CN103382456B - 一种生殖细胞的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种生殖细胞的诱导方法，它是利用卵泡液诱导羊水细胞或皮肤细胞分化获得生殖细胞。本发明还提供卵泡液在诱导羊水细胞或皮肤细胞分化获得生殖细胞中的应用。本发明优点在于：采用羊水细胞和皮肤细胞作为种子细胞诱导分化获得生殖细胞，属废物利用，原材料廉价，不涉及伦理问题；利用人卵泡液诱导羊水细胞以及人皮肤细胞向生殖细胞诱导分化，方法简单、廉价，且诱导效果好，与现有生殖细胞分化因子相当，从而为卵巢早衰等不孕不育再生医学的生殖细胞研究创立了一个新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种生殖细胞的诱导方法。
背景技术
卵巢早衰是指女性在40岁以前出现闭经、不育，雌激素水平低下，促性腺激素浓度过高为特征的一种疾病。小于40岁发病的占妇女总人数的1%-2%，小于30岁发病的约0.1%，是女性不孕不育的常见病因之一。卵巢功能的提早衰竭，使患者过早地丧失生育能力，雌激素水平的下降，导致骨质疏松，心血管疾病风险增加，严重影响患者的身心健康和家庭稳定。
干细胞研究的进展为再生医学的发展提供了广阔的空间。干细胞是一群具有自我更新能力，在体内外具有向各个胚层细胞分化潜能的细胞。近年来许多科学家开始进行干细胞向生殖细胞分化的研究。其中研究较多的为胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESC），胚胎干细胞是一种具有发育全能性的细胞系，理论上能分化成机体的各种组织细胞，包括生殖细胞。Nicholas等发明一种生殖细胞诱导液，含有BMP4、视黄酸RA、细胞色素P450、CYP26抑制剂、干细胞因子SCF、bFGF等细胞因子，能将小鼠胚胎干细胞在体外诱导为未成熟的卵细胞，进一步可以在小鼠卵巢中发育为成熟卵泡。Clark等研究发现人胚胎干细胞在体外培养形成类胚体时能自发表达生殖细胞分子标记，如DAZL、BOL、SCP1、SCP3、GDF9等；该研究小组又将携带GFP的VASA报告基因转入人胚胎干细胞中，同时加入BMP4进行诱导，发现可以促进人胚胎干细胞向初级卵母细胞及精子细胞发育。还有报道采用失活的猪卵巢成纤维细胞与人胚胎干细胞共培养促进人胚胎干细胞向生殖细胞的分化。然而胚胎干细胞需要破坏人体胚胎，具有伦理缺陷，为解决这一问题，科学家们尝试采用其他成体细胞进行生殖细胞分化。
羊水是指受精卵着床后至胎盘发育完成时，由羊膜包裹着的羊膜腔内液体。近年来研究发现羊水细胞可能是非常原始的细胞群，比成体干细胞具有更广泛的自我更新和多向分化的能力。羊水细胞包括以下3类细胞：（1）上皮类，主要来自胎儿皮肤及尿液中的脱落细胞，培养中出现较早，但随后数量减少； （2）羊水特异细胞，能产生雌激素及绒毛膜促性腺激素，推测来自胎膜及滋养细胞；（3）成纤维细胞类，出现较晚，不产生激素，可能起源于间充质。
羊水细胞基因表达谱和人胚胎干细胞非常相似，它可表达多种干细胞标志基因，其中尤为突出的是Oct-4、Nanog、SSEA-4等胚胎特异性基因。Oct-4、Nanog是维持干细胞分化潜能的主要转录因子，干细胞分化后这些基因表达立即下调或消失。阶段特异抗原SSEA-3 /SSEA-4 抗原来自移植前胚胎及人类胚胎癌细胞，是葡萄糖酯类的抗原决定簇。因此，羊水细胞具有干细胞特征。De Coppi等研究发现，羊水干细胞体外增殖迅速，可在倍增250个周期后仍保持较长的端粒酶和正常核型，在体外经诱导可分化为全部3个胚层组织，包括肝细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成骨细胞、平滑肌细胞等。Schmidt等利用羊水干细胞体外构建人工心脏瓣膜，该瓣膜具有内皮化及开闭的功能。上述研究提示羊水细胞可能具有向生殖细胞分化的潜能。而我们知道，羊水细胞培养进行胎儿染色体核型分析是孕中期羊水穿刺常规产前诊断项目，在染色体检查后剩余羊水作为医疗垃圾被废弃，因此利用羊水细胞作为种子细胞诱导分化获得生殖细胞将具有廉价、废物利用、无伦理问题等一系列优点。同样的，以人皮肤细胞为种子细胞诱导获得生殖细胞也同时具备上述优点。但是目前尚未有羊水细胞、人皮肤细胞向生殖细胞分化的报道。
另外，诱导种子细胞向生殖细胞分化需要使用生殖细胞分化因子，目前使用的生殖细胞分化因子价格昂贵，给患者造成极大的经济负担。因此，寻找廉价有效的诱导剂也是十分必要的。而目前尚无利用人卵泡液诱导获得生殖细胞的可行性报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种廉价、有效、无伦理问题生殖细胞的诱导方法。
本发明的再一的目的是，提供一种卵泡液的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种生殖细胞的诱导方法，它是利用卵泡液诱导羊水细胞或皮肤细胞分化为生殖细胞。
所述的羊水细胞经分离和培养为类胚体后再诱导分化为生殖细胞。
所述的羊水细胞是按照下述方法分离和培养的：采集羊水标本，获取羊水细胞进行原代培养，原代培养5d后第一次换液，至细胞生长至90%密度后传代，挑取羊水细胞克隆，用类胚体培养液重悬，调整细胞密度为1×104/ml，培养1d后摇动培养皿，隔日换液。
所述的皮肤细胞取材于再次剖宫产或进行妇科手术的患者老疤。
所述的皮肤细胞是经过下述方法处理后再被诱导分化为生殖细胞的：取皮肤细胞标本，PBS冲洗除去血细胞，以终浓度0.2 U/ml 胶原酶I、100 U/ml 透明质酸酶进行消化，37℃消化30 min，吹打， 100目筛子过滤，1500 rpm离心，弃上清，以1×104/cm2接种在培养皿，无血清悬浮培养2-3d。
所述的卵泡液中卵泡液原液和标准EB培养基的体积比为1∶20。
所述的卵泡液原液是经以下方法获得的：收集卵泡液标本，混匀，室温下4 000 r/min离心5 min，取上清，0.22μm过滤。
所述的卵泡液诱导羊水细胞或皮肤细胞分化为生殖细胞的诱导时间为1-2周。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
卵泡液在诱导羊水细胞或皮肤细胞分化获得生殖细胞中的应用。
本发明优点在于：
1、采用羊水细胞和皮肤细胞作为种子细胞，诱导分化获得生殖细胞，属废物利用，原材料廉价，无伦理问题；
2、利用人卵泡液诱导羊水干细胞以及人皮肤细胞向生殖细胞诱导分化，方法简单、廉价，且诱导效果好，与现有生殖细胞分化因子相当；
3、本发明为卵巢早衰等不孕不育再生医学的生殖细胞研究创立了一个新的方法。
附图说明
附图1是羊水细胞中干细胞以及生殖细胞表达情况。I. 定量PCR显示羊水细胞中干细胞因子表达情况，以18SNA为对照，并计算相对CT值（18S=100%），实验重复3次。II. 羊水细胞干细胞及生殖细胞因子免疫荧光表达，其中Oct4与ZPC表达。刻度尺，50μm。
附图2A、2B、2C都是羊水克隆细胞图。
附图2D1是流式细胞仪检测结果图一。
附图2D2是流式细胞仪检测结果图二。
附图3A提示EB未添加任何诱导剂，自行分化1-2周后干细胞及生殖细胞分子标记的变化。
附图3B提示EB经过FAC诱导1-2周后干细胞及生殖细胞分子标记的变化。
附图3C提示EB经过5%人卵泡液诱导1-2周后干细胞及生殖细胞分子标记的变化。
附图4提示免疫荧光标记显示羊水克隆细胞形成类胚体EB后，FAC诱导液与卵泡液都能有效地对其向生殖细胞诱导。其中，A提示EB未添加任何诱导剂，自行分化1-2周后干细胞及生殖细胞分子标记的表达；B提示EB经过FAC诱导1-2周后表达生殖细胞分子标记；C提示EB经过5%人卵泡液诱导1-2周后表达生殖细胞分子标记。
附图5提示人皮肤细胞悬浮培养后经5%卵泡液诱导形成卵泡样结构（A-C），并表达生殖细胞标记（D）。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、材料与方法
1、人羊水细胞的分离与培养
采集羊水标本，羊水标本移入15 mL离心管，室温下1000 r/min离心5 min，弃去大部分上清，将剩余的少许上清与细胞沉淀混合后收集到一支15 mL离心管内，过滤细胞沉淀，再在室温下1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入培养液（含DMEM/F12， Knockout血清， β-巯基乙醇，非必需氨基酸， Gluta-MAX，bFGF，青霉素/链霉素）后，置于预先0.2%明胶铺被的培养皿中进行原代培养，5 d后第1次换液，换液后每天观察细胞克隆生长贴壁状况，至细胞生长至90%密度后传代。
2、人卵泡液的收集
因男性不育行IVF-ET术中取卵时，收集卵泡液6份，混匀，在室温下4 000 r/min离心5 min，取上清，0.22μm过滤后获得卵泡液原液，分装、冻存。
3、生殖细胞分化实验
羊水克隆直接采用机械法挑取后，用类胚体培养液重悬，调整细胞密度为 1×104/ml，悬浮培养在无滋养层的35 mm半径的细菌培养皿中，内含75% KnockoutDMEM、5 % 脐血清、2 mmol/l L2谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/l β 2巯基乙醇，置37 ℃，5% CO2饱和湿度条件下培养。第2天摇动培养皿，防止形成的类胚体贴壁，隔日换液。加入FAC生殖细胞分化因子混合液（标准EB培养基，添加human SCF 100 ng/ml，SDF1 20 ng/ml，bFGF 20 ng/ml，BMP4 50 ng/ml (all R&D Systems)，N-acetylcysteine 1 mg/ml，Forskolin5 mM，retinoic acid 1 mM (all Sigma) and CYP26 inhibitor R115866 1 mM (Johnson & Johnson)）或5%人卵泡液（即5ml 卵泡液添加至95ml基础培养基中）进行诱导1-2周。
4、人皮肤细胞培养
取再次剖宫产或进行妇科手术的患者老疤，PBS冲洗除去血细胞，以终浓度0.2 U/ml 胶原酶I、100 U/ml 透明质酸酶进行消化，37℃消化30 min，吹打，终止消化，100目筛子过滤，1500 rpm离心，弃上清，以1×104/cm2接种在3.5cm细菌培养皿，无血清悬浮培养。2-3d后，加入5%人卵泡液进行1-2周诱导。
5、收集贴壁或悬浮培养的细胞，采用Real-time PCR、流式细胞仪或免疫荧光进行检测生殖细胞标记。
6、所有人体标本的采集均获得本院伦理委员会同意，并获患者知情同意。
二、结果
1、羊水细胞表达干细胞标记
将收集的6份羊水分别进行贴壁培养一周，然后收集部分细胞进行PCR检测及免疫英光检测，结果见图1，结果表明羊水细胞表达干细胞分子标记Oct4、Nanog和CD117，不表达HLA-DR以及生殖细胞标记如Blimp1、Stella、DAZL Stra8、SCP1、SCP3，但ZPA、ZPC高表达。
2、羊水克隆细胞富集干细胞标记
在培养羊水细胞过程中，发现有克隆形成，根据样本量不同（3-5ml羊水），可获得10-50个不等的克隆数，每个克隆含有100-200个细胞。通过流式细胞仪检测，检测结果见图2ABC、2D1和图2D2，图中A、B、C显示羊水克隆细胞。图2D表明，与贴壁羊水细胞相比，这些克隆细胞干细胞标记Oct4及CD117的表达皆显著增加，其表达量为7.8%，显著高于贴壁的羊水细胞，其表达量为1.8%（P<0.01）。
3、羊水细胞经诱导后表达生殖细胞分子标记
挑取羊水细胞克隆，进行悬浮培养形成类胚体EB，不添加任何诱导剂，让其自行分化，PCR结果（见图3A）显示Nanog、OCT表达稍下降，Blimp1、Stella和Stra8表达增加，ZPC表达不变，免疫荧光标记显示OCT弱表达，Blimp1、Stella和ZPC表达。而添加FAC诱导液后1-2周后，PCR结果（见图3B）显示Nanog、OCT表达下降，DAZL、Blimp1、Stella、Stra8、VAZA、Scp3、C-mos表达增加，ZPA、ZPC表达不变，免疫荧光标记显示OCT不表达，DAZL、Blimp1、Stella、Scp3和ZPC表达。卵泡液诱导后EB生殖细胞分子表达与之相近，PCR结果（见图3C）显示还表达Scp1及GDF9。以上结果表明羊水克隆细胞形成类胚体EB后，FAC诱导液与卵泡液都能有效地对其向生殖细胞诱导。
免疫荧光标记结果见图4，其中，A提示EB未添加任何诱导剂，自行分化1-2周后干细胞及生殖细胞分子标记的表达；B提示EB经过FAC诱导1-2周后表达生殖细胞分子标记；C提示EB经过5%人卵泡液诱导1-2周后表达生殖细胞分子标记。结果表明，羊水克隆细胞形成类胚体EB后，FAC诱导液与卵泡液都能有效地对其向生殖细胞诱导。
4、人皮肤细胞在卵泡液诱导后形成卵泡样结构，并表达生殖细胞标记
分离人皮肤细胞后，进行悬浮培养，2-3天后添加5%人卵泡液，1周后可发现细胞聚集，并形成卵泡样结构（见图5A、B、C），继续培养1周后，收集这些卵泡样细胞，PCR显示表达干细胞标记Oct4、Nanog以及生殖细胞标记DAZL、Stella、Stra8和Blimp1（见图5D）。
综上所述，通过比较生殖细胞诱导因子以及人卵泡液的诱导作用，结果发现5%的人卵泡液具有与生殖细胞诱导因子相似的作用，能成功地将羊水细胞诱导成生殖细胞；同样，5%的人卵泡液可成功地诱导人皮肤细胞表达生殖细胞分子标记。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种生殖细胞的诱导方法，其特征在于，所述的方法是：将再次剖宫产或进行妇科手术的患者老疤用PBS冲洗除去血细胞，以终浓度0.2 U/ml 胶原酶I、100 U/ml 透明质酸酶进行消化，37℃消化30 min，吹打，终止消化，100目筛子过滤，1500 rpm离心，弃上清，以1×104/cm2接种在培养皿，无血清悬浮培养，2-3d后加入人卵泡液进行1-2周诱导，所述的人卵泡液中卵泡液原液和标准EB培养基的体积比为1∶20，所述的卵泡液原液是经以下方法获得的：收集卵泡液标本，混匀，室温下4 000 r/min离心5 min，取上清，0.22μm过滤。
2.人卵泡液在诱导皮肤细胞分化获得生殖细胞中的应用，其特征在于，所述的皮肤细胞是经过下述方法被诱导分化为生殖细胞的：将再次剖宫产或进行妇科手术的患者老疤用PBS冲洗除去血细胞，以终浓度0.2 U/ml 胶原酶I、100 U/ml 透明质酸酶进行消化，37℃消化30 min，吹打，100目筛子过滤，1500 rpm离心，弃上清，以1×104/cm2接种在培养皿，无血清悬浮培养2-3d，2-3d后加入人卵泡液进行1-2周诱导，所述的人卵泡液中卵泡液原液和标准EB培养基的体积比为1∶20，所述的卵泡液原液是经以下方法获得的：收集卵泡液标本，混匀，室温下4 000 r/min离心5 min，取上清，0.22μm过滤。
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| BMP15 Gene Is Activated During Human Amniotic Fluid Stem Cell Differentiation into Oocyte-Like Cells;Xiang Cheng, et al.;《DNA AND CELL BIOLOGY》;20120222;第31卷(第7期);1198-1204 * |
| 人羊水干细胞诱导为卵母样生殖细胞的研究;陈帅;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20101115(第11期);E059-18 * |
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