KR101994162B1 - 수정란의 체외 배양기 및 이것의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본원은 수정란의 체외 배양기 및 이것의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 하나 이상의 웰(well)이 형성된 어레이(array); 및 상기 웰 안에 형성된 것으로 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane:PDMS)으로 이루어진 바닥면;을 포함하는 수정란의 체외 배양기이며, 이와 같이 웰의 바닥면이 PDMS로 이루어진 배양용기를 이용하면, 기존에 플라스틱으로 이루어진 어레이를 이용하는 것보다 수정란의 배반포 생산율을 더욱 증가시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

수정란의 체외 배양기 및 이것의 제조방법{IN VITRO CULTURE INSTRUMENT FOR EMBRYO AND PREPARING METHOD THEREOF}
본원은 수정란을 체외에서 배양하는데 사용되는 체외 배양기에 대한 것으로, 더욱 구체적으로는 수정란의 배반포 형성율을 높일 수 있는 수정란의 체외 배양기 및 이것의 제조방법에 대한 것이다.
저출산 시대에 들어와 불임·난임은 전세계적인 문제가 되고 있으며, 여성의 고령 임신에 따른 생식능력 감소와 생식기 질환 증가, 그리고 스트레스 및 환경오염 증가 등으로 인해 불임 발생 빈도는 빠르게 증가하고 있는 실정이다. 이에 따라 불임·난임 시술 건수도 빠르게 증가하고 있다.
이러한 불임·난임 극복을 위해 배란 유도, 자궁내 인공수정 (IUI), 체외수정, 배아이식 (IVF-ET) 및 세포질내 정자주입술 (ICSI) 등과 같은 다양한 보조생식술이 시행되고 있다. 하지만 이러한 난임 시술은 높은 비용을 요구하며, 한 주기 치료 후 임신 성공률이 15~25% 정도로 매우 낮다는 문제점들을 가지고 있다. 따라서, 임신 성공률 향상을 위한 방안으로써 연속하여 치료 주기를 반복적으로 수행하고 있는 상황이다. 하지만, 이러한 노력에도 불구하고, 임신 성공률은 50%에 미치지 못하고 있으며, 시술을 받는 여성 환자에게 있어서도 신체적·정신적·비용적 측면에서 많은 희생이 요구되고 있는 실정이다.
보조생식술 가운데 자궁 내 착상이 가능한 양질의 배반포를 체외에서 효율적으로 생산할 수 있는 기술은 매우 중요하다 (Balaban 등, 2000; Lagalla 등, 2015). 하지만, 지금까지 개발된 수정란 체외배양을 통한 배반포 생산 기술에 의하면 일반적으로 배반포 형성율이 25% 내외로 낮기 때문에, 이를 극복할 수 있는 새로운 기술 개발이 적극 요구되고 있는 실정이다 (Coskun 등, 2000). 한 번의 난임 시술로 자궁내 이식 가능한 양질의 배반포 대량 생산은 난임 시술 과정 중 환자가 겪게 되는 고통을 크게 경감시킬 수 있음과 동시에, 자궁내 수정란 이식 기회의 증가를 통해 임신 성공률을 크게 향상 시킬 수 있다.
이에, 양질의 배반포 체외생산효율을 높이기 위한 다양한 방법들이 시도되어 왔다 (Jones 등, 1998; Coskun 등, 2000). 하지만, 대부분의 접근 방향은 배반포 형성을 촉진시킬 수 있는 화학적 인자들의 첨가 및 제거를 통한 체외배양액 개발에 집중되어 왔으며 (Li 등, 2015; Cheong 등, 2015), 이러한 체외배양액 개선을 통해서도 최대 40%를 넘지 않는 낮은 배반포 체외생산효율을 보여주었다. 따라서, 배양액의 최적화에도 불구하고 배반포 형성율에 있어 그 한계를 보여주었다. 이러한 한계점 극복을 위해서는 화학적 인자들에 기반한 체외배양환경이 아닌 물리적 인자들에 기반한 체외배양환경 개선 역시 매우 중요하다.
Balaban B, Urman B, Sertac A, Aksoy S, Mercan R (2000): Blastocyst quality affects the success of blastocyst-stage embryo transfer. Fertil Steril 74:282-287. Lagalla C, Barberi M, Orlando G, Sciajno R, Bonu MA, Borini A (2015): A quantitative approach to blastocyst quality evaluation: morphometric analysis and related IVF coutcomes. J Assist Reprod Genet 32:705-712. Coskun S, Hollanders J, Ai-Hassan S, Al-Sufyan H, Al-Mayman H, Jaroudi K (2000): Day 5 versus day 3 embryo transfer: a controlled randomized trial. Hum Reprod 15:1947-1952. Jones GM, Trounson AO, Lolatgis N, Wood C (1998): Factors affecting the success of human blastocyst development and pregnancy following in vitro fertilization and embryo transfer. Fertile Steril 70:1022-1029. Li JJ, Sugimura S, Mueller TD, White MA, Martin GA, Ritter LJ, Liang XY, Gilchrist RB, Mottershead DG (2015): Modifications of human growth differentiation factor 9 to improve the generation of embryos from low competence oocytes. Mol Endocrinol 29:40-52. Cheong SA, Kim E, Kwak SS, Jeon Y, Hyun SH (2015): Improvement in the blastocyst quality and efficiency of putative embryonic stem cell line derivation form porcine embryos produced in vitro using novel culturing system. Mol Med Rep 12:2140-2148. Red-Horse K, Zhou Y, Genbacev O, Prakobphol A, Roulk R, McMaster M, Fisher SJ (2004): Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest 114:744-754. KOIKE T, MATSUURA K, NARUSE K, FUNAHASHI H (2010): In-vitro culture with a tilting device in chemically defined media during meiotic maturation and early development improves the quality of blastocysts derived from in-vitro matured and fertilized porcine oocytes. J Reprod Dev 56:552-557.
기존에 널리 사용되고 있는 플라스틱 기반 수정란 체외 배양 용기를 이용하여 수정란 유래 배반포를 생산할 경우, 수정란 조작 환경, 조작시간 및 조작자의 숙련도 등에 따라 배반포 형성율이 크게 영향을 받는다. 또한, 수정란이 체내에서 생산되었는지 또는 체외에서 생산되었는지 여부도 플라스틱 기반 수정란 체외 배양용기에서의 배반포 형성율에 큰 영향을 미친다.
이에 본원에서는, 외부적 요인에 의해 배반포 형성율이 실질적인 영향을 받지 않으면서도 고효율로 수정란 유래 배반포를 생산할 수 있는 새로운 재질의 수정란 체외 배양 용기를 개발하는 것이 목적이다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 하나 이상의 웰(well)이 형성된 어레이(array); 및 상기 웰 안에 형성된 것으로, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane:PDMS)으로 이루어진 바닥면;을 포함하는 수정란의 체외 배양기이다.
본원의 제 2 측면은, 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane)으로 이루어지는 고형 몸체; 및 상기 고형 몸체에 형성된 웰(well)을 포함하는 수정란의 체외 배양기이다.
본원의 제 3 측면은, 하나 이상의 웰(well)이 형성된 어레이(array)를 준비하는 단계; 및 상기 준비한 어레이의 웰 안에 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 이루어진 바닥면을 형성하는 단계;를 포함하는, 수정란의 체외 배양기 제조방법이다.
본원의 제 4 측면은, 액상 폴리디메틸실록산과 경화제를 혼합하여 혼합액을 준비하는 단계; 상기 준비한 혼합액에서 기포를 제거하는 단계; 및 상기 기포를 제거한 혼합액을 하나 이상의 웰 형성 구조물을 가지는 성형틀에 부어서 경화시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 수정란의 체외 배양기 제조방법이다.
본원의 제 5 측면은, 상기한 체외 배양기의 웰 안에 수정란을 주입하는 단계; 및 상기 수정란을 배양하는 단계;를 포함하는, 수정란의 체외 배양 방법이다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
체내에서 수정란이 배반포를 형성하는 과정 동안 수정란은 난관 내에서 다양한 물리적 자극을 경험하며, 이러한 물리적 자극에 대한 인위적 모방은 수정란의 체외 배반포 형성율 향상에 큰 도움을 줄 수 있다. 따라서, 본원발명에서는 수정란의 체외 배양시 이용되는 배양접시 등의 배양기의 물리적 환경을 개선함으로써 배반포 체외 배양 효율을 극대화하고자 하였다.
구체적으로, 본원발명에서는 수정란 체외 배양용기의 재질로서 실리콘의 일종인 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane)을 사용하였으며, 상기 재질의 수정란 체외 배양 용기를 이용하여 수정란을 체외 배양할 경우 기존에 사용되던 플라스틱 기반 체외 배양 용기에 비해 현저히 향상된 높은 배반포 생산 효율을 나타내었다.
따라서, 본원발명에 따르면 수정란을 이용한 다양한 산업들에서 낮은 배반포 도달률로 인해 직면한 문제들을 해결하는데 큰 도움이 될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 수정란의 체외 배양기 구성을 나타내는 사시도이다.
도 2는 본 발명에 따른 체외 배양기의 웰 구조 일례를 나타내는 단면도이다.
도 3은 본 발명에 따른 체외 배양기의 웰 안에 홈이 형성된 구조 일례를 나타내는 단면도이다.
도 4는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 수정란의 체외 배양기 구성을 나타내는 사시도이다.
도 5는 본 발명에 따라 PDMS로 이루어진 바닥면을 가지는 체외 배양기의 제조방법 일례를 설명하기 위한 흐름도이다.
도 6은 본 발명에 따라 PDMS로 이루어진 몸체를 가지는 체외 배양기의 제조방법 일례를 설명하기 위한 흐름도이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하, 본원의 수정란의 체외 배양기, 이의 제조방법 및 이를 이용한 수정란의 체외 배양 방법에 대하여, 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 수정란의 체외 배양기 구성을 나타내는 사시도이다.
여기에 도시된 본원의 제 1 측면은, 어레이(array, 10); 및 바닥면(20);을 포함하는 수정란의 체외 배양기이다.
상기 어레이(10)는 하나 이상의 웰(11)이 형성된 것이다. 상기 웰(11)은 고형 몸체에 형성된 홈(groove)인 것이 가능하다. 또한, 상기 웰(11)은 고형 몸체에 어레이 형태로 2개 이상 복수개가 형성된 것일 수 있다. 이러한 어레이(10)는 특별히 제한되지 않고 이 기술분야에 알려진 다양한 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 기존에 많이 사용되던 어레이를 이용할 수도 있기 때문에, 간단하고 용이하게 만들어질 수도 있다. 또한, 필요한 경우 사용자가 기존의 어레이를 이용해서 직접 만들어서 사용하는 것도 가능하다.
상기 바닥면(20)은 웰(11) 안에 형성된 것으로, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane:PDMS)으로 이루어진 것이다. 즉, 어레이(10)의 웰(11) 바닥부에 PDMS으로 이루진 바닥면이 형성된 것이다. 이러한 바닥면(20)은 액상 또는 고체상의 PDMS으로 이루어질 수 있고, 그 중에서도 고체상의 PDMS으로 이루어진 것이 그 위에 수정란을 배양하기에 더욱 바람직하다. 상기 PDMS으로 이루어진 바닥면(20)을 형성하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 상기 바닥면(20)은 평평한 구조를 가질 수도 있고, 2차원 또는 3차원 입체 형상을 갖는 것도 가능하다. 또한, 본 발명은 상기 웰(11) 안의 바닥면(20) 뿐만 아니라 측면 전체 또는 일부도 PDMS에 의해 코팅된 것일 수 있다.
이러한 본 발명은 어레이(10)의 웰(11) 바닥이 PDMS로 이루어진 것을 특징으로 하고, 상기 PDMS는 수정란이 자랄 수 있는 체내 환경을 모방하는 것이다.
본 명세서에서 수정란은 일반 동물 세포와 달리 하나의 완성된 개체를 형성할 가능성을 가진 세포로서, 그 배양 조건 (배지, 인자 및 배양 환경 등) 및 발달 단계 역시 일반 동물 세포와 구분된다. 즉, 줄기세포를 포함하는 일반 동물 세포에게 적합한 배양 환경이라고 해도 수정란의 배양 및/또는 발달에 적합하지 않을 수 있으며, 수정란의 배양 및/또는 발달에 적합한 배양 환경이라도 일반 동물 세포의 배양에 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 수정란은 생쥐, 래트, 인간, 돼지, 소, 개, 원숭이, 침팬지, 말, 양 또는 제브라피쉬의 수정란일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
실제로, 본 발명자들은 후술하는 실시예에 나타난 바와 같이, 웰(11)이 PDMS로 이루어진 바닥면(20)을 갖는 어레이(10)를 이용하는 경우, 그렇지 않고 기존의 플라스틱으로만 이루어진 어레이를 이용하는 경우보다, 수정란의 배반포 생산 효율이 크게 증가하는 것을 확인한 뒤 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들의 실험 결과, 어레이의 각 웰에 PDMS로 이루어진 바닥면을 형성하더라도, 수정란의 2-세포 발달률은 기존에 플라스틱으로만 이루어진 어레이보다 낮았고, 4-세포 발달률도 큰 유의성이 없었다(본 발명의 실시예 표 1 참조). 그래서, 종래에는 웰에 PDMS로 이루어진 바닥면을 형성하더라도 배반포 형성율이 크게 증가할 것이라고는 쉽게 생각하지 못하였을 것이다.
그러나, 본 발명자들은 수정란의 배반포 생성 효율까지 검증하였고, 본 발명처럼 웰(11)의 바닥면(20)이 PDMS로 이루어진 배양용기를 이용하면, 수정란의 배반포 형성율이 크게 증가한다는 것을 새롭게 알게된 것이다.
상기한 본 발명은 기존의 어레이를 이용하면서도 PDMS로 이루어진 바닥면(20)을 포함시킴으로서, 기존보다 수정란의 배반포 생산율을 더욱 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
따라서, 본 발명에 따른 체외 배양기는 수정란을 배반포기까지 체외 배양하기 위한 것이 더욱 바람직하다.
도 2는 본 발명에 따른 체외 배양기(1)의 웰(11) 구조 일례를 나타내는 단면도이다.
여기에 도시된 본 원의 일 구현예로서, 상기 웰(11)은 단면이 수직한 측면을 가지는 것이 가능하다. 즉, 웰(11)의 상부면과 하부면이 동일하거나 유사한 크기 또는 면적을 갖는 것이다. 다시 말해서, 웰(11)의 상단 직경과 하단 직경이 동일하거나 유사하기 때문에, 상기 웰(11) 안으로 배양하고자 하는 수정란과 이것을 배양하기 위한 배지 등을 용이하게 주입하는 것이 가능하다.
웰(11)의 상단 직경과 하단 직경이 동일하고, 바닥면과 측면이 수직을 이루면 원통형의 구조를 가지게 된다.
예를 들어, 상기 웰(11)의 너비 또는 폭(w1, w2)은 특별히 제한되지 않지만 1mm 내지 50mm 범위, 2mm 내지 40mm 범위, 3mm 내지 30mm 범위, 4mm 내지 25mm 범위, 5mm 내지 20mm 범위, 6mm 내지 15mm 범위, 7mm 내지 13mm 범위, 8mm 내지 12mm 범위, 9mm 내지 11mm 범위 내인 것이 바람직하다. 또한, 상기 웰(11)의 높이(h1)는 특별히 제한되지 않지만 1mm 내지 50mm 범위, 2mm 내지 40mm 범위, 3mm 내지 30mm 범위, 4mm 내지 25mm 범위, 5mm 내지 20mm 범위, 6mm 내지 15mm 범위, 7mm 내지 13mm 범위, 8mm 내지 12mm 범위, 9mm 내지 11mm 범위 내인 것이 바람직하다. 즉, 상기 웰(11)은 동일하거나 유사한 범위 내의 너비 또는 폭(w1, w2) 및 높이(h1)를 갖는 것이, 그 내부에서 수정란의 배양 효과를 더욱 높일 수 있는 효과가 있다.
또한, 상기 웰(11)의 두께(t)는 약 1 mm 내지 1 cm, 또는 약 3 mm 내지 1 cm, 약 6 mm 내지 1 cm, 약 1 mm 내지 6 mm, 또는 약 3 mm 내지 6 mm일 수 있으며, 상기 벽면 및/또는 바닥에 수정란 수납부가 형성되는 경우 그 두께가 더욱 두꺼워질 수도 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 원의 다른 일 구현예로서, 상기 웰(11)은 그것의 단면이 상광하협(上廣下狹)의 형상을 가지는 것이 가능하다. 즉, 상기 웰(11)의 상부면이 하부면 보다 크기가 크거나 큰 면적을 갖는 것이다. 다시 말해서, 웰(11)의 상단 직경이 하단 직경보다 길기 때문에, 상기 웰(11)은 주입구쪽으로 더 크게 오픈될 수 있으며, 이를 통하여 상기 웰(11) 안으로 배양하고자 하는 수정란과 이것을 배양하기 위한 배지 등을 더욱 용이하게 주입할 수 있다.
도 3은 본 발명에 따른 체외 배양기의 웰(11) 안에 홈(groove, 30)이 형성된 구조 일례를 나타내는 단면도이다.
여기에 도시된 본 원의 또 다른 구현에로서, 상기 웰(11)은 바닥면(20)에 형성된 홈(30)을 포함하는 것이 가능하다.
상기 홈(30)은 실린더, 구, 또는 타원 형상일 수 있고, 그것의 단면은 도 3에 나타난 바와 같이 사각형인 것이 가능하며, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 홈(30)은 웰(11)의 바닥면(20) 및/또는 측면에 형성될 수 있고, 상기 웰(11)의 내부 표면으로부터 추가로 함입되어 형성되는 것이 가능하다. 상기 홈(30)은 직경이 약 2 mm 내지 5 mm, 약 3 mm 내지 4 mm, 또는 약 3.5 mm일 수 있고, 깊이가 약 2 mm 내지 5 mm, 약 3 mm 내지 4 mm, 또는 약 3.5 mm일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이러한 홈(30)은 수정란 및/또는 배지를 수납할 수 있는 크기 및 모양을 가질 수 있고, 수정란 수납부 기능을 가진다. 예를 들어, 상기 홈(30) 내에는 수정란 1 개가 수납될 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있으며, 수정란 2 개 이상이 수납될 수도 있다.
본 발명자들은 후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 웰(11)의 바닥이 평평한 것과 실린더 형상의 홈(30)을 갖는 것을 이용하여, 각각의 배반포 형성 효율을 비교하였고, 그 결과 웰(11)의 바닥면에 홈(30)이 형성된 경우, 배반포 형성 효율이 더욱 증가한다는 것을 확인하였다.
본 원에서 상기한 상기 바닥면(20)을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 상기 바닥면(20)은 폴리디메틸실록산(PDMS)이 경화되어 이루어진 것이 바람직하고, 상기 바닥면(20)은 상기 웰(11) 안에 주입된 액상의 폴리디메틸실록산(PDMS)에서 기포가 제거된 후 경화되어 이루어진 것이 더욱 바람직하다.
이러한 PDMS 바닥면(20)의 형성방법은 후술하여 더욱 자세하게 설명하기로 한다.
도 4는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 수정란의 체외 배양기 구성을 나타내는 사시도이다.
본원의 제 2 측면은, 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane)으로 이루어지는 고형 몸체(100); 및 상기 고형 몸체(100)에 형성된 웰(well, 110)을 포함하는 수정란의 체외 배양기이다.
상기 고형 몸체(100)는 수정란의 체외 배양을 위해 배양 접시, 배양 플레이트, 배양 플라스크 또는 배양을 위한 기타 형태를 가지는 것일 수 있으며, 본질적으로 실리콘의 일종인 폴리디메틸실록산(PDMS)로 이루어져 있다.
상기 웰(110)은 당업계에서 PDMS의 성형을 위해 사용되는 임의의 방법에 의해 형성될 수 있으며, 예를 들어, 몰드 (틀)을 이용한 방법 또는 리소그래피 방법에 의해 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 고형 몸체(100)에 형성된 웰(110) 내에서 배지의 존재하에 수정란이 배양될 수 있다. 상기 PDMS로 이루어진 고형 몸체(100)는 수정란이 자라기 위한 체내 환경을 모방할 수 있다.
이러한 체외 배양기는 특히 수정란의 체외 배양에 최적화된 것일 수 있다. 예를 들어, PDMS로 이루어지는 고형 몸체(100)를 포함하는 본원의 체외 배양기는 다수이 기공 또는 공극을 가지고 있어서, 수정란이 자라기 위한 체내 환경을 모방하기 때문에, 다른 재질로 이루어진 체외 배양기에 비하여 수정란의 배양 및/또는 발달율을 더욱 높일 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 웰(110)은 상기 고형 몸체(100)에 어레이 형태로 복수개가 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 웰(110)은 하나 이상의 레인으로 배열되거나 격자 형태로 배열되거나 군집형태로 함께 모여 있는 형태 등의 다양한 어레이 구조가 될 수 있다.
도 5는 본 발명에 따라 PDMS로 이루어진 바닥면을 가지는 체외 배양기의 제조방법 일례를 설명하기 위한 흐름도이다.
여기에 도시된 본원의 제 3 측면은, 하나 이상의 웰(well)이 형성된 어레이(array)를 준비하는 단계(S10); 및 상기 준비한 어레이의 웰 안에 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 이루어진 바닥면을 형성하는 단계(S20);를 포함하는, 수정란의 체외 배양기 제조방법이다.
상기 어레이를 준비하는 단계(S10)는, 하나 이상의 웰이 형성된 어레이를 준비하는 것이다. 상기 어레이는 이 기술분야에 알려진 다양한 모든 것을 포함할 수 있다.
상기 바닥면을 형성하는 단계(S20)는. 상기 준비한 어레이의 웰 안에 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 이루어진 바닥면을 형성하는 것이다.
예를 들어서, 상기 바닥면을 형성하는 단계(S20)는, 상기 준비한 어레이의 웰 안에 액상의 폴리디메틸실록산(PDMS)을 주입하는 단계(S21); 상기 주입한 폴리디메틸실록산 안의 기포를 제거하는 단계(S22); 및 상기 기포를 제거한 폴리디메틸실록산을 경화시키는 단계(S23);를 포함할 수 있다.
또한, 상기 기포를 제거하는 것은, 상기 폴리디메틸실록산이 주입된 어레이를 진공챔버에 넣어서, 상기 폴리디메틸실록산 안의 기포를 제거하는 것이 가능하다.
도 6은 본 발명에 따라 PDMS로 이루어진 몸체를 가지는 체외 배양기의 제조방법 일례를 설명하기 위한 흐름도이다.
여기에 도시된 본원의 제 4 측면은, 액상 폴리디메틸실록산과 경화제를 혼합하여 혼합액을 준비하는 단계(S110); 상기 준비한 혼합액에서 기포를 제거하는 단계(S120); 및 상기 기포를 제거한 혼합액을 하나 이상의 웰 형성 구조물을 가지는 성형틀에 부어서 경화시키는 단계(S130);를 포함하는 것을 특징으로 하는, 수정란의 체외 배양기 제조방법이다.
즉, 본원의 체외 배양기 제조방법은, 액상 폴리디메틸실록산과 경화제를 혼합하여 혼합액을 제조하고, 상기 혼합액으로부터 기포를 제거하며, 상기 혼합액을 경화시켜서 웰을 가지는 고형 몸체를 형성하는 것이 가능하다.
상기 폴리디메틸실록산(PDMS)은 유동성을 갖는 물질로서 상기 경화제에 의해 상온이나 고온에서 시간이 경과함에 따라 경화되어 고형화하는 성질을 가지며, 경화제와 일정 비율로 혼합되어 PDMS 혼합물 상태로 틀에 공급되고 경화될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 PDMS 혼합물은 상기 틀의 형태에 따라 다양한 형태의 고형 몸체로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 웰의 바닥 또는 벽면에 수정란 수납부로서 홈이 더 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 경화제는 특별히 제한되지 않을 수 있으며, 당업계에서 PDMS와 같은 실리콘의 경화를 위해 사용되는 경화제 중에서 통상의 기술자가 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 액상 폴리디메틸실록산과 경화제는 약 50:1 내지 2:1의 중량비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 액상 폴리디메틸실록산과 경화제는 약 30:1 내지 2:1, 약 20:1 내지 2:1, 약 10:1 내지 2:1, 약 5:1 내지 2:1, 약 50:1 내지 5:1, 약 50:1 내지 10:1, 약 50:1 내지 20:1, 약 30:1 내지 5:1, 또는 약 10:1의 중량비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 PDMS는 상온 또는 고온에서 경화될 수 있으며, 고온의 경우 오븐, 웜 플레이트(warm plate) 및 핫 플레이트 (hot plate) 등을 포함하는 가열 장치를 이용하여 경화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있고, 온도가 높아짐에 따라 경화시간이 단축될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 혼합액으로부터 기포를 제거하는 것은 진공 펌프를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 당업계에서 액상 용액 등으로부터 기포를 제거하기 위해 사용되는 방법이라면 제한 없이 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어서, 상기 기포를 제거하는 것은, 상기 준비한 혼합액을 진공챔버에 넣어서, 상기 폴리디메틸실록산 안의 기포를 제거하는 것이 가능하다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 경화는 약 60℃ 내지 100℃의 온도에서 약 1 시간 내지 5 시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 경화는 약 60℃ 내지 90℃, 약 60℃ 내지 80℃, 약 60℃ 내지 70℃, 약 70℃ 내지 100℃, 약 80℃ 내지 100℃, 약 90℃ 내지 100℃, 약 80℃ 내지 90℃, 또는 약 85℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 경화는 약 1 시간 내지 4 시간, 약 1 시간 내지 3 시간, 약 1 시간 내지 2 시간, 약 2 시간 내지 5 시간, 약 3 시간 내지 5 시간, 약 4 시간 내지 5 시간, 약 2 시간 내지 3 시간, 또는 약 2 시간 30 분 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 배양기의 제조방법은 상기 고형 몸체의 멸균 공정을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 멸균 공정은 수정란의 체외 배양시 외부 세균, 바이러스 또는 오염물에 의한 오염을 방지하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 멸균 공정은 당업계에서 사용되는 멸균 공정을 제한 없이 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 자외선 조사, 방사선 조사, 열처리, 약품 처리 또는 오토클레이브 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 성형틀은 2개 이상의 웰 형성 구조물을 가지며, 본 발명은 상기 경화시킨 경화물을 상기 성형틀로부터 분리하고, 상기 분리한 경화물을 웰 단위로 잘라내는 단계;를 더 포함하는 것이 가능하다. 예를 들어, 웰(110)이 복수개 형성된 상기 고형 몸체(100)는 이후 하나의 웰(110)을 포함하는 크기로 절단 또는 분리되어 수정란의 체외 배양을 위해 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 5 측면은, 상기한 체외 배양기의 웰 안에 수정란을 주입하는 단계; 및 상기 수정란을 배양하는 단계;를 포함하는, 수정란의 체외 배양 방법이다.
즉, 본 발명은 폴리디메틸실록산으로 이루어진 세포 배양기에서 배지의 존재하에 수정란을 배반포기까지 배양하는 것을 포함하는 수정란의 체외 배양 방법을 제공할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
배반포기까지 배양된 수정란은 동물의 자궁 내에 이식되거나 또는 줄기세포의 추출을 위해 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 동물은 상기 수정란의 유래 동물과 동일하거나 상이할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 수정란의 체외 배양 방법은 1-세포기 수정란을 배반포기까지 배양하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 수정란의 발달 단계 중 어느 단계에서도 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 수정란이 4-세포기에 도달한 후 BSA가 첨가된 배지로 교체하여 배반포기까지 배양될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 배지는 M16 배지를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 당업계에서 수정란의 배양을 위해 사용되는 배지라면 제한 없이 선택하여 사용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 수정란의 배양 방법은 폴리디메틸실록산으로 이루어진 세포 배양기를 사용하지 않은 방법에 비해 배반포 형성율이 상승된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 재료 및 방법
1.1. 동물
본 실시예에서는 ICR 마우스 암컷 9 주령과 ICR 마우스 수컷 9 주령을 사용하였으며, 모든 마우스는 대한바이오링크에서 구입하였다. 모든 동물 실험은 강원대학교 동물실험윤리위원회의 승인 (No:KW-170117-1)을 얻어 지침에 따라 수행되었다.
1.2. PDMS가 코팅된 플라스틱 배양 접시 제작
PDMS가 코팅된 플라스틱 배양 접시 제작의 개략도는 도 2에 나타나 있다. 구체적으로, 실리콘의 일종인 PDMS(폴리디메틸실록산, polydimethylsiloxane; Dowdoring, 서울)는 경화제와 10:1 (wt/wt) 비율로 혼합하였으며, 상기 PDMS 혼합액은 스포이드를 이용하여 4-웰 접시 바닥 전체에 도포하였다. 이어서, 진공 펌프가 연결된 용기에 PDMS 용액이 도포된 4-웰 접시를 넣고 진공을 걸어주어, PDMS 용액에 포함된 기포를 제거하였다. 기포가 제거된 PDMS는 85℃ 핫 플레이트 위에서 2 시간 동안 경화시켰다. 완전히 경화된, PDMS가 코팅된 4-웰 접시는 UV 아래에서 15 분 동안 처리하여 멸균한 후, 수정란의 체외 배양에 사용하였다.
1.3. PDMS 배양 접시 제작
PDMS 재질의 배양 접시 제작의 개략도는 도 3에 나타나 있다. 구체적으로, PDMS는 경화제와 10:1 (wt/wt) 비율로 혼합하였으며, 상기 혼합액을 진공 펌프가 연결된 용기 안에 넣어 진공 처리함으로써 혼합액 내의 기포를 제거하였다. 기포가 제거된 혼합액은 도 4a (편평한 바닥을 가지는 배양 접시) 및 도 4b (실린더 모양 구멍을 가지는 배양 접시)에서 제시된 규격으로 제작된 배양 접시 틀에 충진하였고, 이어서 85℃ 핫 플레이트 위에서 2 시간 30 분 동안 경화하였다. 완전히 경화된 PDMS는 틀에서 분리되었고, UV를 이용하여 멸균 처리되었으며, 이후 수정란의 체외 배양에 사용하였다.
1.4. 실험설계
수정란의 체외 배양 효율에 대한 배양 접시의 재질 내지 코팅 재질 간의 차이를 확인하고 최적 효율을 나타내는 배양 접시의 제작 재료를 확인하기 위해, 플라스틱 4-웰 배양 접시 (플라스틱), 플라스틱 없이 PDMS만을 이용해 제작된 배양 접시 (PDMS) 및 PDMS가 코팅된 플라스틱 4-웰 배양 접시 (PDMS+플라스틱) 상에서 체내수정란 및 체외수정란을 각각 체외 배양하였다. 5 일 동안 체외 배양을 실시 한 후, 각각의 실험군들에서 배반포 형성 효율이 평가하였다. 또한, 수정란의 체외 배양 효율 향상에 최적화된 PDMS 배양 접시의 바닥 구조를 확인하기 위해, 체내수정란과 체외수정란은 편평한 구조를 가지고 있는 PDMS 배양 접시 (편평바닥)와 실린더 모양의 구멍을 가지고 있는 PDMS 배양 접시 (실린더 모양 구멍)에서 5 일 동안 체외 배양하였고, 각각의 실험군들에서 배반포 형성 효율이 평가하였다.
1.5. 체내수정란 생산
마우스 암컷에서 과배란을 유도하기 위해, 9 주령 ICR 마우스 암컷에게 5 IU PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadopropin; Sigma-Aldrich)를 복강 내 주사하였고, 48 시간 후 동일한 마우스 암컷에게 5IU hCG (human chorionic gonadotropin; LG 생명과학)를 복강 내 주사하였다. 이후, 과배란이 유도된 마우스 암컷을 9 주령 ICR 마우스 수컷과 교배하였으며, 교배 성공 여부는 마우스 암컷 생식기에 제니탈 플러그(genital plug) 존재 여부를 통해 확인하였다. 마우스 암컷에게 hCG를 주사한지 18 시간 후, 상기 마우스 암컷을 경추탈골로 희생시키고, 난관을 떼어 미리 37℃로 데워둔 0.5% (wt/v) BSA (bovine serum albumin)가 함유된 PBS (phosphate buffered saline)에 넣어주었다. 떼어낸 난관은 37℃ 핫 플레이트 위에서 M2 배지 (Sigma-Aldrich) 2 ml이 들어 있는 페트리 접시에 옮겨졌고, 포셉을 이용해 난관팽대부를 찢어 난모-난구세포 복합체 (COCs; cumulus-oocyte cell complex)를 회수하였다. 모세관 피펫을 이용하여 난관팽대부에서 나온 수정란들을 M2 배지에 0.2%(wt/v)로 희석된 히알루로니다제(hyaluronidase)로 옮겨 1 분간 처리함으로써, 수정란 주변의 난구세포들을 완전히 제거하였다. 이후, 실체현미경 하에서 전핵과 제2극체를 동시에 가지고 있는 수정란만을 선별하였고, 이들을 체외배양에 이용하였다.
1.6. 체외수정란 생산
성숙난자들은 다음과 같이 준비하였다: 9 주령 ICR 마우스 암컷에게 5 IU PMSG (Sigma-Aldrich)를 복강 내 주사하였고, 48 시간 후 동일한 마우스 암컷에게 5 IU hCG (LG 생명과학)를 복강 내 주사하였다. 마우스 암컷에게 hCG를 주사한지 16 시간 후, 상기 마우스 암컷을 경추탈골로 희생시키고, 난관을 떼어 미리 37℃로 데워둔 0.5% (wt/v) BSA가 함유된 PBS에 넣어주었다. 떼어낸 난관은 37℃ 핫 플레이트 위에서 M2 배지 (Sigma-Aldrich) 2 ml이 들어 있는 페트리 접시에 옮겼고, 포셉을 이용해 난관팽대부를 찢어 난모-난구세포 복합체를 회수하였다. 성숙정자들은 다음과 같이 준비하였다: 9 주령 ICR 마우스 수컷을 경추탈골로 희생시킨 후, 상기 마우스 수컷의 정소상체를 떼어 0.5% (wt/v) BSA가 첨가된 PBS에 넣어주었다. 37℃ 핫 플레이트 위에서 포셉을 이용하여 정소상체에 붙은 지방을 제거한 후, 새로운 PBS에 옮겨 주었다. 지방이 제거된 정소상체는 2.7 mM 칼슘이 첨가된 M16 배지 2 ml을 넣은 페트리 접시로 옮긴 후, 37℃, 5% CO2 조건하에서 정소상체 미부를 찢고 20 분간 정치함으로써 성숙된 정자가 정소상체 미부로부터 빠져 나올 수 있도록 하였다. 정소상체 미부에서 빠져 나온 성숙정자들은 37℃, 5% CO2 조건하에서 2.7 mM 칼슘이 첨가된 M16 배지에서 추가적으로 90 분간 배양함으로써 수정능 획득을 유도하였다. 수정능 획득이 이루어진 성숙정자들의 총 수는 혈구계산판을 이용하여 측정하였다. 성숙난자와 성숙정자를 이용한 체외 수정은 다음과 같이 수행하였다. 37℃, 5% CO2 조건하에서 5 X 105 개의 성숙 정자들은 난모-난구세포 복합체가 들어있는 M16 배지에서 6 시간 동안 배양하였다. 이후, 실체현미경 하에서 전핵과 제2극체를 동시에 가지고 있는 수정란만을 선별하였고, 이들을 체외배양에 이용하였다.
1.7. 체외 배양
상기와 같이 회수된 수정란들을 본 실시예에서 준비한 배양 접시에서 M16 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 배양 48 시간 후에 4-세포기까지 발달한 수정란들은 3 mg/ml BSA를 추가로 넣은 M16 배지로 옮겼다. 이후, 4-세포기 수정란들은 배양액 교체 없이 72 시간 동안 추가적으로 배양하였다.
1.8. 통계분석
본 실시예의 모든 실험 결과들은 SAS (Statistical Analysis System) 프로그램 내 일반선형모형 (PROC-GLM)을 사용하여 통계 분석을 실시하였으며, SAS 패키지에 포함되어있는 ANOVA (analysis of varience) 방법을 이용하여 각 실험에 대한 유의성 검정을 수행하였다. 이후, 처리구들 간에 유의적인 차이는 최소자승 (least-square) 혹은 DUNCAN 방법을 이용하여 측정하였다. 또한, p 값이 5% 미만일 때, 처리구 간 유의성을 검정하였다.
2. 결과
2.1. 체내수정란 배양 결과
상기에서 설명된 방법에 의해 과배란 유도된 암컷 ICR 마우스를 수컷 ICR 마우스와 교배시킨 후 체내에서 생산된 수정란들을 회수하였다. 이후, 회수된 체내수정란들은 기존에 배양 접시의 재질로 널리 사용되던 플라스틱을 이용하여 제작된 배양 접시 (대조군, 플라스틱), PDMS를 이용하여 제작된 배양 접시 (PDMS), 및 플라스틱을 이용하여 제작된 배양 접시 바닥에 PDMS를 코팅한 배양 접시 (플라스틱 + PDMS)에서 각각 37℃, 5% CO2 조건하에서 5 일간 배양하였다.
아래의 표 1에 나타난 것처럼, 2-세포 발달률의 경우 [PDMS]와 [플라스틱]에서 배양된 체내수정란이 [플라스틱 + PDMS]에서 배양된 것보다 높은 발달율을 보였다. 또한, 4-세포 발달률의 경우, [PDMS]와 [플라스틱 + PDMS]에서 배양된 체내수정란이 [플라스틱]에서 배양된 것보다 높은 발달율을 보였다.
그러나, 배반포 형성율을 비교했을때는 그 결과가 달라졌다. 즉, [PDMS]에서 배양된 체내수정란이 유의적으로 가장 높은 배반포 형성율을 보여주었다. 그리고, [플라스틱]에서 배양된 체내수정란은 배반포를 형성하지 못하였으며, [플라스틱 + PDMS]에서 배양된 체내수정란은 [플라스틱]에서 배양된 체내수정란보다 유의적으로 높은 배반포 형성율을 보여주었다.
Figure 112017080883661-pat00001
이러한 결과들은 체내수정란의 체외배양시 기존에 배양 접시의 재질로서 사용되던 플라스틱보다 PDMS와 같은 실리콘 재질의 배양 접시를 사용하는 경우 배반포 생산 효율을 크게 향상시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
이후, 수정란 체외 배양에 효율적인 PDMS 재질 배양 접시의 바닥 구조를 확인하기 위해, 편평한 바닥 구조의 PDMS 배양 접시 (편평바닥)와 실린더 모양의 구멍을 가지고 있는 PDMS 배양 접시 (실린더 모양 구멍) 각각에서 체내수정란을 37℃, 5% CO2 조건하에서 5 일간 배양하였다.
아래의 표 2에 나타난 것처럼, [편평바닥]과 [실린더 모양 구멍]의 구조를 가지는 PDMS 배양 접시에서 배양된 체내수정란은 2-세포 발달률에 있어서는 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 체내수정란의 4-세포 및 배반포 발달률은 편평한 바닥 구조를 가진 PDMS 배양 접시보다는 실린더 모양의 구멍 구조를 가진 PDMS 배양 접시에서 유의적으로 높았다.
Figure 112017080883661-pat00002
이러한 결과들은 실린더 모양의 구멍 구조를 가진 PDMS 배양 접시를 사용하는 것이 체내수정란 유래 배반포 생산 효율을 크게 향상시킬 수 있음을 설명해 주고 있다. 그래서, 실린더 모양의 구멍 구조를 가진 실리콘 배양 접시는 체내수정란으로부터 배반포를 대량으로 생산하는 데에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
2.2. 체외수정란 배양 결과
상기에서 설명된 방법에 의해 과배란 유도된 암컷 ICR 마우스로부터 회수된 성숙난자들과 수컷 ICR 마우스의 정소상체로부터 회수된 성숙정자들을 체외에서 수정시켜 체외수정란을 생산하였다. 이후, 생산된 체외수정란들은 기존에 배양 접시의 재질로 널리 사용되던 플라스틱을 이용하여 제작된 배양 접시 (대조군, 플라스틱), PDMS를 이용하여 제작된 배양 접시 (PDMS), 및 플라스틱을 이용하여 제작된 배양 접시 바닥에 PDMS를 코팅한 배양 접시 (플라스틱 + PDMS)에서 각각 37℃, 5% CO2 조건하에서 5 일간 배양되었다.
아래의 표 3에 나타난 것처럼, 2-세포 발달률의 경우 [플라스틱]과 [플라스틱 + PDMS]에서 배양된 체외수정란은 [PDMS]에서 배양된 체외수정란보다 유의적으로 높은 2-세포 발달률을 보여주었다. 또한, 4-세포 발달률의 경우 [플라스틱 + PDMS]에서 배양된 체외수정란은 [플라스틱]과 [PDMS]에서 배양된 체외수정란의 그것보다 유의적으로 낮았다.
그러나, 배반포 형성율에 있어서는 [PDMS]에서 배양된 체외수정란이 [플라스틱 + PDMS]에서 배양된 체외수정란의 배반포 형성율보다 유의적으로 높았다. 그리고, [플라스틱]에서 배양된 체외수정란은 배반포를 형성하지 못하였다.
Figure 112017080883661-pat00003
이러한 결과들은 체외수정란의 체외배양시 기존에 배양 접시의 재질로서 사용되던 플라스틱보다 PDMS와 같은 실리콘 재질의 배양 접시를 사용하는 경우 배반포 생산 효율을 크게 향상시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
이후, 수정란 체외 배양에 효율적인 PDMS 재질 배양 접시의 바닥 구조를 확인하기 위해, 편평한 바닥 구조의 PDMS 배양 접시 (편평바닥)와 실린더 모양의 구멍을 가지고 있는 PDMS 배양 접시 (실린더 모양 구멍) 각각에서 체외수정란을 37℃, 5% CO2 조건하에서 5 일간 배양하였다.
아래의 표 4에 나타난 것처럼, 편평한 바닥과 실린더 모양의 구멍을 가지는 바닥 구조의 PDMS 배양 접시에서 배양된 체외수정란은 2-세포 및 4-세포 발달률에 있어서는 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 체외수정란의 배반포 도달률은 편평한 바닥 구조의 PDMS 배양 접시보다는 실린더 모양의 구멍을 가지는 바닥 구조의 PDMS 배양 접시에서 유의적으로 높았다.
Figure 112017080883661-pat00004
이러한 결과들은 실린더 모양의 구멍을 가지는 바닥 구조의 PDMS 배양 접시를 사용하는 것이 체외수정란 유래 배반포 생산 효율을 크게 향상 시킬 수 있음을 설명해 주고 있다. 또한, 실린더 모양의 구멍 구조를 가진 실리콘 배양 접시는 체외수정란으로부터 배반포를 대량으로 생산하는 데에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
1 : 체외 배양기
10 : 어레이
11 : 웰
20 : 바닥면
30 : 홈
100 : 몸체
110 : 웰

Claims (21)

  1. 하나 이상의 웰(well)이 형성된 어레이(array); 및
    상기 웰 안에 형성된 것으로, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane:PDMS)으로 이루어진 바닥면을 포함하고,
    상기 웰은 상단 직경과 하단 직경이 동일하고, 바닥면과 측면이 수직을 이루는 원통형으로 구성되며, 8mm 내지 12mm 범위 내의 폭과 높이를 가지고, 바닥면에는 수정란 수납부로서 홈(groove)이 형성된 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 웰은 고형 몸체에 어레이 형태로 복수개가 형성되는 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 홈(groove)은 실린더 형상인 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 바닥면은 폴리디메틸실록산(PDMS)이 경화되어 이루어진 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기.
  9. 삭제
  10. 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane)으로 이루어지는 고형 몸체; 및
    상기 고형 몸체에 형성된 웰(well)을 포함하고,
    상기 웰은 상단 직경과 하단 직경이 동일하고, 바닥면과 측면이 수직을 이루는 원통형으로 구성되며, 8mm 내지 12mm 범위 내의 폭과 높이를 가지고, 바닥면에는 수정란 수납부로서 홈(groove)이 형성된 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기.
  11. 삭제
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 홈(groove)은 실린더 형상인 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기.
  13. 삭제
  14. 하나 이상의 웰(well)이 형성된 어레이(array)를 준비하는 단계; 및
    상기 준비한 어레이의 웰 안에 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 이루어진 바닥면을 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 웰은 상단 직경과 하단 직경이 동일하고, 바닥면과 측면이 수직을 이루는 원통형으로 구성되며, 8mm 내지 12mm 범위 내의 폭과 높이를 가지고, 바닥면에는 수정란 수납부로서 홈(groove)이 형성된 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기 제조방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 바닥면을 형성하는 단계는,
    상기 준비한 어레이의 웰 안에 액상의 폴리디메틸실록산(PDMS)을 주입하는 단계;
    상기 주입한 폴리디메틸실록산 안의 기포를 제거하는 단계; 및
    상기 기포를 제거한 폴리디메틸실록산을 경화시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기 제조방법.
  16. 삭제
  17. 액상 폴리디메틸실록산과 경화제를 혼합하여 혼합액을 준비하는 단계;
    상기 준비한 혼합액에서 기포를 제거하는 단계; 및
    상기 기포를 제거한 혼합액을 하나 이상의 웰 형성 구조물을 가지는 성형틀에 부어서 경화시키는 단계를 포함하고,
    상기 웰은 상단 직경과 하단 직경이 동일하고, 바닥면과 측면이 수직을 이루는 원통형으로 구성되며, 8mm 내지 12mm 범위 내의 폭과 높이를 가지고, 바닥면에는 수정란 수납부로서 홈(groove)이 형성된 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기 제조방법.
  18. 삭제
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 성형틀은 2개 이상의 웰 형성 구조물을 가지며,
    상기 경화시킨 경화물을 상기 성형틀로부터 분리하고, 상기 분리한 경화물을 웰 단위로 잘라내는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 수정란의 배반포 형성용 체외 배양기 제조방법.
  20. 제 1 항에 따른 체외 배양기의 웰 안에 수정란을 주입하는 단계; 및
    상기 수정란을 배반포기까지 배양하는 단계;를 포함하는, 수정란의 체외 배양방법.
  21. 삭제
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