CN108913659A - 肌源性干细胞的增殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞增殖技术领域，具体而言，提供了一种肌源性干细胞的增殖方法。本发明提供的肌源性干细胞的增殖方法，在含有卫星细胞的环境中对肌源性干细胞进行增殖培养。该方法中，卫星细胞为贴壁培养细胞，会在培养容器内贴壁生长，肌源性干细胞贴壁能力相较于卫星细胞较弱，肌源性干细胞会聚集于卫星细胞表面进行增殖，并且随着细胞的大量增殖，肌源性干细胞以“沙滩样”外观聚集多层生长，同时细胞间不发生接触抑制。该方法大大的提高了肌源性干细胞的培养数量，培养42天后，肌源性干细胞的细胞数量是现有技术的3倍左右。

Description

肌源性干细胞的增殖方法

技术领域

本发明涉及细胞增殖技术领域，具体而言，涉及一种肌源性干细胞的增殖方法。

背景技术

肌源性干细胞(MDSC)的分离纯化培养方法有差速贴壁(preplating)法、流式细胞分选法(FACS)、磁珠分选法(MACS)、密度梯度离心法等。

FACS与磁珠分选实际上是在差速贴壁的基础上，将细胞培养到一定数量之后，利用细胞表面标记物的不同将具有干性的细胞分选出来单独培养，已取得部分成功。但是，由于肌源性干/祖细胞表面标记物不甚一致，且并没有完全确定，采用这种方法分离出的细胞群会将一些表面不具有标定标记物的细胞排除而将一些亦表达该种标记物的其他类别细胞纳入。依赖标记物表达的分离方法，其缺陷不仅在于MDSC表面标记物的表达随培养条件与培养时间的改变而发生变化，还在于这种方法没有纳入细胞活性、增殖率、以及体内外多向分化潜能等的考虑。在一定程度上不利于MDSC的纯化培养。

密度梯度离心法也为部分研究者采用，主要是运用不同种类的细胞在有一定密度梯度的Percoll溶液中聚集层次不同的特点，取出特定密度层的细胞离心即可得到纯度较高的细胞群。该方法可以有效分离出MDSC，但分离材料特殊，且应用过程中离心法步骤较多，易对培养细胞造成污染是其劣势。

传统差速贴壁法应用最为广泛，它利用了酶消化后的细胞悬液中成纤维样细胞、卫星细胞贴壁较快，而MDSC等细胞贴壁较慢的特点，每隔24h将上清液移入新皿进行贴壁，之后弃去快贴壁细胞(RAC)，保留慢贴壁细胞(SAC)，来达到分离纯化培养MDSC的目的。该方法简便易掌握，可以得到较高纯度的MDSC，然而，差速贴壁法有一主要劣势为最后得到的肌源性干细胞的贴壁细胞量太少，仅有少数MDSC贴壁，贴壁的细胞中又仅有少数可以保持增殖能力，这使得MDSC的大量获取略为困难。并且，由于同类细胞的不同个体贴壁时间有差异，且不同类细胞贴壁时间有部分重合，因此每盘细胞实际上含有其他类别的杂细胞贴壁。

因此，开发一种短时间内可以大量扩增得到高质量高纯度的肌源性干细胞的培养方法，具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肌源性干细胞的增殖方法，以缓解现有技术中肌源性干细胞培养方法获得细胞量少，纯度低，易污染和成本高的技术问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供一种肌源性干细胞的增殖方法，包括在含有卫星细胞的环境中对肌源性干细胞进行增殖培养。

进一步地，所述卫星细胞与所述肌源性干细胞的数量比为0.5-1.5:1；

优选地，所述增殖培养的培养基为肌源性干细胞培养液。

进一步地，将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液，在新的容器中静置培养，再取所述静置培养后的悬浮细胞在新的容器中静置培养，重复培养4-7次后，最后得到的悬浮细胞为所述肌源性干细胞；

优选地，所述重复培养多次的次数优选为4-5次，进一步优选为5次；

优选地，所述静置培养的培养基为肌源性干细胞培养液；

优选地，所述容器可以为旋转式生物培养瓶。

进一步地，将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液，在新的容器中静置培养得到悬浮细胞和贴壁细胞，再取所述静置培养后的悬浮细胞在新的容器中静置培养得到悬浮细胞和贴壁细胞，重复培养4-7次后，第4次静置培养得到的贴壁细胞和/或第5次静置培养得到的贴壁细胞为所述卫星细胞；

优选地，所述重复培养多次的次数优选为4-5次，进一步优选为5次；

优选地，所述静置培养的培养基为肌源性干细胞培养液。

进一步地，所述贴壁细胞用肌源性干细胞培养液进行培养；

进一步地，包括以下步骤：将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液，在成纤维细胞培养液中静置培养，得到第一悬浮细胞和第一贴壁细胞，将第一悬浮细胞在成纤维细胞培养液中静置培养，得到第二悬浮细胞和第二贴壁细胞，将第二悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第三悬浮细胞和第三贴壁细胞，将第三悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第四悬浮细胞和第四贴壁细胞，将第四悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第五悬浮细胞和第五贴壁细胞，将第五悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第六悬浮细胞和第六贴壁细胞；

所述第六悬浮细胞为所述肌源性干细胞；

所述第三贴壁细胞和/或第四贴壁细胞为所述卫星细胞；

在含有卫星细胞的环境中对肌源性干细胞进行增殖培养。

进一步地，将所述卫星细胞消化后重新贴壁培养，再加入纯化的肌源性干细胞进行增殖培养。

进一步地，在进行肌源性干细胞的增殖培养时，所述卫星细胞与所述肌源性干细胞的数量比为0.5-1.5:1；

优选地，所述增殖培养的条件为36-38℃，4-6％CO₂培养箱中静置培养；

优选地，所述增殖培养的容器可以为旋转式生物培养瓶。

进一步地，所述静置培养的时间为22-26h；

优选地，所述静置培养的温度为36-38℃；

优选地，所述培养空气环境为4-6％CO₂。

进一步地，所述第三贴壁细胞和/或第四贴壁细胞用肌源性干细胞培养液进行培养得到所述卫星细胞；

优选地，所述贴壁细胞的培养条件温度为36-38℃；

优选地，所述培养空气环境为4-6％CO₂；

优选地，所述贴壁细胞的培养时间22-26h。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供一种肌源性干细胞的增殖方法，在含有卫星细胞的环境中对肌源性干细胞进行增殖培养。该方法中，卫星细胞为贴壁培养细胞，会在培养容器内贴壁生长，肌源性干细胞贴壁能力相较于卫星细胞较弱，肌源性干细胞会聚集于卫星细胞表面进行增殖，并且随着细胞的大量增殖，肌源性干细胞以“沙滩样”外观聚集多层生长，同时细胞间不发生接触抑制。该方法大大的提高了肌源性干细胞的培养数量，培养42天后，肌源性干细胞的细胞数量是现有技术的3倍左右。该方法成本低，易操作，可以在短时间内大量扩增得到高质量高纯度的肌源性干细胞，培养得到的肌源性干细胞分化能力强，可以用于细胞的后续各项研究与试验。

附图说明

图1A为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养3天后光镜观测照片(放大倍数×40)；

图1B为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养3天后光镜观测照片(放大倍数×100)；

图1C为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养7天后光镜观测照片(放大倍数×40)；

图1D为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养7天后光镜观测照片(放大倍数×100)；

图1E为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养10天后光镜观测照片(放大倍数×40)；

图1F为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养10天后光镜观测照片(放大倍数×100)；

图1G为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养14天后光镜观测照片(放大倍数×40)；

图1H为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养14天后光镜观测照片(放大倍数×100)；

图1I为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养21天后光镜观测照片(放大倍数×40)；

图1J为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养21天后光镜观测照片(放大倍数×100)；

图1K为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养28天后光镜观测照片(放大倍数×40)；

图1L为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养28天后光镜观测照片(放大倍数×100)；

图1M为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养42天后光镜观测照片(放大倍数×40)；

图1N为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养42天后光镜观测照片(放大倍数×100)；

图1O为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞单纯悬浮培养3天后光镜观测照片；

图1P为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞单纯悬浮培养7天后光镜观测照片；

图1Q为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞单纯悬浮培养10天后光镜观测照片；

图1R为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞单纯悬浮培养14天后光镜观测照片；

图1S为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞单纯悬浮培养21天后光镜观测照片；

图1T为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞单纯悬浮培养28天后光镜观测照片；

图1U为本发明实施例4的步骤c中肌源性干细胞单纯悬浮培养42天后光镜观测照片；

图2A为本发明实施例6中实验组共培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(加荧光抗体组与不加荧光抗体组合并)；

图2B为本发明实施例6中实验组共培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(加荧光抗体组)；

图2C为本发明实施例6中实验组共培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(不加荧光抗体组)；

图2D为本发明实施例6中对照组单纯悬浮培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(加荧光抗体组与不加荧光抗体组合并)；

图2E为本发明实施例6中对照组单纯悬浮培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(加荧光抗体组)；

图2F为本发明实施例6中对照组单纯悬浮培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(不加荧光抗体组)；

图3A为本发明实施例10中实验组共培养所得细胞成神经诱导光镜下观；

图3B为本发明实施例10中实验组共培养所得细胞成神经诱导后p75NGF受体免疫荧光染色镜下观；

图3C为本发明实施例10中实验组共培养所得细胞成神经诱导后p75NGF受体免疫荧光染色镜下观(加Dapi核染)；

图3D为本发明实施例10中对照组单纯悬浮培养所得细胞成神经诱导光镜下观；

图3E为本发明实施例10中对照组单纯悬浮培养所得细胞成神经诱导后p75NGF受体免疫荧光染色镜下观；

图3F为本发明实施例10中对照组单纯悬浮培养所得细胞成神经诱导后p75NGF受体免疫荧光染色镜下观(加Dapi核染)；

图4A为本发明实施例11中实验组共培养所得细胞成骨诱导光镜下观；

图4B为本发明实施例11中实验组共培养所得细胞成骨诱导后茜素红染色镜下观；

图4C为本发明实施例11中对照组单纯悬浮培养所得细胞成骨诱导光镜下观；

图4D为本发明实施例11中对照组单纯悬浮培养所得细胞成骨诱导后茜素红染色镜下观

图5为本发明实施例3中分离纯化得到肌源性干细胞和卫星细胞的试验流程示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

本发明提供一种肌源性干细胞的增殖方法，包括在含有卫星细胞的环境中对肌源性干细胞进行增殖培养。

该方法中，卫星细胞为贴壁培养细胞，会在培养容器内贴壁生长，肌源性干细胞贴壁能力相较于卫星细胞较弱，肌源性干细胞会聚集于卫星细胞表面进行增殖，并且随着细胞的大量增殖，肌源性干细胞以“沙滩样”外观聚集多层生长，同时细胞间不发生接触抑制。该方法大大的提高了肌源性干细胞的培养数量，培养42天后，肌源性干细胞的细胞数量是现有技术的3倍左右。该方法成本低，易操作，可以在短时间内大量扩增得到高质量高纯度的肌源性干细胞，培养得到的肌源性干细胞分化能力强，可以用于细胞的后续各项研究与试验。

本发明中卫星细胞指的是肌卫星细胞，是位于肌纤维胞膜与基膜之间的单核细胞，沿肌纤维长轴缠绕其上，可以促进新生个体肌组织正常发育。在成体中，卫星细胞一般处于休眠或静止状态，当运动刺激或者外力损伤时，卫星细胞激活分化成肌管，修复肌纤维。卫星细胞与肌源性干细胞都属于肌肉组织中的细胞，本发明利用细胞与细胞之间、细胞与微环境之间的相互影响关系，通过优化模拟肌源性干细胞的生理存在环境，通过卫星细胞与肌源性干细胞共培养可以加快肌源性干细胞的增殖速率。

肌源性干细胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)，是存在于成体动物肌肉组织中的一种具有自我更新和增殖能力的干细胞群，目前的研究证实其具有多向分化潜能。在正常条件下，其在体内可分化为肌管和肌纤维，从而使注射入骨骼肌或心肌内的移植物保持其长期持久性。肌源性干细胞在特定条件下通过诱导还可分化为内皮细胞、骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和施万细胞等。

在本发明一个优选地实施方式中，卫星细胞与肌源性干细胞的数量比为0.5-1.5:1。卫星细胞与肌源性干细胞的数量比典型但非限制性的为0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1或1.5:1。以卫星细胞全部铺满共培养容器为最优，避免了肌源性干细胞的贴壁，也为肌源性干细胞的增殖提供了更好地生长环境。

在本发明的一些实施方式中，增殖培养的培养基为肌源性干细胞培养液，肌源性干细胞培养液包括：9-11ng/ml b-FGF，19-21ng/ml EGF，9-11ng/ml PDGF，9-11％v/v FBS，9-11％v/v HS，0.4-0.6％v/v CEE，0.9-1.1％v/v双抗和IMDM。

在本发明的一些实施方式中，肌源性干细胞培养液包括：

b-FGF为碱性成纤维细胞生长因子，具有强烈的促细胞分裂增殖活性。b-FGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml或11ng/ml。

EGF为表皮细胞生长因子，可直接促进表皮生长。EGF的浓度典型但非限制性的为19ng/ml、19.5ng/ml、20ng/ml。

PDGF为血小板衍生生长因子，是一种重要的促有丝分裂因子，可以促进细胞增殖。PDGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml。

FBS为胎牛血清，是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无杂质的稍粘稠液体。FBS中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，含有丰富的细胞生长必须的营养成份。v/v表示体积比，FBS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％、10.5％或11％。

HS为马血清，HS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％。

CEE为鸡胚提取物，CEE的体积份数典型但非限制性的为0.4％、0.5％或0.6％。

青霉素/链霉素双抗溶液为含有青霉素和链霉素两种混合抗体的无色透明溶液，可以防止培养液中细菌滋生，利于细胞增殖培养，双抗的体积份数典型但非限制性的为0.9％、1％或1.1％。

IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)为一种完全培养基，含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。可以用于高密度细胞的快速增殖培养。

在本发明的一些实施方式中，增殖培养的条件为36-38℃，静置培养。增殖培养的条件中温度典型但非限制性的为36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的空气条件为4-6％CO₂培养箱中。静置培养的空气条件典型但非限制性的为4％、4.5％、5％、5.5％或6％CO₂。

在本发明一个优选地实施方式中，将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液，在新的容器中静置培养，再取静置培养后的悬浮细胞在新的容器中静置培养，重复培养4-7次后，最后得到的悬浮细胞为肌源性干细胞。

差速贴壁法是将得到的贴壁细胞为目标肌源性干细胞，分离纯化得到的肌源性干细胞细胞数量少，纯培养细胞增殖慢，本发明中将最后的悬浮细胞作为目标肌源性干细胞，将肌源性干细胞与卫星细胞进行共培养，可以快速大量得到肌源性干细胞。

首先，肌肉组织用I型胶原酶、中性蛋白酶、EDTA胰蛋白酶依次消化处理后，再依次以100目、200目、300目细胞筛过滤，接着用成纤维细胞培养液重悬细胞，最后400目细胞筛过滤得到肌肉组织来源细胞悬液，在容器中培养2h完成肌肉组织细胞培养。2h的肌肉组织细胞培养后会有大量的快速贴壁杂细胞—主要为成纤维细胞—贴壁，通过对肌源性细胞的分离培养初步去除大部分的贴壁杂细胞。再取容器中的悬浮细胞悬液在新的容器中静置培养，重复多次，如成纤维细胞和卫星细胞的贴壁速度会比肌源性干细胞的贴壁速度更快，所以前几次的静置培养可以将成纤维细胞等的非目标性细胞去除，随着静置培养的重复次数的增加，分离纯化得到肌源性干细胞。

肌肉组织包括平滑肌、骨骼肌和/或心肌。

在本发明一个优选地实施方式中，重复培养多次的次数优选为4-5次，进一步优选为5次。对重复培养次数进行优化，得到的肌源性干细胞纯度高且数量多。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的时间为22-26h。静置培养的时间典型但非限制性的为22h、23h、24h、25h或26h。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的空气条件为4-6％CO₂。静置培养的空气条件典型但非限制性的为4％、4.5％、5％、5.5％或6％CO₂。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的培养基为肌源性干细胞培养液，肌源性干细胞培养液包括：9-11ng/ml b-FGF，19-21ng/ml EGF，9-11ng/ml PDGF，9-11％v/v FBS，9-11％v/v HS，0.4-0.6％v/v CEE，0.9-1.1％v/v双抗和IMDM。

b-FGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml或11ng/ml；EGF的浓度典型但非限制性的为19ng/ml、19.5ng/ml、20ng/ml、20.5ng/ml或21ng/ml；PDGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml或11ng/ml；v/v表示体积比，FBS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％、10.5％或11％；HS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％、10.5％或11％；CEE的体积份数典型但非限制性的为0.4％、0.5％或0.6％；双抗的体积份数典型但非限制性的为0.9％、1％或1.1％。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的温度为36-38℃。静置培养的温度典型但非限制性的为36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃。

在本发明一个优选地实施方式中，将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液，在新的容器中静置培养得到悬浮细胞和贴壁细胞，再取所述静置培养后的悬浮细胞在新的容器中静置培养得到悬浮细胞和贴壁细胞，重复培养4-7次后，第4次静置培养得到的贴壁细胞和/或第5次静置培养得到的贴壁细胞为所述卫星细胞。

首先肌肉组织用I型胶原酶、中性蛋白酶、EDTA胰蛋白酶依次消化处理后，再依次以100目、200目、300目细胞筛过滤，接着用成纤维细胞培养液重悬细胞，最后400目细胞筛过滤得到肌肉组织细胞悬液，在容器中培养2h完成肌肉组织细胞培养。2h的肌肉组织细胞培养后会有大量的快速贴壁杂细胞—主要为成纤维细胞—贴壁，通过对肌源性细胞的分离培养初步去除大部分的贴壁杂细胞。再取容器中的悬浮细胞悬液在新的容器中静置培养，重复多次，如成纤维细胞的贴壁速度会比卫星细胞与肌源性干细胞的贴壁速度更快，所以前几次的静置培养可以将成纤维细胞等的非目标性细胞去除，随着静置培养的重复次数的增加，分离纯化得到贴壁的卫星细胞和悬浮的肌源性干细胞。

将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液，在新的容器中静置培养，再取静置培养后的悬浮细胞在新的容器中静置培养，如此重复多次，会得到多个带有贴壁细胞的容器，也会得到含有大量肌源性干细胞的悬浮溶液。当培养到悬浮细胞含有大量肌源性干细胞时，将得到的贴壁细胞从后往前倒数第2次静置培养得到的贴壁细胞和倒数第3次静置培养得到的贴壁细胞可单独或共同作为与肌源性干细胞共培养的卫星细胞。

在本发明一个优选地实施方式中，重复培养多次的次数优选为4-5次，进一步优选为5次。对重复培养次数进行优化，得到的卫星细胞纯度高且数量多。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的时间为22-26h。静置培养的时间典型但非限制性的为22h、23h、24h、25h或26h。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的空气条件为4-6％CO₂培养箱中。静置培养的空气条件典型但非限制性的为4％、4.5％、5％、5.5％或6％CO₂。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的培养基为肌源性干细胞培养液，肌源性干细胞培养液包括：9-11ng/ml b-FGF，19-21ng/ml EGF，9-11ng/ml PDGF，9-11％v/v FBS，9-11％v/v HS，0.4-0.6％v/v CEE，0.9-1.1％v/v双抗和IMDM。

b-FGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml或11ng/ml；EGF的浓度典型但非限制性的为19ng/ml、19.5ng/ml、20ng/ml、20.5ng/ml或21ng/ml；PDGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml或11ng/ml；v/v表示体积比，FBS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％、10.5％或11％；HS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％、10.5％或11％；CEE的体积份数典型但非限制性的为0.4％、0.5％或0.6％；双抗的体积份数典型但非限制性的为0.9％、1％或1.1％。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的温度为36-38℃。静置培养的温度典型但非限制性的为36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃。

在本发明一个优选地实施方式中，贴壁细胞用肌源性干细胞培养液进行培养。肌源性干细胞培养液包括：10ng/ml b-FGF，20ng/ml EGF，10ng/ml PDGF，10％v/v FBS，10％v/v HS，0.5％v/v CEE，1.0％v/v青霉素/链霉素双抗溶液和IMDM。

在本发明的一些实施方式中，贴壁细胞的培养条件为36-38℃，4-6％CO₂培养箱中培养22-26h。贴壁细胞的培养条件中温度典型但非限制性的为36℃、37℃或38℃；空气条件典型但非限制性的为含有4％、4.5％、5％、5.5％或6％CO₂；时间典型但非限制性的为22h、23h、24h、25h或26h。

在本发明一个优选地实施方式中，肌源性干细胞的增殖方法包括以下步骤：将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液在成纤维细胞培养液中静置培养，得到第一悬浮细胞和第一贴壁细胞，将第一悬浮细胞在成纤维细胞培养液中静置培养，得到第二悬浮细胞和第二贴壁细胞，将第二悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第三悬浮细胞和第三贴壁细胞，将第三悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第四悬浮细胞和第四贴壁细胞，将第四悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第五悬浮细胞和第五贴壁细胞，将第五悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第六悬浮细胞和第六贴壁细胞，其中，第六悬浮细胞大部分为肌源性干细胞，第三贴壁细胞和/或第四贴壁细胞为卫星细胞；在含有卫星细胞的环境中对肌源性干细胞进行增殖培养。

首先肌肉组织用I型胶原酶、中性蛋白酶、EDTA胰蛋白酶依次消化处理后，再依次以100目、200目、300目细胞筛过滤，接着用肌源性干细胞培养液重悬细胞，最后400目细胞筛过滤得到肌肉组织来源细胞悬液，在容器中培养2h完成肌肉组织细胞培养。最开始的2h的肌肉组织细胞培养，会有大量的快速贴壁杂细胞—主要为成纤维细胞—贴壁，通过对肌源性细胞的分离培养初步去除大部分的贴壁杂细胞。再取容器中的悬浮细胞悬液在新的容器中静置培养，重复多次，如成纤维细胞等杂细胞的贴壁速度会比卫星细胞与肌源性干细胞的贴壁速度更快，而卫星细胞的贴壁速度又比肌源性干细胞快，所以第一贴壁细胞和第二贴壁细胞中主要还是以成纤维细胞为主，随着静置培养的重复次数的增加，杂细胞被大部分去除，第三贴壁细胞和第四贴壁细胞中主要为目标细胞卫星细胞，第五悬浮细胞主要为肌源性干细胞，分离纯化得到卫星细胞和肌源性干细胞。

差速贴壁法是将上述第五悬浮细胞进行静置培养，得到的第六贴壁细胞为目标肌源性干细胞，分离纯化得到的肌源性干细胞细胞数量少，纯培养细胞增殖慢，本发明中将第五悬浮细胞作为目标肌源性干细胞，将肌源性干细胞与第三贴壁细胞和/或第四贴壁细胞进行共培养，可以快速大量得到肌源性干细胞。

在本发明一个有优选地实施方式中，成纤维细胞培养液包括：11.5-13.5ng/ml b-FGF，0.3-0.5ng/ml EGF，19-21ng/ml IGF，19-21％v/v FBS，0.9-1.1％v/v双抗和IMDM。

在本发明一个优选地实施方式中，将卫星细胞培养至贴壁后加入肌源性干细胞进行增殖培养。从肌肉组织中得到的卫星细胞需要重悬混匀，进行计数，在新的容器中重新贴壁，将卫星细胞先进行培养，在容器内壁形成一层细胞层，清洗掉悬浮细胞和杂质，再加入肌源性干细胞进行共培养，有利于肌源性干细胞在卫星细胞表面聚集，形成“沙滩样”向培养液中扩散生长。

在本发明一个优选地实施方式中，在进行肌源性干细胞的增殖培养时，卫星细胞与肌源性干细胞的数量比为0.5-1.5:1。卫星细胞与肌源性干细胞的数量比典型但非限制性的为0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1或1.5:1。

在本发明一个优选地实施方式中，卫星细胞能够80％-100％铺满容器内壁的细胞量为卫星细胞的使用量，卫星细胞贴壁占培养皿底面积的比典型但非限制性的为80％、85％、90％、95％或100％。

在本发明一个优选地实施方式中，增殖培养的培养基为肌源性干细胞培养液，肌源性干细胞培养液包括：9-11ng/ml b-FGF，19-21ng/ml EGF，9-11ng/ml PDGF，9-11％v/vFBS，9-11％v/v HS，0.4-0.6％v/v CEE，0.9-1.1％v/v双抗和IMDM。

b-FGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml或11ng/ml；EGF的浓度典型但非限制性的为19ng/ml、19.5ng/ml、20ng/ml、20.5ng/ml或21ng/ml；PDGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml或11ng/ml；v/v表示体积比，FBS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％、10.5％或11％；HS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％、10.5％或11％；CEE的体积份数典型但非限制性的为0.4％、0.5％或0.6％；双抗的体积份数典型但非限制性的为0.9％、1％或1.1％。

在本发明的一些实施方式中，增殖培养的条件为36-38℃，静置培养。静置培养的温度典型但非限制性的为36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的空气条件为4-6％CO₂培养箱中。静置培养的空气条件典型但非限制性的为4％、4.5％、5％、5.5％或6％CO₂。

在本发明一个优选地实施方式中，静置培养的时间为22-26h。静置培养的时间典型但非限制性的为22h、23h、24h、25h或26h。

在本发明一个优选地实施方式中，静置培养的培养基为肌源性干细胞培养液，肌源性干细胞培养液包括：9-11ng/ml b-FGF，19-21ng/ml EGF，9-11ng/ml PDGF，9-11％v/vFBS，9-11％v/v HS，0.4-0.6％v/v CEE，0.9-1.1％v/v双抗和IMDM。

b-FGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml或11ng/ml；EGF的浓度典型但非限制性的为19ng/ml、19.5ng/ml、20ng/ml、20.5ng/ml或21ng/ml；PDGF的浓度典型但非限制性的为9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、10.5ng/ml或11ng/ml；v/v表示体积比，FBS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％、10.5％或11％；HS的体积份数典型但非限制性的为9％、9.5％、10％、10.5％或11％；CEE的体积份数典型但非限制性的为0.4％、0.5％或0.6％；双抗的体积份数典型但非限制性的为0.9％、1％或1.1％。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的温度为36-38℃。静置培养的温度典型但非限制性的为36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃。

在本发明的一些实施方式中，静置培养的空气条件为5％CO₂培养箱中。静置培养的空气条件典型但非限制性的为5％CO₂。

在本发明一个优选地实施方式中，第三贴壁细胞和/或第四贴壁细胞用肌源性干细胞培养液进行培养得到所述卫星细胞，其中，肌源性干细胞培养液包括：10ng/ml b-FGF，20ng/ml EGF，10ng/ml PDGF，10％v/v FBS，10％v/v HS，0.5％v/v CEE，1.0％v/v青霉素/链霉素双抗溶液和IMDM。用肌源性干细胞培养液对第三贴壁细胞和/或第四贴壁细胞进行培养后作为卫星细胞再与肌源性干细胞共培养可以更好地提高肌源性干细胞的增殖速率。

在本发明的一些实施方式中，贴壁细胞的培养条件为36-38℃，4-6％CO₂培养箱中培养22-26h。贴壁细胞的培养条件中温度典型但非限制性的为36℃、37℃或38℃；空气条件典型但非限制性的为4％、4.5％、5％、5.5％或6％CO₂；时间典型但非限制性的为22h、23h、24h、25h或26h。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例中肌肉组织来源为2周龄C57BL/6乳鼠，体重约5g/每只，性别不限，由中国医学科学院整形外科医院动物中心提供，母乳喂养。

实施例1小鼠骨骼肌组织取材

试验用为2周龄的C57BL/6小鼠。

步骤a)：准备超净台器械材料，器械浸泡于75％酒精中，紫外线照射半小时后通风15min；

步骤b)：将10ml骨骼肌组织培养液置于50ml离心管中待用；

步骤c)：以C0₂窒息法处死小鼠20只，并用眼科镊提小鼠尾巴将其置于75％酒精中浸泡，取浸泡后的小鼠俯置于超净台；

步骤d)：以眼科镊沿小鼠后肢纵轴夹持，眼科剪剪开小鼠尾根部皮肤，自此处将皮肤脱套样分离，眼科剪仔细剪除肌肉周围脂肪组织，注意分离神经血管；

步骤e)：剪取小鼠四肢骨骼肌；

步骤f)：以眼科剪沿肌肉长轴将肌肉组织纵向剪碎，将得到的切碎肌肉组织置于50ml离心管所盛培养液中；

步骤g)：以此方法继续处理另外19只小鼠，共得到约12.5ml肌肉组织。

实施例2骨骼肌组织的酶消化与细胞提取

步骤a)：将盛有骨骼肌组织的离心管无菌封闭后转移至细胞实验室；

步骤b)：将离心管置于离心机中1000rpm/5min离心，吸除上清液，加入0.2％I型胶原酶溶液5ml，以达到0.1％I型胶原酶溶液的工作浓度，置于37℃摇床中，100rpm震荡消化1-2h，期间观察组织消化状况；

步骤c)：1000rpm/5min离心，吸除上清液，加入2.4units/ml中性蛋白酶溶液5ml，调节至1.2units/ml中性蛋白酶溶液工作浓度，移液管吹打分散沉淀，置于37℃摇床中100rpm震荡消化45min，期间观察组织消化状况；

步骤d)：1000rpm/5min离心，吸除上清液，加入0.25％EDTA胰蛋白酶溶液4ml，IMDM1ml，调节至EDTA胰蛋白酶工作浓度0.1％，移液管吹打分散沉淀，置于37℃摇床中100rpm震荡消化25min，期间观察组织消化状况；

步骤e)：1000rpm/5min离心，吸除上清液，加入PBS溶液10ml，移液管吹打分散沉淀，依次以100目、200目、300目细胞筛过滤，所得细胞悬液移至新50ml离心管中；

步骤f)：1000rpm/5min离心，吸除上清液，加入7ml成纤维细胞培养液(FbCM：b-FGF12.5ng/ml，EGF 0.4ng/ml，IGF 20ng/ml，20％FBS，1％双抗，IMDM)，移液管吹打重悬，400目细胞筛过滤。

实施例3肌源性干细胞和卫星细胞的分离

本实施例中肌源性干细胞和卫星细胞的分离试验流程示意图如图5所示。具体步骤如下：

步骤a)：将实施例2的步骤f中所得细胞悬液置于100mm细胞培养皿中，放入37℃恒温培养箱；

步骤b)：2h后收集悬浮细胞，1000rpm/5min离心，吸除上清液，加入成纤维细胞培养液(FbCM：b-FGF 12.5ng/ml，EGF 0.4ng/ml，IGF 20ng/ml，20％FBS，1％双抗，IMDM)8ml，移液管轻轻吹打重悬，接种至新皿中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱，得到第一悬浮细胞和第一贴壁细胞；

步骤c)：将第一悬浮细胞1000rpm/5min离心，吸除上清液，加入肌源性干细胞培养液(MDCM：b-FGF 10ng/ml，EGF 20ng/ml，PDGF 10ng/ml，10％FBS，10％HS，0.5％CEE，1％双抗，IMDM)8ml，移液管轻轻吹打重悬，接种至新皿中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱，得到第二悬浮细胞和第二贴壁细胞；

步骤d)：将第二悬浮细胞移入50ml离心管中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱静置30min，吸除表层上清液2ml，加入肌源性干细胞培养液3ml，接种至新皿中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱，得到第三悬浮细胞和第三贴壁细胞；

步骤e)：将第三悬浮细胞移入50ml离心管中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱静置30min，吸除表层上清液2ml，加入肌源性干细胞培养液3ml，接种至新皿中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱，得到第四悬浮细胞和第四贴壁细胞；

步骤f)：将第四悬浮细胞移入50ml离心管中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱静置30min，吸除表层上清液2ml，加入肌源性干细胞培养液3ml，接种至新皿中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱，得到第五悬浮细胞和第五贴壁细胞；

步骤g)：将第五悬浮细胞移入50ml离心管中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱静置30min，吸除表层上清液2ml，加入肌源性干细胞培养液3ml，接种至新皿中，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱，得到第六悬浮细胞和第六贴壁细胞；

步骤h)：将步骤b)-步骤g)中的第一贴壁细胞加入成纤维细胞培养液(FbCM：b-FGF12.5ng/ml，EGF 0.4ng/ml，IGF 20ng/ml，20％FBS，1％双抗和IMDM)，第二贴壁细胞、第三贴壁细胞、第四贴壁细胞和第五贴壁细胞分别加入肌源性干细胞培养液(MDCM：b-FGF 10ng/ml，EGF 20ng/ml，PDGF 10ng/ml，10％FBS，10％HS，0.5％CEE，1％双抗，IMDM)，全部放入37℃，5％CO₂恒温培养箱进行培养；

肌源性干细胞为第六悬浮细胞；

卫星细胞为第三贴壁细胞和/或第四贴壁细胞。

实施例4与卫星细胞共培养

步骤a)：取第三贴壁细胞和第四贴壁细胞作为卫星细胞，EDTA胰酶消化后，加血清中和胰酶，吹打细胞并将细胞悬液转移到50ml离心管中，细胞计数后，1000rpm/5min离心，去掉上清，加入2ml肌源性干细胞培养液(MDCM)，吹打重悬细胞；

步骤b)：将卫星细胞悬液按每孔1×10⁵个细胞接种，放入37℃，5％CO₂恒温培养箱中，培养1天，待细胞大部分贴壁后换液，去除杂质及未贴壁死亡细胞；

步骤c)：将所得肌源性干细胞悬液置于细胞培养板中，每孔1×10⁵个细胞。分为实验组和对照组，实验组为与卫星细胞接触共培养，对照组为只有肌源性干细胞的对照组。每孔各加2ml肌源性干细胞培养液；全部放入37℃，5％CO₂恒温培养箱，分别每3天换液一次，接种后第3、7、10、14、21、28、42天拍照、计数。

实验组的拍照结果如图1A-图1M所示。

图1A为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养3天后光镜观测照片(放大倍数×40)；图1B为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养3天后光镜观测照片(放大倍数×100)；图1C为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养7天后光镜观测照片(放大倍数×40)；图1D为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养7天后光镜观测照片(放大倍数×100)；图1E为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养10天后光镜观测照片(放大倍数×40)；图1F为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养10天后光镜观测照片(放大倍数×100)；图1G为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养14天后光镜观测照片(放大倍数×40)；图1H为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养14天后光镜观测照片(放大倍数×100)；图1I为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养21天后光镜观测照片(放大倍数×40)；图1J为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养21天后光镜观测照片(放大倍数×100)；图1K为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养28天后光镜观测照片(放大倍数×40)；图1L为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养28天后光镜观测照片(放大倍数×100)；图1M为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养42天后光镜观测照片(放大倍数×40)；图1N为肌源性干细胞与卫星细胞悬浮共培养42天后光镜观测照片(放大倍数×100)。

对照组的拍照结果如图1O-图1U所示。

图1O为肌源性干细胞单纯悬浮培养3天后光镜观测照片；图1P为肌源性干细胞单纯悬浮培养7天后光镜观测照片；图1Q为肌源性干细胞单纯悬浮培养10天后光镜观测照片；图1R为肌源性干细胞单纯悬浮培养14天后光镜观测照片；图1S为肌源性干细胞单纯悬浮培养21天后光镜观测照片；图1T为肌源性干细胞单纯悬浮培养28天后光镜观测照片；图1U为肌源性干细胞单纯悬浮培养42天后光镜观测照片。

实施例5细胞计数

步骤a)：用中性蛋白酶(Dispase II)分离肌源性干细胞与卫星细胞，取实施例4中共培养得到的肌源性干细胞，吸管吹打使其分散均匀成单细胞悬液；

步骤b)：在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片；

步骤c)：取1.5mlEP管，加入100ul台盼蓝溶液，取100ul的细胞悬液加入EP管中，混匀后用微量加样器吸取细胞悬液10ul，在盖玻片下侧的计数板斜坡加入细胞悬液，至盖玻片下被液体充满为止，加样过程中注意避免气泡产生；

步骤d)：将计数板放置于显微镜下计数四角大方格内的细胞总数(透明、不着色的球形细胞是活细胞)，对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数，若细胞团在10％以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液；

步骤e)：细胞数量计算公式：细胞个数＝(4大格细胞总数/4)×2×10⁴(个/ml)×细胞悬液毫升数。

统计结果如下表所示(计数单位为×10⁵个)：

光镜下观察，实验组悬浮细胞数量在短暂降低后迅速升高，在培养的第3天可以看到有相当数量的细胞贴附于卫星细胞上，之后细胞数量逐渐增多，增殖的细胞小部分贴附于卫星细胞上，大部分以半贴壁或不贴壁的形式聚集于卫星细胞表面继续增殖，在第7天时其细胞数量超过对照组，在第42天可以观察到大量增殖的小球形肌源性干细胞以“沙滩样”外观聚集多层生长，细胞间不发生接触抑制；对照组悬浮细胞保持增殖状态，细胞呈团簇状，小球形，折光率高，未见明显细胞融合与分化。第42天较对照组约3倍，差异显著(P＜0.01)。说明本发明提供的与卫星细胞共培养的方法可以快速得到大量的肌源性干细胞。

实施例6细胞表面标记物(CD34、Sca-1)直标抗体流式细胞分析法

步骤a)：制备流式分析缓冲液：0.1％BSA加PBS，4℃保存；

步骤b)：收集上清液悬浮培养细胞，加入15ml离心管，1000rpm/5min离心，去掉上清；

步骤c)：将离心后的细胞团重悬于预冷的流式分析缓冲液中，300目细胞筛过滤后转移到EP管中，1000rpm/5min，4℃离心，去掉上清；

步骤d)：用100ul流式分析缓冲液重悬细胞团(约1×10⁶个细胞)，再加入适量体积抗体(eFluor660(APC)/CD34与FITC/Sca-1各5ul)，对照组不加抗体；

步骤e)：轻弹管壁，使细胞悬液与抗体充分混合后避光室温静置25-30min；

步骤f)：加入1ml流式分析缓冲液，1000rpm/5min，4℃离心，去掉上清；

步骤g)：用200ul流式分析缓冲液重悬细胞团，上机分析。如需过夜，将细胞团重悬于1％多聚甲醛固定液中，置于4℃冰箱避光保存；

步骤h)：检测前充分混匀样本管。

结果如图2A-图2F所示。

图2A为实验组共培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(加荧光抗体组与不加荧光抗体组合并)；

图2B为实验组共培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(加荧光抗体组)；

图2C为实验组共培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(不加荧光抗体组)；

图2D为对照组单纯悬浮培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(加荧光抗体组与不加荧光抗体组合并)；

图2E为对照组单纯悬浮培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(加荧光抗体组)；

图2F为对照组单纯悬浮培养所得细胞表面标记物(CD34、Sca-1)阳性细胞占比(不加荧光抗体组)；

从散点图来看，实验组与对照组阳性细胞数均向双阳性区域(Q2)移动，实验组双阳性细胞占32.1％，CD34+细胞占48.1％，Sca-1+细胞占39.34％；对照组双阳性细胞占30.0％，CD34+细胞占51.9％，Sca-1+细胞占35.96％。重复实验统计均值为实验组双阳性细胞占31.53％，CD34+细胞占50.04％，Sca-1+细胞占41.73％；对照组双阳性细胞占31.17％，CD34+细胞占50.73％，Sca-1+细胞占40.22％。差异均无统计学意义。

实施例7小鼠坐骨神经取材及施万细胞原代培养

步骤a)：准备超净台器械材料，器械浸泡于75％酒精中，紫外线照射半小时后通风15分钟；

步骤b)：将2ml低糖DMEM培养液置于15ml离心管中待用；

步骤c)：以C02窒息法处死小鼠8只，并用眼科镊提小鼠尾巴将其置于75％酒精中浸泡，取浸泡后的小鼠俯置于超净台；

步骤d)：以眼科镊沿小鼠后肢纵轴夹持，眼科剪剪开小鼠尾根部皮肤，自此处将皮肤脱套样分离；

步骤e)：眼科剪仔细剪除周围脂肪组织，分离小鼠下肢肌肉，剪取小鼠坐骨神经，将其置于15ml离心管所盛培养液中；

步骤f)：以此方法继续处理另外7只小鼠，共得到16条坐骨神经。

步骤g)：将盛有坐骨神经组织的离心管无菌封闭后转移至细胞实验室；

步骤h)：将离心管置于离心机中1000rpm/5min离心，吸除上清液，加入0.2％胶原酶NB4I酶溶液4ml与0.2％Dispase II酶溶液2ml，以达到0.1％胶原酶NB4I酶溶液与0.1％Dispase II酶溶液的工作浓度，置于37℃摇床中，130rpm震荡消化90分钟，期间观察组织消化状况；

步骤i)：1000rpm/5min离心，去掉上清液，加入施万细胞培养基7ml，移液管吹打重悬，置于100mm细胞培养皿中，标记pp0，置于37℃恒温培养箱中培养，3-4天换液1次；

实施例8小鼠施万细胞纯化与传代培养

步骤a)：待原代细胞贴壁80％左右时，吸除原代细胞上清液，PBS洗3遍，加入4ml0.2％Dispase II酶溶液，放入37℃恒温培养箱中消化5分钟；

步骤b)：期间观察组织消化状况，待上层施万细胞消化下来后，收集细胞悬液；

步骤c)：1000rpm/5min离心，去掉上清液，加入施万细胞培养基7ml，移液管吹打重悬种入新皿，标记pp1，置于37℃恒温培养箱中培养，3-4天换液1次；

步骤d)：观察细胞形态与生长状况，如仍混杂较多成纤维细胞则重复该方法，直至获得较纯净施万细胞继续培养备用。

实施例9明胶包被细胞培养板

步骤a)：配置0.1％明胶溶液：精密天平称量0.1g明胶，溶于100ml三蒸水中，在56℃水浴箱中充分溶解；

步骤b)：滤纸过滤至100ml蓝口瓶中备用；

步骤c)：取96孔细胞培养板或细胞培养皿，加样枪加入0.1％明胶，注意加入过程中不能产生气泡，否则包被效果不佳；

步骤d)：置于37℃恒温培养箱中静置30分钟；

步骤e)：吸除上清液，重复包被2次后置于超净台中备用。

实施例10MDSC成施万细胞诱导培养及p75NGF受体免疫荧光鉴定

步骤a)：取悬浮共培养的MDSC细胞，1000rpm/5min离心，去掉上清液；

步骤b)：加入实施例8中备用的施万细胞培养上清液1ml，移液枪吹打重悬，充分混匀成单细胞悬液；

步骤c)：加入96孔板中，每孔100ul；

步骤d)：3天换液，观察细胞生长状态，拍照记录。

步骤e)：培养1周后，吸取上清液并进行p75NGF受体免疫荧光染色。

结果如图3A-图3F所示。

图3A为与卫星细胞悬浮共培养后的MDSC成神经诱导光镜下观；

图3B为与卫星细胞悬浮共培养后的MDSC成神经诱导后p75NGF受体免疫荧光染色镜下观；

图3C为与卫星细胞悬浮共培养后的MDSC成神经诱导后p75NGF受体免疫荧光染色镜下观(加Dapi核染)；

图3D为单纯悬浮培养所得MDSC成神经诱导光镜下观；

图3E为单纯悬浮培养所得MDSC成神经诱导后p75NGF受体免疫荧光染色镜下观；

图3F为单纯悬浮培养所得MDSC成神经诱导后p75NGF受体免疫荧光染色镜下观(加Dapi核染)；

MDSC进行成施万细胞诱导1周后，光镜下可见小球形、折光率高的细胞逐渐分化为长条形，串珠样的类施万细胞样细胞，部分细胞死亡，部分细胞仍保持小球形。将成施万细胞诱导后的细胞进行免疫荧光染色显示，大部分经诱导细胞p75NGF受体反应阳性。

实施例11MDSC成骨诱导培养及茜素红染色鉴定

步骤a)：取悬浮培养的MDSC细胞，1000rpm/5min离心，去掉上清液；

步骤b)：加入成骨诱导培养液1ml，移液枪吹打重悬，充分混匀成单细胞悬液；

步骤c)：加入明胶包被的96孔板中，每孔100ul；

步骤d)：3天换液，观察细胞生长状态并拍照记录。

步骤e)：培养3周后，吸取上清液，PBS清洗2次，每孔加入茜素红染色液80ul，静置30分钟，吸取上清液，PBS清洗2次，镜下观察并拍照记录。

结果如图4A-图4D所示。

图4A为实验组共培养所得细胞成骨诱导光镜下观；

图4B为实验组共培养所得细胞成骨诱导后茜素红染色镜下观；

图4C为对照组单纯悬浮培养所得细胞成骨诱导光镜下观；

图4D为对照组单纯悬浮培养所得细胞成骨诱导后茜素红染色镜下观。

MDSC进行成骨诱导培养21天后光镜下观察，小球形、折光率高的细胞大量分化为长条形细胞，部分显示片状，有晶体形成；茜素红染色显示大部分红染，并可见棕褐色结晶状矿化结节形成。

对所有实验结果使用GraphPad Prism 6进行统计学分析，实验中各项定量数据均表示为平均值±标准误(Mean±SEM)或者百分比(％)，其中两实验组间比较应用t检验(正态分布且方差齐)，多实验组间定量资料的比较采用One-way ANOVA，以P＜0.05为组间拥有显著性差异。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种肌源性干细胞的增殖方法，其特征在于，包括在含有卫星细胞的环境中对肌源性干细胞进行增殖培养。

2.根据权利要求1所述的增殖方法，其特征在于，所述卫星细胞与所述肌源性干细胞的数量比为0.5-1.5:1；

优选地，所述增殖培养的培养基为肌源性干细胞培养液。

3.根据权利要求1所述的增殖方法，其特征在于，将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液，将细胞悬液在新的容器中静置培养，再取所述静置培养后的悬浮细胞在新的容器中静置培养，重复培养4-7次后，最后得到的悬浮细胞为所述肌源性干细胞；

优选地，所述重复培养多次的次数优选为4-5次，进一步优选为5次；

优选地，所述静置培养的培养基为肌源性干细胞培养液；

优选地，所述容器可以为旋转式生物培养瓶。

4.根据权利要求1所述的增殖方法，其特征在于，将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液，将细胞悬液在新的容器中静置培养得到悬浮细胞和贴壁细胞，再取所述静置培养后的悬浮细胞在新的容器中静置培养得到悬浮细胞和贴壁细胞，重复培养4-7次后，第4次静置培养得到的贴壁细胞和/或第5次静置培养得到的贴壁细胞为所述卫星细胞；

优选地，所述重复培养多次的次数优选为4-5次；

优选地，所述静置培养的培养基为肌源性干细胞培养液。

5.根据权利4所述的增殖方法，其特征在于，所述贴壁细胞用肌源性干细胞培养液进行培养。

6.根据权利要求1-5任一项所述的增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：将肌肉组织消化，提取肌肉来源细胞悬液，将细胞悬液在成纤维细胞培养液中静置培养，得到第一悬浮细胞和第一贴壁细胞，将第一悬浮细胞在成纤维细胞培养液中静置培养，得到第二悬浮细胞和第二贴壁细胞，将第二悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第三悬浮细胞和第三贴壁细胞，将第三悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第四悬浮细胞和第四贴壁细胞，将第四悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第五悬浮细胞和第五贴壁细胞，将第五悬浮细胞在肌源性干细胞培养液中静置培养，得到第六悬浮细胞和第六贴壁细胞；

所述第六悬浮细胞为所述肌源性干细胞；

所述第三贴壁细胞和/或第四贴壁细胞为所述卫星细胞；

在含有卫星细胞的环境中对肌源性干细胞进行增殖培养。

7.根据权利要求6所述的增殖方法，其特征在于，将所述卫星细胞消化后贴壁培养，再加入纯化的肌源性干细胞进行增殖培养。

8.根据权利要求6所述的增殖方法，其特征在于，在进行肌源性干细胞的增殖培养时，所述卫星细胞与所述肌源性干细胞的数量比为0.5-1.5:1；

优选地，所述增殖培养的条件为36-38℃，4-6％CO₂培养箱中静置培养；

优选地，所述增殖培养的容器可以为旋转式生物培养瓶。

9.根据权利要求6所述的增殖方法，其特征在于，所述静置培养的时间为22-26h；

优选地，所述静置培养的温度为36-38℃；

优选地，所述培养空气环境为4-6％CO₂。

10.根据权利要求6所述的增殖方法，其特征在于，所述第三贴壁细胞和/或第四贴壁细胞用肌源性干细胞培养液进行培养得到所述卫星细胞；

优选地，所述贴壁细胞的培养条件温度为36-38℃；

优选地，所述培养空气环境为4-6％CO₂；

优选地，所述贴壁细胞的培养时间为22-26h。