CN106947733A - 一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，包括以下步骤：将重组好的胚胎细胞经激活液激活2‑3h后，置于初级培养液中培养至胚胎细胞发育到二细胞期；将发育到二细胞期的胚胎交替置于第一后期培养液和第二后期培养液中培养，直至克隆胚胎发育至囊胚；所述第一后期培养液KSOM培养液，第二后期培养液是不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二钠和牛血清蛋白的M16培养液。本发明公开的方法，重组胚胎的不同发育阶段采用不同的培养液，并在二细胞期以后采用两种培养液交替更换培养的方式，使胚胎收到牛血清蛋白的间隔性刺激，促进克隆胚胎的体外发育，提高了发育率，成功率高，有利于进行其他相关试验，节约时间成本和人力成本。

Description

一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法。
背景技术
克隆胚胎属于克隆的一种方法，最常用的就是体细胞克隆技术，是指采用核移植的方法，利用细胞拆合或者细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或者含少量细胞质的细胞核质体作为核供体，将核供体移入核受体中构建重组胚胎，然后核供体在去核卵母细胞的包质中被重新编程、发育的过程。体细胞克隆技术在生物、医学领域具有许多成功案例，对于研究动物胚胎发育、研究胚胎发育机理、药物治疗作用、克隆动物等方面具有重要的应用价值。
小鼠作为医学试验的常用作用对象，是各种药物试验的基础，小鼠克隆胚胎的体外培养发育是常用的手段之一。然而体外培养环境对胚胎发育有重要的影响，培养温度、湿度、营养液中的化学物质等的变化都将影响胚胎的发育效果和发育率，例如培养液中血清能改变与基因组印迹相关的遗传信息。
因此，我们有必要研发一种新的培养方法，以减少培养环境对胚胎细胞发育分化的影响。
发明内容
本发明提供的一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，减少了培养环境对胚胎细胞发育分化的影响。
本发明提供的一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，包括以下步骤：
步骤1，将重组好的胚胎细胞经激活液激活2-3h后，置于初级培养液中培养至胚胎细胞发育到二细胞期；
每升所述激活液中含有265-270mg的CaCl2、0.1mg的FeNO3、400mg的KCl、95-100mg的MgSO4·7H2O、5-6g的NaCl、100mg的NaH2PO4、1.5g葡萄糖，余量为四蒸水；
所述初级培养液制备方法是向DMEM培养液中添加乳酸，其中乳酸与DMEM培养液的质量比例为1～2:1000；
步骤2，将发育到二细胞期的胚胎交替置于第一后期培养液和第二后期培养液中培养，直至克隆胚胎发育至囊胚；
所述第一后期培养液为KSOM培养液，第二后期培养液是不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二钠和牛血清蛋白的M16培养液。
优选的，上述体外培养方法中，每升所述激活液中含有265mg的CaCl2、0.1mg的FeNO3、400mg的KCl、98mg的MgSO4·7H2O、5g的NaCl、100mg的NaH2PO4、1.5g葡萄糖，余量为四蒸水。
优选的，上述体外培养方法中所述初级培养液制备方法是向DMEM培养液中添加乳酸，其中乳酸与DMEM培养液的质量比例为2:1000。
优选的，上述体外培养方法中将发育到二细胞期的胚胎交替置于第一后期培养液和第二后期培养液中培养时，每次第一后期培养液的培养时间为24-26h，每次第二后期培养液的培养时间为2-3h。
与现有技术相比，本发明提供的一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法具有以下有益效果：
(1)重组胚胎的不同发育阶段采用不同的培养液，并在二细胞期以后采用KSOM培养液，不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二钠和牛血清蛋白的M16培养液交交替更换培养的方式，使胚胎收到牛血清蛋白的间隔性刺激，提高胚胎发育效率，促进克隆胚胎的体外发育，成功率高，有利于进行其他相关试验，节约时间成本和人力成本。
(2)本发明激活阶段选用的培养液成分简单，成本低，激活最长时间只需要3h。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，所用试剂均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
我们以8-12周龄的ICR雌鼠提供受精卵，8-12周龄的C57BL/6雌鼠来提供卵母细胞，上述ICR雌鼠和C57BL/6小鼠均购自南京君科生物工程有限公司，实验小鼠的饲养按照常规方式进行。
参考公告号为101798567B、名称为《一种改进的促进小鼠克隆胚胎发育的培养方法》专利中述及的方法制备重组的胚胎细胞，采用一步法进行体细胞核移植操作，制备重组的胚胎细胞，包括：
8-12周龄ICR雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素10单位，48小时候腹腔注射人绒毛膜促性腺激素10单位，注射15小时后，断颈处死小鼠，取下输卵管，提取卵丘卵母细胞复合体，用300U/ml的透明质酸酶消化卵丘卵母细胞复合体，分离颗粒细胞和卵母细胞。
然后利用本发明的方法使胚胎体外发育，其中胚胎体外发育的方法包括以下实施例。
实施例1
一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，包括以下步骤：
步骤1，将重组好的胚胎细胞经激活液激活2h后，置于初级培养液中培养至胚胎细胞发育到二细胞期；
每升所述激活液中含有265mg的CaCl2、0.1mg的FeNO3、400mg的KCl、98mg的MgSO4·7H2O、5g的NaCl、100mg的NaH2PO4、1.5g葡萄糖，余量为四蒸水；
所述初级培养液制备方法是向DMEM培养液中添加乳酸，其中乳酸与DMEM培养液的质量比例为2:1000；
步骤2，将发育到二细胞期的胚胎交替置于第一后期培养液和第二后期培养液中培养，每次第一后期培养液的培养时间为24h，每次第二后期培养液的培养时间为2h(第一后期培养液培养24h后更换第二后期培养液，2h后再更换第一后期培养液，继续培养24h后再次更换为第一后期培养液……)，直至克隆胚胎发育至囊胚；
所述第一后期培养液KSOM培养液，第二后期培养液是不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二钠和牛血清蛋白的M16培养液。
实施例2
一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，包括以下步骤：
步骤1，将重组好的胚胎细胞经激活液激活3h后，置于初级培养液中培养至胚胎细胞发育到二细胞期；
每升所述激活液中含有270mg的CaCl2、0.1mg的FeNO3、400mg的KCl、95mg的MgSO4·7H2O、6g的NaCl、100mg的NaH2PO4、1.5g葡萄糖，余量为四蒸水；
所述初级培养液制备方法是向DMEM培养液中添加乳酸，其中乳酸与DMEM培养液的质量比例为1:1000；
步骤2，将发育到二细胞期的胚胎交替置于第一后期培养液和第二后期培养液中培养，每次第一后期培养液的培养时间为26h，每次第二后期培养液的培养时间3h(第一后期培养液培养26h后更换第二后期培养液，3h后再更换第一后期培养液，继续培养26h后再次更换为第一后期培养液……)，直至克隆胚胎发育至囊胚；
所述第一后期培养液KSOM培养液，第二后期培养液是不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二钠和牛血清蛋白的M16培养液。
我们将重组的胚胎细胞置于不同培养液中培养，培养方法均同实施例1，只是不同阶段采用的培养液不同，设计以下几组试验：
试验一组：采用实施例1的方法和培养液进行胚胎发育培养；
试验二组：激活液、初级培养液、第一后期培养液和第二后期培养液均是CZB培养液，胚胎后期发育过程中不存在培养液交替使用的操作；
试验三组：激活液、初级培养液、第一后期培养液和第二后期培养液均是KSOM培养液，胚胎后期发育过程中不存在培养液交替使用的操作；
试验四组：激活液采用的是CZB培养液，初级培养液采用的是M16培养液，第一后期培养液和第二后期培养液均是KSOM培养液，胚胎后期发育过程中不存在培养液交替使用的操作；
分别按照上述四组方法进行小鼠克隆胚胎发育培养，直至得到囊胚，观察记录体外发育率。结果如表1所示。由表1的结果可知，四种培养方法中，二细胞胚胎数量差距不大，但是四细胞胚胎数中，试验二、三、四组的数量分别低于试验一组25％、24％和16％，最终的囊胚数仍是试验一组最高，其次为实验四组，说明本发明的体外方法通过培养液的交替使用可以显著提高小鼠克隆提高小鼠克隆胚胎发育率。
表1 克隆胚胎在不同培养方法中的体外发育率
需要说明的是，上述实施例及试验中，述及的DMEM培养液为DMEM培养液、KSOM培养液、M16培养液、CZB培养液按常规方法制备，其配方如下：
DMEM培养液是将市售的高糖型DMEM粉末按照使用说明配制而成的培养液。
每升KSOM培养液中含有5592.7mg氯化钠、185.13mg氯化钾、47.63mg磷酸二氢钾、49.3mg七水硫酸镁、2100.25mg碳酸氢钠、251.4mg二水氯化钙、1870mg 60％乳酸钠、22.01mg丙酮酸钠、36.03mg葡萄糖、3.36mg EDTA(二钠盐)、2000mg牛血清蛋白、60mg青霉素、50mg链霉素、20ml 2％(v/v)必需氨基酸、10ml 1％(v/v)非必需氨基酸(市售)、10mg酚红，余量为四蒸水。
每升M16培养液中含有5680mg氯化钠、356mg氯化钾、162mg磷酸二氢钾、293mg七水硫酸镁、2100.25mg碳酸氢钠、251.4mg二水氯化钙、2610mg 60％乳酸钠、36mg丙酮酸钠、1000mg葡萄糖、4000mg牛血清蛋白、50mg链霉素、5mg酚红，余量为四蒸水。
每升CZB培养液中含有4769.88mg氯化钠、360.56mg氯化钾、160.58mg磷酸二氢钾、290.83mg七水硫酸镁、2110.33mg碳酸氢钠、251.4mg二水氯化钙、3507.79mg乳酸钠、29.71mg丙酮酸钠、1001.69mg葡萄糖、36.98mg EDTA(二钠盐)、4000mg牛血清蛋白、70mg青霉素、50mg链霉素、20ml 2％(v/v)必需氨基酸、10ml 1％(v/v)非必需氨基酸、10mg酚红，余量为四蒸水。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将重组好的胚胎细胞经激活液激活2-3h后，置于初级培养液中培养至胚胎细胞发育到二细胞期；
每升所述激活液中含有265-270mg的CaCl2、0.1mg的FeNO3、400mg的KCl、95-100mg的MgSO4·7H2O、5-6g的NaCl、100mg的NaH2PO4、1.5g葡萄糖，余量为四蒸水；
所述初级培养液制备方法是向DMEM培养液中添加乳酸，其中乳酸与DMEM培养液的质量比例为1～2:1000；
步骤2，将发育到二细胞期的胚胎交替置于第一后期培养液和第二后期培养液中培养，直至克隆胚胎发育至囊胚；
所述第一后期培养液为KSOM培养液，第二后期培养液是不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二钠和牛血清蛋白的M16培养液。
2.根据权利要求1所述的提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，其特征在于，每升所述激活液中含有265mg的CaCl2、0.1mg的FeNO3、400mg的KCl、98mg的MgSO4·7H2O、5g的NaCl、100mg的NaH2PO4、1.5g葡萄糖，余量为四蒸水。
3.根据权利要1所述的提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，其特征在于，所述初级培养液制备方法是向DMEM培养液中添加乳酸，其中乳酸与DMEM培养液的质量比例为2:1000。
4.根据权利要1所述的提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，其特征在于，将发育到二细胞期的胚胎交替置于第一后期培养液和第二后期培养液中培养时，每次第一后期培养液的培养时间为24-26h，每次第二后期培养液的培养时间为2-3h。
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