具体实施方式
对于具有向心肌细胞分化能力的干细胞(胚胎干细胞、骨髓干细胞等成体干细胞),进行适当的心肌细胞分化诱导后,发生向心肌细胞的分化。即,例如通过从培养液中去除白血病抑制因子(LIF)进行悬浮培养,使形成细胞块(类胚体)以悬滴法对小鼠胚胎干细胞进行处理,可诱导胚胎干细胞向心肌细胞进行分化。或者使用绒猴胚胎干细胞或人类胚胎干细胞,可同样的诱导胚胎干细胞向心肌细胞进行分化。
本发明的方法可适用于来源于任意一种哺乳动物的干细胞。例如,本发明的方法可适用于来源于小鼠、牛、山羊、猪、猫、绒猴、猕猴、人的干细胞,只要是来自于上述动物的干细胞无其他限定。例如,作为本发明中使用的干细胞,可例举出目前已经作为培养细胞广泛使用的小鼠、猴子、人等哺乳动物的来源的ES细胞。
作为来源于小鼠的ES细胞的具体例子,可举出EB3细胞、E14细胞、D3细胞、CCE细胞、R1细胞、129SV细胞、J1细胞等。本发明中使用的源于小鼠的ES细胞可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)或Chemicon公司、Cell& Molecular Technologies公司等购入。
源于猴子的ES细胞,有例如猕猴(rhesus monkey:Macacamulatta)(Thomson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995;92:7844)或食蟹猴(cynomolgus monkey:Macaca fascicularis)(Suemori etal.,Dev.Dyn.2001;222:273-279)、普通绒猴(common marmoset:Callithrix jacchus)(Sasaki et al.,Stem Cells.2005;23:1304-1313)等建立的报道,可以进行使用。例如,可以从财团法人·实验动物中央研究所处获得绒猴的ES细胞。
来源于人的ES细胞,目前全世界已经建立有数10种以上,例如美国·国立卫生研究所的清单(http://stemcells.nih.gov/registry/index.asp)上登记了很多细胞株可供使用,同时还可以从Cellartis公司或ES Cell International公司、Wisconsin AlumniResearch Foundation等处购入。另外,日本方面,可以从国立大学法人·京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心处获得(Suemori et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2006;345:926-932)
另外,也有确立牛(Mitalipova et al.,Cloning 2001;3:59-67)、鸟(Petitte et al.,Mech.Dev.2004;121:1159-1168)、斑马鱼(Fishman,M.C.,Science 2001;294:1290-1291)的ES细胞的报道。
通常ES细胞通过培养初期胚胎进行建立,从进行了体细胞核的核移植的初期胚胎可以制得ES细胞(Munsie et al.,Curr.Biol.10:989,2000;Wakayama et al.,Science 292:740,2001;Hwang etal.,Science 303:1669,2004)。另外,还有使孤雌胚胎在囊胚期同样的阶段发生,从其制备ES细胞的尝试(美国专利公开第02/168763号;Vrana K et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:11911-6);或还有通过ES细胞与体细胞的融合,制备具有体细胞核的遗传基因的ES细胞的方法等的报道(国际公开号第00/49137号;Tada et al.,Curr.Biol.11:1553,2001)。本发明中可使用的ES细胞中,还包含通过基因工程的方法改变经上述方法制备的ES细胞或ES细胞上的染色体上的基因的形式。
可在本发明相关的方法中使用的干细胞不限于ES细胞,还包含哺乳动物的成体脏器或组织细胞、骨髓细胞、血液细胞、甚至胚胎或胎盘细胞等来源的、具有类似于ES细胞的形态和性质的所有干细胞。此处,和ES细胞类似的形态性质指ES细胞特异性的表面(抗原)标记的存在或ES细胞特异的基因表达、或畸胎瘤(teratoma)形成能及嵌合体小鼠形成能,定义为具有ES细胞特异性的细胞生物学性质。作为其具体例子可举出通过原始生殖细胞制备的EG细胞、通过精巢生殖细胞制备的GS细胞、及从成纤维细胞等体细胞通过特殊基因操作制备的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells:iPS)等。在该方法中,通过除去LIF并悬浮培养的分化诱导后3~6天的类胚体中,含有未分化中胚叶及推定心肌细胞等将分化为将来的心肌细胞的细胞。另外,在诱导胚胎干细胞时,已知在分化诱导开始后第7天(人的胚胎干细胞为第10天)出现心肌细胞。但是,在如上所述从胚胎干细胞形成的类胚体中,也包含上述细胞的其它未分化细胞、内皮上皮样细胞、神经细胞等未分化为心肌细胞的细胞。本发明中,除了心肌细胞和将来会分化为心肌细胞(未分化中胚叶,推定心肌细胞)以外,将上述所有细胞均称为“非心肌细胞”。
本发明者们,为了从上述形成的类胚体种混合的非心肌细胞中,只选择心肌细胞或将来会分化为心肌细胞的细胞,对在心肌分化发生所经过的时间中,低血清条件、低糖条件、低营养条件、低钙条件、及弱酸性pH条件为心肌细胞的选择产生的作用进行了研究。
其结果,本发明者们对未分化中胚叶、推定心肌细胞及含有心肌细胞的细胞混合物,分别在低血清条件、低糖条件、低营养条件、低钙条件、弱酸性pH条件等单独条件、或组合几个条件,或者组合所有条件下进行培养时发现,与非心肌细胞相比,心肌细胞或将来会分化为心肌细胞的细胞本身比较难受到细胞伤害。
基于该发现,在本发明中,可以通过使未分化中胚叶、推定心肌细胞及含有心肌细胞的细胞混合物,暴露于低糖条件、低血清条件、低营养条件、低钙条件、及弱酸性pH条件等各培养条件中的一个或它们的组合下,从构成细胞混合物的细胞中,将在上述条件下生存的细胞集落作为推定心肌细胞或心肌细胞的细胞集团进行选择。
该选择方法由于在心肌细胞具有生理耐受性的条件下进行选择,因此称为生理耐受性选择法。本发明中的生理耐受性选择法,包括在低糖条件、低血清条件、低营养条件、低钙条件、及弱酸性pH条件的培养液中,培养含有心肌细胞的细胞混合物。
本发明中的“低糖条件”指培养液中的糖类(即在含有多糖、单糖(葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖等)的物质群中,在生物体内、细胞内发生化学分解、转换,最终通过糖消化系统异化的物质)的浓度降低的培养液中进行培养的条件,优选在不含上述糖类的培养液中培养,或分化诱导时使用的培养液中的糖类的条件比较时,糖类浓度被降低至不足1%的培养液中的培养的条件。本条件中优选至少尽量除去糖类中的葡萄糖。例如,在一般的细胞培养中使用的市售的培养液中,为α-MEM、MEM[Hank氏BSS]、DMEM等培养液的情况下含有D-葡萄糖为1g/L(5.56mM),为RPMI 1640的情况下含有D-葡萄糖为2.0g/L(11.12mM),为Ham氏F-12时含有D-葡萄糖为1.82g/L(10.12mM),在培养基中分别含有上述糖类。因此,意指使糖类浓度降低至1%的培养液的情况下,含有糖类55.60~111.20μM的条件的培养液。
在本发明中,与上述一般培养液中的糖类的条件相比,发现了糖类降低至不足1%时,可引起非心肌细胞的细胞凋亡,而未分化中胚叶、推定心肌细胞及心肌细胞在培养液中可以生存。在本发明中,为了实现低糖条件,可使用例如RPMI培养液(无糖)、DMEM培养液(无糖)(分别为GIBCO)。
在本发明中,血清成分不仅指血清本身、或在动物或人的血清中含有的生理活性物质群本身,也指含有作为上述生理活性物质群的人工制备的物质群。本说明书中的“低血清条件”为含有“无血清条件”的用语,指获得未分化中胚叶之前的阶段中,以添加至培养液中的血清或血清成分、或人工生理活性物质群的浓度为100%计算时,使其仅为0~10%。例如,指在获得未分化中胚叶之前的阶段中培养液中含有10%的浓度的血清时,为了选择推定心肌细胞或心肌细胞,使培养液中的血清浓度设定为1%以下的情况。在本发明中,与上述一般培养液中的血清成分相比,发现使培养液中的血清成分降低至10%时,可引起非心肌细胞的细胞凋亡,而未分化中胚叶、推定心肌细胞及心肌细胞在培养液中可以生存。
本发明中的“低营养条件”指在一般培养液(RPMI培养液、DMEM培养液、MEM培养液、F12培养液、或α-MEM培养液)中含有的所有营养成分,与一般的培养液中的营养成分比较,低至10%以下,优选低至10%以下。本发明中,与一般的培养液中的营养成分相比,发现营养成分低至10%时,可引起非心肌细胞的细胞凋亡,而未分化中胚叶、推定心肌细胞及心肌细胞在培养液中可以生存。上述“低营养条件”的培养液,可使用生理类溶液(例如Hank氏BSS无糖或PBS等),将一般培养液(RPMI培养液、DMEM培养液、MEM培养液、F12培养液、或α-MEM培养液)稀释10倍进行制备。
本发明中的“低钙条件”指培养液中的钙浓度0.3~1.3mM。已知一般心肌细胞分化时使用的培养液(DMEM培养液、MEM培养液、或α-MEM培养液),培养液中的钙浓度为1.8mM,在使心肌细胞分化时培养期全程均维持钙浓度在该浓度水平。在本发明中,发现钙浓度为0.3~1.3mM,比一般培养液中的钙浓度明显低时,可引起非心肌细胞的细胞凋亡,而未分化中胚叶、推定心肌细胞及心肌细胞在培养液中可以生存。本发明中的“低钙条件”的培养液可使用RPMI培养液或F12培养液(均为GIBCO出品)等。
本发明中的“弱酸性pH条件”指培养液的pH为pH6~7。一般促使心肌细胞分化的培养液(RPMI培养液、DMEM培养液、MEM培养液、F12培养液、或α-MEM培养液)的pH在生理条件下维持在pH7.5左右。该基本BSS在5%CO2温育箱pH达到6.5左右。在本发明中,发现与一般的培养液的pH相比较使pH达到酸性一侧的6.5时,可引起非心肌细胞的细胞凋亡,而未分化中胚叶、推定心肌细胞及心肌细胞在培养液中可以生存。本发明的“弱酸性pH条件”的培养液的制备可使用Hank’s Balanced Salts Solution(Hank氏BSS)制备培养液而获得。
对于上述细胞混合物,可通过适当的采用2种以上的上述培养液条件的使用方法(生理耐性选择法)的任意组合,更有效的纯化心肌细胞。
本发明中者们发现,使培养液中缺失糖类,可引起在胚胎干细胞来源的类胚体中非心肌细胞的细胞凋亡,为了进一步提高针对类胚体中未分化中胚叶、推定心肌细胞及心肌细胞的选择性,研究了可以选择性的为心肌细胞提供能量的其它的基质。
结果发现,作为糖类的替代,在培养液中添加乳酸(Lactate,0.1~5mM)、或天门冬氨酸(20~100mg/L)和谷氨酸(20~100mg/L)的组合、或丙酮酸(0.5~5mM)、或上述物质的组合是有效的。通过上述方法,可以选择性的为心肌细胞提供营养。
该选择方法利用了心肌细胞的代谢能力进行选择,因此被称为代谢选择法。本发明中的代谢选择法包含以下内容:在乳酸添加条件、天门冬氨酸·谷氨酸添加条件、或丙酮酸添加条件的培养液中,培养含有心肌细胞的细胞混合物。
通过组合使用本发明中发现的两种心肌细胞选择方法(即生理耐性选择法和代谢选择法),可以高度纯化心肌细胞。另外,还可通过重复进行上述方法,实现更高度的纯化。
在本发明中,用作心肌细胞的来源的含有未分化中胚叶、推定心肌细胞及心肌细胞的细胞混合物,可从干细胞或胎盘制备。此处,单针对干细胞而言,除了具有可以分化为任何一种细胞类型的全能性质的细胞(例如胚胎干细胞等)以外,也包括具有分化为多种特定类型的细胞的性质的多能干细胞(例如骨髓来源的成体干细胞等),对其并无限定。
从胚胎干细胞制备心肌细胞时,伴随向心肌细胞的分化的进行,要经过未分化中胚叶、推定心肌细胞再分化为心肌细胞。此处,未分化中胚叶指确认表达未分化中胚叶特异性的Brachyury蛋白质的阶段。另一方面,推定心肌细胞指,确认表达了Brachyury等未分化中胚叶特异性的蛋白质,且在同一细胞中未确认表达Nkx2.5或肌动蛋白等心肌细胞特异性的蛋白质的细胞,该细胞无需在培养液中添加新的物质,而具有专门分化为心肌细胞能力的细胞;而心肌细胞指,在生长细胞时发生自律性搏动,且在固定后表达Nkx2.5、GATA4、肌动蛋白等标记的细胞。
例如在本发明中,可使用小鼠胚胎干细胞作为心肌细胞来源时,通过从培养液中去除LIF使小鼠胚胎干细胞发生分化诱导后,采用上述的生理耐性选择法及/或代谢选择法对4~7天的小鼠胚胎干细胞来源的类胚体进行培养,从构成类胚体的细胞当中,将在上述条件下得以生存的细胞集落作为推定心肌细胞或心肌细胞的集落选择出来。
其一例为,从分化诱导5天后,在低糖条件、低血清条件、低营养条件、低钙条件、及弱酸性pH条件的各种条件中的任一种或它们的组合下进行24小时选择后的细胞为不具有搏动性的细胞,在使用针对未分化中胚叶标记的Brachyury特异性的免疫染色法对选择后的不具有搏动性的细胞集落进行染色时,几乎所有的细胞均显示Brachyury阳性。这显示,本发明所述的方法为选择未分化中胚叶的方法。
另外,对上述Brachyury阳性细胞进行目前已知的在发生最早其表达的心肌细胞特异性同源异型蛋白质的Nkx2.5的免疫染色时,为染色阴性。此外,对上述细胞进一步培养,上述细胞内约8~9成细胞均分化为心肌细胞,从此可看出,通过该方法选择的未分化中胚叶为未知最原始的推定心肌细胞。
在另外一例中,为了选择心肌细胞,对分化诱导后第4~6天的胚胎干细胞来源的类胚体,使用添加ITS(胰岛素(10mg/L)、转铁蛋白(5.5mg/L)、亚硒酸钠(6.7mg/L))(GIBCO公司),从无血清的MEM(Minimum Essential Medium)[Hank’s BSS](Invitrogen):α-MEM(SIGMA)=9:1以1:9混合的培养液(此时的钙浓度为约1.3mM),进行3天左右的培养。该培养液的条件相当于低血清条件、低钙条件及弱酸性pH条件。以该方法制备的推定心肌细胞,通过继续在相同培养液中培养,可分化为心肌细胞。分化诱导5天以后,特别是在诱导为自律跳动的心肌细胞后,通过进行上述操作时使用MEM[Hank’s BSS],低血清条件、低钙条件及弱酸性pH培养条件下进行培养,可更有效的选择心肌细胞。以该方法制备的心肌细胞,进一步在上述MEM和α-MEM的混合培养液中继续培养,可进一步分化为心房肌和心室肌。
在另一例子中,对于胚胎干细胞来源的类胚体,以无糖的Hank氏BSS(GIBCO)等洗涤,充分除去糖类以后,在低血清条件、低营养条件(例如,通常市售的溶液以等张缓冲液稀释10倍的产品)、弱酸性pH条件、低钙条件的培养液(Hank氏BSS[无糖]/DMEM无糖=9:1)中添加乳酸1mM(乳酸添加条件)、天门冬氨酸20mg/L和谷氨酰胺20mg/L(天门冬氨酸·谷氨酰胺添加条件)、或丙酮酸1mM(丙酮酸添加条件)的培养液中,通过3~7天培养,能更有效的选择心肌细胞。
在使用来源于骨髓的成体干细胞制备心肌细胞时,从细胞混合物中选择心肌细胞也可以适用上述本发明的方法。此处,来源于小鼠骨髓的心肌细胞可通过采用国际公开WO01/048151(PCT/JP00/09323)中记载的细胞及方法进行诱导。即,在IMDM(Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium)(GIBCO)中添加20%胎牛血清调整的培养基中培养CMG细胞(CMG细胞的建立方法参照J.Clin.Invest.,1999,Vol.103,p697-705),经24小时添加终浓度为3μmol/1的5-氮杂胞苷(SIGMA),以不含5-氮杂胞苷的上述培养液培养2~3周,可诱导分化为自律跳动的心肌细胞。将含有自律跳动的心肌细胞的细胞混合物,基于上述生理耐性选择法和/或代谢选择法进行培养,可得到心肌细胞。
另外,在从小鼠胎盘获得心肌细胞时,从心肌细胞最初出现的胎生第7天(相当于人受精后第16天),可通过下述处理进行选择和纯化。即,在无菌状态下取得小鼠胎盘,以Hank氏BSS[无糖]洗涤4次。洗涤中使用10ml的移液管进行数次移液,使胎盘分散为细胞块。使用上述生理耐性选择法及/或代谢选择法对上述细胞块进行培养,可得到心肌细胞。
如上所述,在本发明中,对于用作心肌细胞来源的未分化中胚叶、推定心肌细胞及含有心肌细胞的细胞混合物,通过采用上述生理耐性选择法及/或代谢选择法进行培养,可得到心肌细胞互相结合的心肌细胞块。但是,如上所述得到的心肌细胞块,被周围发生了细胞凋亡的非心肌细胞层所覆盖,因此在将得到的心肌细胞块用于移植使用时,必须除去非心肌细胞层,对该问题进行了更进一步的研究。
本发明者们发现,采用一般的细胞扩散方法的胰蛋白酶(Trypsin)等随机消化蛋白质的酶或EDTA等离子螯合剂,将细胞块分离为单个的细胞,心肌细胞的生存率显著下降。因此必需一种在维持心肌细胞块形状的同时有效除去附着的死亡细胞的新方法。
通常,细胞和细胞之间,除了通过被称为细胞外基质的胶原蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白等而结合以外,还被认为通过膜蛋白质直接结合。因此,本发明者们使用对基质蛋白质特异性很高的胶原蛋白酶或弹性蛋白酶对心肌细胞块进行消化,可在不使细胞块零乱分散,维持心肌细胞的细胞块的同时,有效地除去周围附着的非心肌细胞的死细胞。这是从心肌细胞之间的结合主要为N-钙粘蛋白(cadherin)和连接蛋白(connexin)等直接连接的事实推测出来的。
在本发明中,使用例如0.01~0.1%的III型蛋白质胶原蛋白酶(Wartington),在37℃的温浴中振荡处理20分钟,使心肌细胞和死亡细胞分离,为了充分洗涤胶原蛋白酶,通过重复4次离心和上清交换获得最终产物,可有效地除去死细胞。
但是,通过胶原蛋白酶处理以后,除了心肌细胞构成的细胞块以外,有可能存在非心肌细胞的死亡细胞残留的凝集体的情况。该死亡细胞残留的凝集体回收的情况根据代谢选择时期越长,出现频率有增加的趋势。本发明者们在研究上述死细胞残存的凝集体的密度时,发现此时的死细胞比活细胞具有更高的密度和比重,并发现通过进行适当的密度梯度离心可以分离活细胞和死细胞。可用于采用上述密度梯度离心分离活细胞和死细胞的试剂有PercollTM(Pharmacia公司)、FicollTM(Pharmacia公司)Optiprep(GIBCO公司)等,但并不限定于此。
实施例
实施例1:小鼠胚胎干细胞中使用低或无血清培养条件的心肌细
胞选择的凝集块的形成
在本实施例的目的为,通过将含有心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清的培养液中进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的血清枯竭产生的作用,更具体而言,对从细胞块(类胚体)选择心肌细胞时的血清枯竭产生的作用进行研究。
小鼠胚胎干细胞(细胞株名EB3,Nat Genet 2000;24:372-376)由独立行政法人·理化学研究所的丹羽仁史博士惠赠。使用已知方法(Differentiation 2001,68,p31-43)的类似方法,即使用培养液[α-MEM(Minimum Essential Medium)(SIGMA)、10%FBS(EQUITECBIO)、100units/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块,共培养7天。以上述方法相似,使其分化为含有心肌细胞的细胞块(类胚体)后,使用上述培养液在培养皿中对上述类胚体进行接种,在37℃、5%CO2的条件下培养3~5天。将以上作为已知的心肌细胞分化方法。通过该条件进行分化的细胞块在图1中表示。此处,图1A显示类胚体的显微镜图像,图1B中,显示了使用抗肌动蛋白抗体(SIGMA)特异性的荧光免疫染色的结果,在类胚体中的心肌细胞存在区域以轮廓线表示,而在图1C中类胚体中的心肌细胞,对上述免疫染色确定的心肌细胞存在区域在图1A的相差显微镜图像中进行了轮廓的反转。上述研究的结果,在图1D中,连接的类胚体中心肌细胞的存在模式在模式图中显示,心肌细胞包埋在其它细胞内部而存在,难以便利的从类胚体中分离纯化出来。
另外,使小鼠胚胎干细胞在同样条件下分化为含有心肌细胞的细胞块(类胚体)以后,接种到培养皿中培养5天,从含有分化的心肌细胞的类胚体的培养环境中除去血清进一步培养3天。
结果在图2中表示。此处,图2A为在上述条件下选择培养的结合类胚体的显微镜图像,在图2B中,类胚体中的心肌细胞,通过对摄影确定的自律跳动的心肌区域标以轮廓线图示。从上述研究结果可知,在图2C中,如进行该选择培养的类胚体中的心肌细胞的存在模式所显示,在类胚体的表面存在心肌细胞集落,且心肌细胞之间形成块。
实施例2:在小鼠胚胎干细胞中,使用低和/或无血清培养条件的
推定心肌细胞选择性的凝集块的形成和高比例含有心肌细胞的凝集块
的形成
本实施例的目的为,通过将含有推定心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清的培养液中进行培养,对含有推定心肌细胞的细胞块(类胚体)的血清枯竭产生的作用,更具体而言,对从细胞块(类胚体)选择心肌细胞时的血清枯竭产生的作用进行研究。
使用实施例1通常的方法,对于小鼠胚胎干细胞,用培养液[α-MEM(SIGMA)、10%FBS(EQUITEC BIO)、青霉素链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块,在37℃,5%CO2条件下培养5天。在已知的培养方法中(实施例1中已经定义),分化培养第7天观察到自律跳动的细胞。而在未观察到自律跳动的心肌细胞的分化培养第5天(第4~6天也得到同样的结果),从培养环境中除去血清进行1天(24小时)培养。图3A为在通常条件下培养6天的类胚体,而图3B为培养5天时除去血清再培养1天(24小时)的与图3A同时期的类胚体。
在培养第5天除去血清(将含有类胚体的溶液移至沉降管,自然沉降后除去上清,在无血清培养基[α-MEM(SIGMA)、胰岛素/转铁蛋白/硒(GIBCO)青霉素/链霉素(GIBCO)]中一次洗净,置换为相同的培养基)培养1天(24小时)的图3B中显示的细胞块,进一步培养1~4天时,分化为含有高比例的具有进行自律跳动的心肌细胞的细胞块。从此可以看出,通过在小鼠胚胎干细胞培养第5天时除去血清再培养1天(24小时),可形成以高比例含有虽然未发生自律跳动但推定分化为将来的心肌细胞的推定心肌细胞的细胞块。
实施例3:在小鼠胚胎干细胞中,使用低钙培养液选择性的抑制
心肌细胞以外的细胞的分化和/或增殖
本实施例的目的为,通过将含有推定心肌细胞的细胞块(类胚体),在降低钙浓度的培养液中进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的钙浓度降低产生的作用,更具体而言,对从细胞块(类胚体)选择心肌细胞时钙浓度降低的作用进行研究。
在实施例1通常的方法,对于小鼠胚胎干细胞,用培养液[α-MEM(SIGMA)、10%FBS(EQUITEC BIO)、青霉素和链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块,合计培养7天培养为含有心肌细胞的细胞块(类胚体)。使心肌细胞发生分化的培养液中的钙浓度为1.8mM。在该培养方法中,心肌细胞的含量为10%左右,其它细胞为未分化的细胞或神经细胞、上皮细胞等。
相对于此,在本实施例中,用培养液[α-MEM(SIGMA)、10%FBS(EQUITEC BIO)、青霉素和链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块,将分化开始后第5天的类胚体接种于板中,进一步在同样的培养液中培养1天(24小时)。然后在分化开始后第6天,即类胚体接种后经过1天(24小时)后,以含有10%FBS的RPMI培养液(钙浓度1.8mM)培养至第8天的对照组比较(图4A),将培养液替换为含有10%FBS的RPMI培养液(钙浓度0.4mM;GIBCO)进行培养(图4B)。该结果中,处理过的类胚体与未处理过的类胚体比较,存在于类胚体边缘的扁平细胞的生长受到抑制,而向神经细胞的分化也受到抑制(图4B)。
实施例4:小鼠胚胎干细胞中,以无血清和/或弱酸性pH条件对
推定心肌细胞进行选择
本实施例的目的为,通过将含有推定心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清且弱酸性的培养液中进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的血清枯竭及弱酸性pH产生的复合作用,更具体而言,对从细胞块(类胚体)选择推定心肌细胞时血清枯竭及弱酸性pH产生的复合作用进行研究。
对于小鼠胚胎干细胞,用培养液[α-MEM(SIGMA)、10%FBS(EQUITEC BIO)、青霉素和链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块,开始分化5天后,使用其朝含有推定心肌细胞的细胞块(类胚体)分化。在本实施例中,在未观察到自律跳动的分化培养第5天(从第4天至第6天均观察到同样结果),将培养液与在MEM(Minimum Essential Medium)(GIBCO)(GIBCO)培养液中添加了胰岛素、转铁蛋白、硒(GIBCO)的培养液进行替换,进一步再培养1天(24小时)。该培养液具有在5%二氧化碳气体环境中达到pH6.5左右的特点,因此在5%二氧化碳气体中弱酸性化的该培养液中进行培养。
结果,形成以高比例含有不发生自律跳动的推定心肌细胞的细胞块。图5A表示在通常条件下培养的结合类胚体,相对于此,图5B分别显示1天(24小时)无血清培养的类胚体,图5C显示2天(48小时)无血清培养的类胚体。在该条件下,与类胚体表面接近的细胞发生选择性的细胞凋亡,而类胚体中心的细胞并不发生细胞凋亡(图5)。在图5D中,包围基于图5C的推定心肌细胞的区域的,死细胞存在的区域以箭头表示。
在类胚体形成5天后,获得在无血清、弱酸性pH条件下培养24小时选择的细胞块、及将其进一步继续培养3天(72小时)的细胞块。制作上述细胞块的冷冻切片,使用抗Brachyury抗体(Santacruz公司)进行针对未分化中胚叶标记的Brachyury的免疫染色(图6A~6D)。其结果,在无血清·弱酸性pH条件下培养24小时的细胞(图6B及6D)与在含有血清·中性培养液中培养24小时的细胞(图6A及6C)比较,Brachyury阳性的细胞比例显著增高。进一步继续3天培养的选择的细胞块的几乎所有细胞均为Bra chyury阳性(图中未显示)。在该继续培养3天的细胞块中,使用抗据说在最初发生初期的推定心肌细胞表达的Nkx2.5的抗体(抗Nkx2.5的抗体(Santacruz公司))进行免疫染色(图6E~6N)。该Nkx2.5为,在分化为心肌细胞后仍然维持表达的已知的一种标记物。在图6E~H中显示将在含有血清、中性培养液中培养24小时的EB继续培养3天的EB。已知在上述培养条件下,EB内部的一部分细胞分化为心肌细胞。而且分化为该心肌细胞的细胞的比例,与Brachyury阳性的细胞(图6A~6C)的比例相同。相对于此,图6I~N所表示的在无血清、弱酸性pH条件下培养24小时的EB中,分化为心肌细胞的细胞的比例达到8成以上,这与Brachyury阳性的细胞的比例(图6B~6D)相同。
上述选择了5天+1天(24小时)的细胞对于抗Brachyury抗体为阳性,对抗Nkx2.5抗体为阴性(图60列P列)。相反5天+1天(24小时)+3天的细胞块对于抗Brachyury抗体为阴性,对抗Nkx2.5抗体为阳性。
如上所述,进一步培养该细胞块1~4天后可分化为高比例含有发生自律性搏动的心肌细胞的细胞块。因此,5天+1天(24小时)选择的细胞确认为推定心肌细胞。
实施例5:小鼠胚胎干细胞中,无血清/弱酸性pH条件下心肌细
胞的选择
本实施例的目的为,通过将含有心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清且弱酸性的培养液中进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的血清枯竭及弱酸性pH产生的复合作用,更具体而言,对从细胞块(类胚体)选择推定心肌细胞时血清枯竭及弱酸性pH产生的复合作用进行研究。
对于小鼠胚胎干细胞,用培养液[α-MEM(SIGMA)、10%FBS(EQUITEC BIO)、青霉素和链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块,开始分化5天后,使用其朝含有推定心肌细胞的细胞块(类胚体)分化。在本实施例中,在未观察到自律跳动的分化培养第5天(从第4天至第6天均观察到同样结果),将培养液与在无血清的MEM(GIBCO)培养液中添加了胰岛素、转铁蛋白、硒(GIBCO)的培养液进行替换,进一步再培养2天。进一步将得到的推定心肌细胞块再培养2天,分化为心肌细胞。图7A显示上述方法制作得到的心肌细胞块的显微镜图像,图7B为图7A从横方向观察的图。
在该条件中,发现心肌以外的细胞呈现选择性的细胞凋亡,而相反心肌细胞具有强烈的自律跳动并且不发生细胞凋亡。结果形成了含有大量心肌细胞的细胞块(图7A和图7B)。
实施例6:在无糖、无血清并添加乳酸的培养条件下的心肌细胞
的选择和心肌细胞的调整
本实施例的目的为,通过将含有心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清且除去糖类的培养液中进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的血清枯竭及糖类枯竭产生的复合作用,更具体而言,对从细胞块(类胚体)选择心肌细胞时血清枯竭及糖类枯竭产生的复合作用进行研究。
对于小鼠胚胎干细胞,用培养液[α-MEM(SIGMA)、10%FBS(EQUITEC BIO)、青霉素和链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块合计培养7天后,使用其朝含有心肌细胞的细胞块(类胚体)分化。直至分化开始第10天,对于类胚体,为了尽可能除去培养液中的糖类,以D-MEM(Dulbecco’s Modified EagleMedium)(无糖)培养液(GIBCO)洗涤4~5次,在加入最终1mM乳酸的D-MEM培养液(GIBCO)中,培养7天(从多次实验中,以目视确认自律跳动的心肌细胞的生存率和其它细胞的生存率,有必要在5~10天的范围内进行调节)。生物体内的乳酸浓度在生理条件下上升至4mM左右,因此该乳酸浓度为生理浓度。
结果如图8所示,形成了作为活细胞的心肌细胞构成的半球形状的细胞网。即,图8A显示选择后的形成网状的心肌细胞,图8B为图8A横着观察的图。
实施例7:附着于心肌细胞块的死细胞的去除
在实施例6中制备的细胞块上附着有死细胞及细胞外基质。有必要将其除去以纯化心肌细胞块本身。但是,在以前的研究中,使用胰蛋白酶等非选择性消化蛋白质的酶时,发现心肌细胞的存活率显著降低。
因此本实施例的目的为,研究可以选择性除去死细胞或细胞外基质的条件。
使用0.01~0.1%的选择性消化细胞外基质之一的胶原蛋白的胶原蛋白酶,对在实施例6中制备的图8表示的细胞块,在37℃下消化20分钟。在胶原蛋白酶处理过后,通过任意具有生理渗透压的等张溶液进行洗涤。在该阶段,由于心肌细胞维持细胞块(直径40μm以上)形状,洗涤通过插入具有40μm直径的孔的市售的膜进行溶液交换而进行,以选择性的除去分散的心肌细胞以外的细胞。重复进行该洗涤操作4~5次。对回收的细胞块进行培养,使用作为心肌细胞指标的抗肌节-肌动蛋白抗体(SIGMA)进行免疫染色(红色[细胞质的横纹纤维染色]、青色[通过DAPI(Molecular Probe)对核染色])。
结果表明,使用本方法纯化的心肌细胞块含有80%心肌细胞(图9)。
实施例8:在无血清/弱酸性/低钙/无糖,且添加乳酸的培养条件
下的心肌细胞的纯化
本实施例的目的为,通过将含有心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清且弱酸性,除去钙和糖类的培养液中进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的血清枯竭、弱酸性pH、低钙、及糖类枯竭产生的复合作用,更具体而言,对从细胞块(类胚体)选择心肌细胞时血清枯竭、弱酸性pH、低钙、及糖类枯竭产生的复合作用进行研究。
对于小鼠胚胎干细胞,用培养液[α-MEM(SIGMA)、10%FBS(EQUITEC BIO)、青霉素和链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块,分化开始5天后,使用其朝含有推定心肌细胞的细胞块(类胚体)分化。在本实施例中,在未观察到自律跳动的分化培养第5天(从第4天至第6天均观察到同样结果),将培养液与在MEM培养液(GIBCO)培养液中添加了胰岛素/转铁蛋白/硒(GIBCO)的培养液进行替换,进一步再培养2天。进一步将得到的推定心肌细胞块再培养2天,分化为心肌细胞。该阶段形成了含有非常高浓度的心肌细胞的细胞块。
然后,为了尽可能除去培养液中的糖类,以D-MEM(无糖)(GIBCO)培养液洗涤4~5次,在加入最终1mM乳酸的D-MEM培养液(GIBCO)中,培养7天(从多次实验中,以目视确认自律跳动的心肌细胞的生存率和其它细胞的生存率,有必要在5~10天的范围内进行调节)。结果如图10所示,形成了作为活细胞的心肌细胞本身构成的心肌细胞块。
使用0.01~0.05%的选择性消化细胞外基质之一的胶原蛋白的胶原蛋白酶,在37℃下对其消化20分钟。在胶原蛋白酶处理过后,使用具有生理渗透压的缓冲液(116mM NaCl,20mM Hepes,12.5mMNaH2PO4,5.6mM葡萄糖,5.4mM KCl,0.8mM MgSO4,pH7.35)进行洗涤。洗涤通过插入具有40μm直径的孔的市售的膜进行溶液交换而进行,合计进行4~5次。结果回收了只由心肌细胞构成的细胞块、及死细胞构成的高密度凝集体(图10A)。图10A的四个角包围的部分的放大照片在图10C中显示。而图10A及图10C的死细胞的位置分别在图10B及图10D中表示。
该图10所示的死细胞的高密度凝集体,已确认可以通过使用适当的密度梯度离心,具体而言为58.5% PercollTM(Pharmacia公司)的密度梯度离心,选择性的去除(图11)。然后培养该结果获得的细胞块,使用作为心肌细胞指标的抗肌节-肌动蛋白抗体和抗GATA4抗体(Santacruz公司)进行免疫染色。图12A表示结合的心肌细胞块。结合的细胞块周围有点状的悬浮的死细胞,但并不存在结合的非心肌细胞。图12B以肌节-肌动蛋白(红,细胞质)和DAPI(Molecular Probe公司)(青,核)对图12A进行免疫染色的结果。图12C为以GATA4(红,核)DAPI(青,核)对图12A进行免疫染色。共染色的核为紫色。结果表明,以本发明的方法纯化的心肌细胞块含有99.0%的心肌细胞(图12C)。
实施例9:在无血清/弱酸性/低钙/无糖,且添加天门冬氨酸、谷
氨酸的培养条件下的心肌细胞的纯化
本实施例的目的为,通过将含有心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清且弱酸性,除去钙和糖类的培养液中添加天门冬氨酸/谷氨酸后进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的天门冬氨酸、谷氨酸产生的代偿性作用,更具体而言,对从细胞块(类胚体)选择心肌细胞时天门冬氨酸、谷氨酸产生的代偿性作用进行研究。
对于小鼠胚胎干细胞,用培养液[α-MEM(SIGMA)、10%FBS(EQUITEC BIO)、青霉素和链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块,分化开始5天后,使用其朝含有推定心肌细胞的细胞块(类胚体)分化。在本实施例中,在未观察到自律跳动的分化培养第5天(从第4天至第6天均观察到同样结果),从培养液中除去血清,在弱酸性pH低钙环境下培养3天。此阶段形成含有浓度非常高的心肌细胞的细胞块。以D-MEM培养液(无糖)(GIBCO)洗涤4~5次,将培养液中的糖类尽可能的除去。洗涤通过插入具有40μm直径的孔的市售的膜进行溶液交换而进行。最终,对于DMEM培养液(无糖),加入谷氨酸(SIGMA)20mg/L及天门冬氨酸(SIGMA)20mg/L,培养5天(从多次实验观察,以目视确认发生自律跳动的心肌细胞的生存率及其它细胞的生存率,有必要在3~10天的范围内进行调节)。结果形成了只含有心肌细胞的心肌细胞块。采用选择性消化作为细胞外基质之一的胶原蛋白的0.03%胶原蛋白酶,在37℃温浴下对该细胞块振荡消化20分钟。胶原蛋白酶处理过后,以具有生理渗透压的任意缓冲液(116mM NaCl、20mM Hepes、12.5mM NaH2PO4、5.6mM葡萄糖、5.4mM KCl、0.8mM MgSO4、pH7.35)进行洗涤。洗涤通过插入具有40μm直径的孔的市售的膜进行溶液交换,合计进行4~5次。结果回收只含有心肌细胞的细胞块。培养得到的细胞块,使用作为心肌细胞指标的抗肌节-肌动蛋白抗体和抗GATA4抗体进行免疫染色反应(图13)。
另外,对细胞进行统计学处理,与已知的数据进行对比(图13)。图13A显示发生自律性搏动的心肌细胞集落的显微镜图像,图13B显示发生自律性搏动的心肌细胞集落的肌节-肌动蛋白染色(红,细胞质)和GATA4染色(绿,核)、DAPI染色(青,核)。
该结果显示,本方法纯化的心肌细胞块含有99.8%的心肌细胞。很明显,该纯化率与已知的心肌细胞纯化方法(例如FASEB J.2000;14:2540-2548;J Clin Invest.1996;98:216-224;FASEB J.2003;17:740-742;J Mol Cell Cardiol.2003;35:1461-1472)所得到的任何一个纯化结果都要高,而且本发明的方法不仅可实现高度纯化,还可实现高收率(表1)。
表1:与αMHC-启动子/neo法的纯度及收率的比较
Field et al.(J Clin Invest.1996;Vol.98:216-224)
实施例10:由小鼠骨髓来源成体干细胞制备的心肌细胞的纯化
本实施例的目的为从被称为间叶干细胞的小鼠骨髓来源的成体干细胞制备心肌细胞,并进行选择、纯化。
从小鼠骨髓来源成体干细胞(雌性C3H/He小鼠)分化的心肌细胞,使用国际公开WO01/048151记载的细胞及方法进行诱导。即,在IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(GIBCO)中添加20%胎牛血清调整的培养基中培养CMG细胞(CMG细胞的建立方法参照J.Clin.Invest.,March 1999,Vol.103,p697-705),经24小时添加终浓度为3μ mol/l的5-氮杂胞苷(SIGMA),以不含5-氮杂胞苷的上述培养液培养2~3周诱导分化心肌细胞。在确认自律跳动心肌细胞后,从培养环境中除去血清,在弱酸性pH、低钙、无糖,且添加了1mM乳酸的D-MEM培养液(GIBCO)中培养5天。除去培养后的死细胞,对残留的活细胞,采用作为心肌细胞指标的抗肌节-肌动蛋白抗体进行免疫染色处理。
图14A表示选择前的培养细胞的样子。含有跳动细胞的区域以虚线图示。图14B~C表示选择后的细胞。图14B表示相差显微镜图像,而图14C表示与图14B同视野的肌节-肌动蛋白荧光染色图像。该结果表明本方法制备的细胞中约90%为心肌细胞(图14)。
实施例11:小鼠胚胎来源的心肌细胞的纯化
本实施例的目的为,从小鼠胚胎中纯化心肌细胞。
首先,从胎生7~9天的小鼠胚胎从母体子宫中取出,小心的与胚胎外组织分离以后,以移液管分散为零散的细胞块。将上述获得的细胞块在无血清/弱酸性pH/低钙/无糖,且添加了0.5mM乳酸的培养液中培养5天(从多次实验观察,以目视确认发生自律跳动的心肌细胞的生存率及其它细胞的生存率,有必要在3~10天的范围内进行调节)。该培养液以Hank氏BSS[无糖]:RPMI[无糖]=9:1混合制得。如上所述对纯化细胞进行附着培养,培养后除去死细胞,对残留的活细胞进行作为心肌细胞的指标的肌节-肌动蛋白荧光免疫染色(绿色,细胞质)、及DAPI染色(红色,核)。
图15A表示对2个不同的集落,跳动心肌细胞群的相差显微镜图像。图15B表示对4个不同的集落,肌节-肌动蛋白和DAPI染色重合的图像。结果表明,本方法制备的细胞中约99%为心肌细胞(图15)。
实施例12:在无血清/弱酸性/低钙/无糖,且添加丙酮酸的培养 条件下的心肌细胞的纯化
本实施例的目的为,通过将含有心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清且弱酸性,除去钙和糖类的培养液中添加丙酮酸后进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的丙酮酸产生的代偿性作用,更具体而言,对从细胞块(类胚体)选择心肌细胞时丙酮酸产生的代偿性作用进行研究。
对于小鼠胚胎干细胞,用培养液[α-MEM(SIGMA)、10%FBS(EQUITEC BIO)、青霉素和链霉素(GIBCO)],每EB75个ES细胞通过悬滴法制成细胞块,分化开始5天后,使用其朝含有推定心肌细胞的细胞块(类胚体)分化。在本实施例中,在未观察到自律跳动的分化培养第5天(从第4天至第6天均观察到同样结果),将培养液与在无血清的MEM(GIBCO)培养液中添加了胰岛素、转铁蛋白、硒(GIBCO)的培养液进行替换,进一步再培养2天。进一步对得到的推定心肌细胞块培养2天,分化为心肌细胞。此阶段形成含有浓度非常高的心肌细胞的细胞块。以D-MEM培养液(无糖)(GIBCO)洗涤4~5次,将培养液中的糖类尽可能的除去。洗涤通过插入具有40μm直径的孔的市售的膜进行溶液交换而进行。洗净后,对于D-MEM培养液(无糖)(GIBCO)加入最终浓度为1mM的丙酮酸,培养5天。
然后,采用选择性消化作为细胞外基质之一的胶原蛋白的0.05%胶原蛋白酶Type3(Worthington Biochemical Corp),在37℃下振荡消化20分钟。胶原蛋白酶处理过后,以具有生理渗透压的缓冲液(116mM NaCl、20mM Hepes、12.5mM NaH2PO4、5.6mM葡萄糖、5.4mMKCl、0.8mM MgSO4、pH7.35)进行洗涤。该结果显示,本方法纯化的心肌细胞块含有9成以上的自律跳动的心肌细胞(图16)。
实施例13:无糖/无血清并添加乳酸的培养条件下绒猴胚胎干细
胞来源的心肌细胞的选择和制备
本实施例的目的为,通过将含有灵长类绒猴的胚胎干细胞来源的心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清和糖类的培养液中进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的血清枯竭和糖类枯竭产生的复合作用,更具体而言,对灵长类绒猴的胚胎干细胞来源的细胞块(类胚体)选择心肌细胞时血清枯竭和糖类枯竭产生的复合作用进行研究。
绒猴胚胎干细胞由财团法人·实验动物中央研究所处获得。使用通过丝裂霉素C去增殖活性化的小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblast;MEF),对该绒猴胚胎干细胞进行未分化维持培养。使用培养液[KO-DMEM(GIBCO)、20%KO-SERUM(GIBCO)、1.6mML-谷氨酸、0.1mM非必需氨基酸(MEM)、0.2mMβ-巯基乙醇(2-ME,SIGMA)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、及8ng/ml重组白血病抑制因子(LIF;Chemicon)、重组人碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF;Peprotech)]。在培养继续时,使用0.1%III型胶原蛋白酶(Wortington),在37℃10分钟条件下分离ES集落。
然后,为了分离MEF和ES,获取通过了孔径为100μm的筛的滤液,将该滤液过孔径为40μm的筛,获得未通过筛的细胞块。该细胞块即为纯粹的ES细胞块。在分化时,每EB50~1000个ES细胞块通过细菌碟法培养类胚体合计15~30天,使其分化为含有心肌细胞的类胚体。从此时使用的培养液为,本实施例前面所述的培养液中除去bFGF的培养液[KO-DMEM(GIBCO)、20%KO-SERUM(GIBCO)、1.6mML-谷氨酸、0.1mM非必需氨基酸(MEM)、0.2mMβ-巯基乙醇(2-ME,SIGMA)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、及8ng/ml重组白血病抑制因子(LIF;Chemicon)]。
为了尽可能的除去培养液中的糖类,将类胚体移至离心沉降管,以D-MEM培养液(无糖)(GIBCO)洗涤5次,在加入乳酸最终浓度为1mM的D-MEM培养液(无糖)(GIBCO)中培养15天。生物体内的乳酸浓度在生理条件下上升至4mM左右,因此该乳酸浓度有必要在生理条件下的浓度至该浓度范围内进行调节。
15天培养后的细胞块的状态如图17所示。结果为,如图17所示由作为活细胞的心肌细胞构成的气泡状细胞结构。即,图17A~C表示在无糖+1mM乳糖的培养液中选择性生存的构成气泡状的心肌细胞。图17A中透光性非常低的部分、或类胚体本身,已经发生了选择性的细胞凋亡。另外,图17B及图17B’所示的类胚体中,类胚体表面的泡状细胞得以生存。图17C表示图17B进一步扩大的图像。
与此相对,加入等量上述培养液(不含bFGF)进行3~7天培养。在生存的心肌细胞再次开始自律跳动,并稳定化时,进行强制性搅拌,同时使用0.1%III型胶原蛋白(Wortington)在37℃下处理10分钟,使活细胞与死细胞分离。使细胞通过实施例8中记载的方法除去。使其附着于被纤维连接蛋白(Sigma)包裹的培养皿中(图18左)。以4%多聚甲醛固定后,以实施例8同样的抗肌动蛋白抗体(Sigma)、及与实施例4同样的抗Nkx2.5抗体(Santacruz)进行免疫染色(分别于图18中表示)。
该结果表明,通过将绒猴胚胎干细胞,在除去血清和糖类并添加丙酮酸的条件下进行培养对细胞进行纯化,可选择性的获得心肌细胞。
实施例14:灵长类绒猴胚胎干细胞来源的心肌细胞对免疫缺陷的
小鼠心脏的移植和生长的确认
本实施例的目的为,对作为灵长类绒猴胚胎干细胞来源的心肌细胞的利用方法的心脏移植和生长进行相关研究。
在具有29刻度的注射管的注射器(Terumo)中,将实施例13中制作的绒猴纯化心肌细胞,混悬于具有生理渗透压的缓冲液(116mMNaCl、20mM Hepes、12.5mM NaH2PO4、5.6mM葡萄糖、5.4mM KCl、0.8mM MgSO4、pH7.35)中使其达到0.2%III型胶原蛋白酶(Wortington)、0.125%胰蛋白酶(GIBCO)的溶液,在37℃下搅拌处理20分钟。通过上述操作制备1~30个左右的心肌细胞构成的小细胞块用于移植。吸取100μl含有上述细胞块的生理盐浓度的上述缓冲液。
使用异氟醚(Abbott)对作为免疫缺陷小鼠的7周龄雄性NOD-SCID(Clea)进行吸入麻醉。然后,通过气管内插管在人工呼吸下进行开胸。使注射针从露出的心脏的心前部向心基部插入至心壁内,一个地方注入30μl左右。闭胸,使其脱离麻醉后继续饲养。
移植后第15天,在麻醉下摘取心脏,以4%多聚甲醛固定组织。制备厚10μm的冷冻切片,可以使用以下任一种方法进行免疫染色:使用山羊抗Nkx2.5抗体(Santacruz)作为第一抗体,使用驴抗山羊抗体-Alexa 488(发绿色)(Molecular Probes)作为第二抗体进行免疫染色(图19B);或使用小鼠抗肌节-肌动蛋白抗体(SIGMA)作为第一抗体,兔抗小鼠抗体Alexa 594(发红色)(Molecular Probes)作为第二抗体进行免疫染色(图19D)。
另一方面,使用小鼠抗人核抗原抗体(与灵长类所有核抗原反应)(Chemicon)和山羊抗小鼠抗体Alexa 633(Molecular Probes)在试验管内反应,形成复合体。继续使用正常小鼠血清抑制剩余的山羊抗小鼠抗体Alexa 633(红外)的反应性。通过该操作使制备的抗体复合体与上述切片相反应,合计进行3个颜色的染色(图19B~19D)。
任一个染色均使用共聚焦显微镜(Carl Zeiss)进行图像化。结果在图19中显示。
该结果表明,具有图中大核的细胞来源于绒猴。即,在该图中,表达作为心肌标记的Nkx2.5的灵长类细胞,在通过肌动蛋白染色的心肌细胞中出现。这意味着确认了绒猴ES细胞来源的心肌细胞在小鼠心脏内生长着。
实施例15:无糖/无血清并添加乳酸的培养条件下人胚胎干细胞
来源的心肌细胞的选择和心肌细胞的制备
本实施例的目的为,通过将含有人的胚胎干细胞来源的心肌细胞的细胞块(类胚体),在除去血清和糖类的培养液中进行培养,对含有心肌细胞的细胞块(类胚体)的血清枯竭和糖类枯竭产生的复合作用,更具体而言,对从人的胚胎干细胞来源的细胞块(类胚体)选择心肌细胞时血清枯竭和糖类枯竭产生的复合作用进行研究。
人胚胎干细胞由国立大学法人·京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心(通过National Bio-resource Project的ES细胞中心)处获得。使用通过丝裂霉素C去增殖活性化的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast;MEF),对该人胚胎干细胞进行未分化维持培养。使用培养液[F12/DMEM(1:1)(SIGMA,产品编号D6421)、20%KO-SERUM(GIBCO)、1.6mML-谷氨酸、0.1mM非必需氨基酸(MEM)、0.1mMβ-巯基乙醇(2-ME,SIGMA)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、及重组人碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF;Peprotech)]。在培养继续时,使用0.1%III型胶原蛋白酶(Wortington),在37℃10分钟条件下分离ES集落。
然后,为了分离MEF和ES,获得未通过孔径40μm筛的细胞块。该细胞块即为纯粹的ES细胞块。在分化时,每EB50~1000个ES细胞块通过细菌碟法培养类胚体合计15~30天(使用上述培养液,只是不含有bFGF),使其分化为含有心肌细胞的类胚体。为了尽可能的除去培养液中的糖类,将类胚体移至离心沉降管,以D-MEM培养液(无糖)(GIBCO,产品编号11966)洗涤5次,在加入乳酸最终浓度为1mM的D-MEM培养液(无糖)(GIBCO,产品编号11966)中培养15天。生物体内的乳酸浓度在生理条件下上升至4mM左右,因此该乳酸浓度有必要在生理条件下的浓度至该浓度范围内进行调节。
在糖存在条件下培养的细胞块(对照条件)和上述无糖条件下进行15天心肌细胞选择培养的细胞块(心肌选择条件)的状态,在作为相差图像的图20的左侧显示。为显示上述细胞的生死,通过检测作为生存指标的膜电位并发出荧光的TMRM(Molecular Probes公司)进行染色,分别表示于图20右侧。该结果,如图20上方所示,在有糖(对照)条件群中所有的类胚体都具有荧光(即所有的类胚体由活细胞构成),如图20下方所示,在无糖(心肌选择)条件下进行培养,出现了不显示荧光的细胞块(即,由死细胞构成的细胞块)。而且,在无糖(心肌选择)条件下生存的细胞块全都发生自律性跳动。
与此相对,加入等量上述培养液(不含bFGF)进行3~7天培养。在生存的心肌细胞再次开始自律跳动,并稳定化时,进行强制性搅拌,同时使用0.1%III型胶原蛋白(Wortington)在37℃下处理10分钟,使活细胞与死细胞分离。使细胞通过实施例8中记载的方法除去。使其附着于被纤维连接蛋白(Sigma)包裹的培养皿中。
以4%多聚甲醛固定后,以实施例8同样的抗肌动蛋白抗体(Sigma)、及与实施例4同样的抗Nkx2.5抗体(Santacruz)进行免疫染色,各细胞的染色图像在图21中显示。如该图中所示,以DAPI染色的核(图21a),与通过心肌标记的抗Nkx2.5抗体进行免疫染色的细胞核(图21c)完全重叠。而作为另外的心肌标记的抗肌动蛋白抗体的免疫染色图像(图21d)和通过抗Nkx2.5抗体的免疫染色图像重合时,证明以抗Nkx2.5抗体免疫染色的细胞和以抗肌动蛋白免疫染色的细胞完全重合(图21e)。
该结果表明,通过将人胚胎干细胞,在无糖无血清并添加乳酸的条件下进行培养对细胞进行纯化,可选择性的获得心肌细胞。