水浴1小时，反复漂洗3次，每次5分钟以上，再加入FITC标记的山羊抗鼠的二抗，37℃水浴45min，PBS漂洗，自然风干。
Hoechst33342染色：细胞固定后以用Hoechst33342(10mg/ml)避光染色1小时，漂洗，细胞或集落在激发光下呈兰色。
(1)单个细胞经培养后形成的克隆见图1。
(2)鸡EPGCs单细胞克隆的鉴定结果：AKP染色的结果见图2和图3；SSEA-1染色结果见图4和图5；Hoechst33342染色结果见图6和图7。
Claims (2)
1、一种获得鸡EPGCs单细胞克隆的方法，其特征是利用第四代的鸡EPGCs制备单细胞克隆，通过单细胞克隆获得遗传均一并保持其原有特性的鸡EPGCs克隆。
2、根据权利要求1所述的一种获得鸡EPGCs单细胞克隆的方法，其特征是所述的克隆步骤包括：
1)鸡EPGCs的分离、培养和传代
采用单独酶解离法在鸡胚发育的第19期或第28期提取生殖腺中聚集的EPGCs，将提取出的细胞接种到已制备的饲养层上，用添加血清和细胞因子的高糖DMEM培养液培养，培养2～3天时开始出现鸟巢状的EPGCs集落，以多次离散法进行传代；
2)鸡EPGCs的单细胞克隆制作
采用传至四代的鸡EPGCs，培养2～3天后采用G带法进行染色体组型分析：加入秋水仙素30g/L，在38℃、5％CO2的培养箱中孵育0.5小时后，离心收集细胞，按常规方法制片处理，对核型正常的细胞用口吸管将形成的克隆吸出，0.25％胰蛋白酶及0.04％EDTA消化成小细胞团，再轻缓吹打成单细胞悬液，计数后采用有限稀释法：先将细胞用培养液稀释到40个细胞/ml，接种到96孔板中，每孔50μl，再将新鲜培养液与原代培养的上清液按1∶3的比例混合，然后每孔再加入这种混合的培养液100μl，将培养板置于38℃，5％CO2的培养箱中培养2小时后在倒置显微镜下观察，将仅有1个细胞的培养孔作标记，以后每天换液一半并观察，待克隆形成后，按照常规方法进行培养和传代。
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