CN107460208A - 哺乳动物体细胞克隆方法和使用的培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种哺乳动物例如牛或犬或羊的体细胞克隆方法和使用的培养液。其中哺乳动物体细胞克隆的方法包括以下处理哺乳动物体细胞克隆胚的步骤：1)将待移植的哺乳动物体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后1h，挑选成功融合的哺乳动物体细胞克隆胚进行激活处理；2)哺乳动物体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到G1.3培养液中进行培养。还涉及上述方法中使用的培养液。本发明方法呈现如说明书所述优异技术效果。
Description
技术领域
本发明属于动物特别是哺乳动物体细胞克隆技术领域，涉及一种哺乳动物体细胞克隆胚的处理方法，例如涉及一种牛或犬体细胞克隆胚的处理方法，特别是涉及一种基于体细胞核移植构建的哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的处理方法。本发明哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的处理方法能够克服现有技术中存在的一种或多种缺陷并且呈现如本发明的述一个或多个方面的优点。
背景技术
哺乳动物体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆，疾病模型，人类器官移植，动物转基因研究，频临灭绝动物品种保护，优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。
目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体哺乳动物体细胞核没有被受体卵胞质完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白乙酰化和DNA甲基化两方面。
(2E)-5-[3-(Phenylsulfonylamino)phenyl]-pent-2-en-4-ynohydroxamicacid，中文名：(2E)-5-[3-(苯基磺酰基氨基)苯基]-戊-2-烯-4-炔异羟肟酸，又称为Oxamflatin，CAS151720-43-3，其是一种表观遗传修饰药物，是去组蛋白乙酰化酶的抑制剂。(2E)-5-[3-(Phenylsulfonylamino)phenyl]-pent-2-en-4-ynohydroxamic acid的化学结构式如下：
Oxamflatin为羟肟酸rC(OH)＝NOH的异构体。具微酸性，微溶于水。易水解为羧酸与羟胺。加热时发生洛森重排成异氰酸酯。与高价金属如铁等形成深色络合物。用酯与羟胺反应制取。Oxamflatin可以抑制去组蛋白乙酰化酶，从而提高组蛋白乙酰化水平。Oxamflatin已经有应用于肿瘤治疗的临床报道。
现有技术已有诸多关于哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的方法，然而这些技术仍然存在一种或多种技术缺陷。因此，本领域仍然期待有新的方法进行哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚，例如仍然期待有新的方法进行哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的方法，例如基于体细胞核移植构建。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种新的方法来处理哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚，例如提供一种基于体细胞核移植构建的处理哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的方法，例如，在哺乳动物例如牛或犬体细胞注入去核的卵母细胞并进行电融合之后，对融合后的牛或犬克隆胚用(2E)-5-[3-(苯基磺酰基氨基)苯基]-戊-2-烯-4-炔异羟肟酸进行处理，提高哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆囊胚质量和发育率。本发明人出人意料的发现，通过使用本发明方法能够解决一种或多种现有技术中存在的不足。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种哺乳动物体细胞克隆方法，该方法包括以下处理哺乳动物体细胞克隆胚的步骤：
1)将待移植的哺乳动物体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后1h，挑选成功融合的哺乳动物体细胞克隆胚进行以下激活处理：首先在含5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含2mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h；[6-DMAP系6-二甲基氨基嘌呤的简称]
2)哺乳动物体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含0.5～1.5μmol/L(例如1μmol/L)Oxamflatin的G1.3培养液中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4～12h(例如8h)，再用G1.3培养液清洗多次，继续在G1.3培养液中培养至72h；然后将哺乳动物体细胞克隆胚转移到G2.3培养液中继续在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养至第7d。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述哺乳动物选自牛、羊、犬、马、猪。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤1)中进行激活处理时，所用的mSOF溶液中与Oxamflatin一起还增补添加了相对于Oxamflatin而言4摩尔倍量的GC，并且还增补添加了相对于Oxamflatin而言2摩尔倍量的SS。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤2)中进行培养时，所用的G1.3培养液中与Oxamflatin一起还增补添加了相对于Oxamflatin而言4摩尔倍量的GC，并且还增补添加了相对于Oxamflatin而言2摩尔倍量的SS。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞克隆胚是通过基于体细胞核移植构建的。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，还包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞克隆胚在进行激活处理或培养时，Oxamflatin的浓度均为1μmol/L。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中激活处理和培养处理的总体时间为10～12h。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述的作为培养基的G1.3培养液上还覆盖有石蜡油，并预先在CO2培养箱中平衡至少2h。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述的G1.3培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚哺乳动物体细胞克隆胚。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述的去核后的卵母细胞的制备为：在去核前，卵母细胞先在含有7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342和体积浓度10％FBS的PBS溶液中孵育15min；然后在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团从而检查去核情况；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞应用于核移植。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述的哺乳动物体细胞注入后的电融合的操作为：挑选直径为15～20μm的待移植的哺乳动物体细胞，注入到去核的卵母细胞透明带下；在进行电融合前，重构体在电融合液中预平衡3min；将重构体的供体、作为受体的去核的卵母细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时为20μs、2次脉冲间隔10ms。
进一步的，本发明第二方面提供了一种在哺乳动物体细胞克隆方法的体细胞克隆胚激活过程中使用的培养液，其为包含2mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液。在一个实施方案中，所述mSOF溶液中与Oxamflatin一起还增补添加了相对于Oxamflatin而言4摩尔倍量的GC，并且还增补添加了相对于Oxamflatin而言2摩尔倍量的SS。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的培养液，其中所述哺乳动物体细胞克隆方法如本发明第一方面任一实施方案所述。
进一步的，本发明第三方面提供了一种在哺乳动物体细胞克隆方法的体细胞克隆胚体外培养过程中使用的培养液，其为包含0.5～1.5μmol/L(例如1μmol/L)Oxamflatin的G1.3培养液。在一个实施方案中，所述G1.3培养液中与Oxamflatin一起还增补添加了相对于Oxamflatin而言4摩尔倍量的GC，并且还增补添加了相对于Oxamflatin而言2摩尔倍量的SS。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养液，其中所述哺乳动物体细胞克隆方法如本发明第一方面任一实施方案所述。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
如本发明试验中使用到的，离子霉素(Ionomycin)是一种来源于Streptomycesconglobatus的聚醚类窄谱抗生素，有效作用于G+菌。常用作一种有效的钙离子载体，高度选择性结合钙离子(Ca2+>Mg2+>>Sr2+＝Ba2+)。是一种可动离子载体，通过直接刺激钙池调控钙内流(Store-operated calcium entry)跨越生物膜而增强钙离子内流。离子霉素可动员细胞内钙离子存储，提高胞内钙离子水平，刺激胞内细胞因子的产生，因此常作为一种工具用以钙离子介导的细胞内信号转导研究。细胞信号通路研究中，Ionomycin常与PMA联合使用刺激细胞产生细胞因子，以及与蛋白转运抑制剂如Monensin和Brefeldin A连用研究细胞因子在细胞内的滞留等。
本发明呈现出如下有益的技术效果：本发明提供的基于体细胞核移植构建的哺乳动物例如牛、羊、犬、马、猪体细胞克隆胚的处理方法，在重构体构建完成后，利用Oxamflatin对重构体进行抑制去组蛋白乙酰化酶的处理，可以显著提高哺乳动物例如牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产哺乳动物例如牛体细胞克隆胚胎。与不含Oxamflatin的对照组相比，利用1μM的Oxamflatin处理之后，所得到的囊胚发育率达40.8％，可显著提高囊胚的发育率。1μM的Oxamflatin处理哺乳动物例如牛体细胞克隆胚胎12h可以显著提高囊胚的细胞总数、内细胞团细胞数和ICM∶TE的比值。哺乳动物例如牛体细胞克隆囊胚的细胞总数显著高于对照组(P<0.05)；囊胚的内细胞团细胞数显著高于对照组(P<0.05)；囊胚的内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值显著高于对照组(P<0.05)。而且，1μM的Oxamflatin处理哺乳动物例如牛体细胞克隆胚胎12h可以显著降低囊胚的凋亡细胞数。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明在哺乳动物体细胞克隆方法中，提供的基于体细胞核移植构建的哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的处理方法，在重构体构建完成后，利用Oxamflatin对重构体进行抑制去组蛋白乙酰化酶的处理，可以显著提高哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚胎。
试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备
本发明所用的一些常规试剂、培养液、处理液等可从市面上购得，或者可以采用常规方法配制得到。例如，Oxamflatin、DMSO、胰蛋白酶、EDTA、青霉素、链霉素、无机盐、石蜡油为Sigma公司产品，DMEM/F12液体培养基和特级胎牛血清(FBS)为Giboco产品，胚胎培养液G1.3、G2.3均购买于Vitrolife公司。其他未标明的均为Sigma公司产品。
a、卵母细胞体外成熟培养液
成熟培养液为TCM199液中添加2.2mg/mL NaHCO3、0.075IU/mLHMG、1μg/mL 17β-E2、0.33mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺以及100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
b、mSOF溶液
mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，还包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；
c、电融合液
电融合液的组成为：0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1％BSA。
d、Oxamflatin储存液和工作液体的配置
i)浓度为10mM的Oxamflatin浓储存液：
称取1mg的Oxamflatin于灭菌的1.5ml离心管中，加入291μL的DMSO后混匀，储存于-20℃冰箱待用。
ii)浓度为100μM的Oxamflatin储存液：
用移液枪取990μL的mSOF于灭菌的的1.5ml离心管中，然后添加10μL浓度为10mM的Oxamflatin浓储存液，混匀，即得浓度为100μM的Oxamflatin储存液。
iii)浓度为1μM的Oxamflatin工作液：
取1μL浓度为100μM的Oxamflatin储存液，分别加入到99μL胚胎激活液(其中含有1.9mM 6-DMAP的mSOF)中和99μL胚胎培养液G1.3中，得到两种Oxamflatin工作液。这些Oxamflatin工作液可放于4℃，一周内使用。
e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置
本试验配制包含甘油(在本发明中可缩写为GC)和/或蔗糖(在本发明中可缩写为SS)的Oxamflatin储存液和工作液。参照上述“d、Oxamflatin储存液和工作液体的配置”的方法，在浓度10mM的Oxamflatin浓储存液中同添加50mM的GC和/或20mM的SS，分别得到：增补4倍量(相对于Oxamflatin而言的摩尔倍，下同)GC的Oxamflatin浓储存液、增补2倍量SS的Oxamflatin浓储存液、增补4倍量GC和增补2倍量SS的Oxamflatin浓储存液三种浓储存液。继续操作得到增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液，以及增补GC和/或SS的Oxamflatin工作液。
试验二、体细胞核移植技术生产牛克隆胚胎的制备
已有文献资料公开了哺乳动物体细胞克隆方法中，基于体细胞核移植构建的哺乳动物牛体细胞克隆胚的处理方法，这些方法的操作及其部分结果详述如下。
a.牛胎儿成纤维细胞的培养
从液氮中取一管荷斯坦奶牛的2-5代的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻，加0.8ml的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO2培养箱中38.5℃条件下培养。
待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1：3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养。
b.卵母细胞的成熟培养
牛卵巢采自屠宰场，将卵巢置于含青、链霉素的20～25℃的生理盐水保温瓶中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在高压过的无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含5～15％血清的PBS中清洗三遍。选择形态正常的A、B级卵母细胞用于体外成熟培养。A级卵母细胞为胞质均匀、卵丘细胞致密、最少有5层卵丘细胞完全包裹的卵母细胞；B级卵母细胞的卵丘细胞为2～4层，基本上包裹卵母细胞。
将采集的COCs在成熟液中洗两遍，然后移入装有3毫升成熟液的3cm平皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24-26h。将培养成熟的卵母细胞用PBS液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+的PBS中消化1-2min，并用1000ml移液枪反复吹打COCs，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞挑选有极体的卵母细胞待用。
c.牛体细胞克隆胚的构建
去核：去核前卵母细胞先在含7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342和10％FBS的PBS中孵育15min。在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的部分卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况。完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。
注核和电融合：注核时挑选直径为15～20μm的细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注核后的重组体采用微电极的方法进行融合。融合前，重构体在电融合液中预平衡3min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z”字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组体的供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时长20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1h在显微镜下观察融合情况。
d.牛体细胞克隆胚融合后的处理
为了检测Oxamflatin的处理效果，同时设不加Oxamflatin的对照组，其余操作方法相同。
处理组：分别在含有2mmol/L的6-DMAP的mSOF中添加1μM的Oxamflatin工作液，以及在G1.3中添加1μM的Oxamflatin工作液。对照组不加。
牛体细胞克隆胚的激活：在电融合之后1～2h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处理(用离子霉素(Ionomycin)联合6-DMAP激活)：首先在含2～5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含1～2mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液(本文“试验一”之“d、Oxamflatin储存液和工作液体的配置”之“iii)浓度为1μM的Oxamflatin工作液”中制得)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h。
牛克隆胚的体外培养：牛体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含1μmol/L的Oxamflatin的G1.3培养液(本文“试验一”之“d、Oxamflatin储存液和工作液体的配置”之“iii)浓度为1μM的Oxamflatin工作液”中制得)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养8h，G1.3培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚；再用G1.3培养液清洗多次，继续在G1.3培养液中培养至72h；然后将牛体细胞克隆胚转移到G2.3培养液中继续在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。
所述的作为培养基的G1.3培养液上还覆盖有石蜡油(Sigma，M8410)，并预先在CO2培养箱中平衡至少2h。
对照组用不加Oxamflatin的G1.3培养液进行培养。培养48h后记录卵裂数，第7d记录囊胚发育情况。文献CN102296090B之图1记载了牛体细胞克隆囊胚的显微视图，为体外培养后7d的显示结果。
与对照组相比，利用Oxamflatin对重构体进行处理后，可以显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎。具体表现为：
1)牛体细胞克隆囊胚的发育率：
文献CN102296090B之表1记载了不同浓度的Oxamflatin对牛体细胞克隆胚胎发育的影响，可以看出1μM浓度Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎12个小时，可显著提高囊胚的发育率(40.81±1.18％VS 30.34±0.83％，P<0.05)。例如，其中0μM、0.05μM、1μM三种不同浓度Oxamflatin组在2-细胞期胚胎数和4-细胞期胚胎数方面没有统计学差异，但是当Oxamflatin过高达到5μM时2-细胞期胚胎数和4-细胞期胚胎数与对照组相比显著降低；在桑椹胚率和囊胚率方面Oxamflatin浓度过低或者浓度过高均不能显著提高，只在中等浓度即1μM浓度的Oxamflatin时才能与对照组相比显著提高桑椹胚率和囊胚率。例如该文献记载0μM、0.05μM、1μM、5μM四种不同浓度Oxamflatin组的桑椹胚率均值分别为40.11％、38.74％、48.83％、9.56％，而0μM、0.05μM、1μM、5μM四种不同浓度Oxamflatin组的囊胚发率率均值分别为30.34％、29.55％、40.81％、5.84％。在进行试验时，每个处理浓度的实验都重复四次。以四次重复实验的胚胎总数以及由此计算得到的发育率(mean±SEM％)来统计试验结果。2-细胞期胚胎、4-细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚的发育率分别在重组胚培养48、72、120、和168h检测(0h代表胚胎激活后转入G1.3的时候)。
2)Oxamflatin处理时间(包括激活和培养的时间总和)：
分别用1μM的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎0、6、12、18和24h，所得到的囊胚发育率分别为29.05±2.31％、30.64±0.78％、40.81±1.18％、34.34±1.24％和31.04±2.61％，故处理的最佳时间为12h。
3)牛体细胞克隆囊胚的细胞数的试验结果：
如上述文献之表2所示的对照组和处理组的牛体细胞克隆囊胚的细胞数统计结果，以及上述文献之图2所示的Oxamflatin处理与对照相比的牛体细胞克隆胚的细胞数显微分析结果，其中蓝色细胞为DAPI染色的囊胚细胞核，表示囊胚细胞总数；红色细胞为滋养层细胞的免疫染色；合成图为差异染色显示结果，粉红色为滋养层细胞，蓝色为内细胞团细胞。
由上述表格和图片中可以看出，1μM的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎12h可以显著提高囊胚的细胞总数、内细胞团细胞数和ICM∶TE的比值。此处理方法得到的囊胚的细胞总数显著高于对照组(111.45±7.46VS 85.26±5.32，P<0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数显著高于对照组(35.14±2.61VS 20.47±2.01，P<0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值显著高于对照组(45.87±1.61VS31.10±1.79，P<0.05)。
4)牛体细胞克隆囊胚的细胞凋亡：
如上述文献之图3所示的，其为Oxamflatin处理与对照相比的牛第7d体细胞克隆胚的凋亡染色图，由图3当中发绿色荧光的凋亡细胞的对比可以看出Oxamflatin处理组的凋亡细胞明显要少于对照组。上述文献的图4为Oxamflatin处理与对照相比的牛体细胞克隆胚的凋亡柱状分析结果图，其中横坐标表示对照组(n＝16)和Oxamflatin处理组(n＝20)，纵坐标表示每个囊胚上的凋亡细胞数，每个菱形表示一个囊胚；可以看出Oxamflatin处理组中大部分的囊胚上的细胞凋亡数不超过2个，而且零细胞凋亡的囊胚数要明显多于对照组。由图3和图4所示的细胞凋亡的对比，可以看出Oxamflatin处理组可以显著降低囊胚细胞凋亡的数，提高牛体细胞克隆囊胚的质量。
试验三、体细胞核移植技术生产牛克隆胚胎的制备
参照上述试验二的方法进行试验。
a.牛胎儿成纤维细胞的培养
从液氮中取一管荷斯坦奶牛的2-5代的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻，加0.8ml的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO2培养箱中38.5℃条件下培养。
待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养。
b.卵母细胞的成熟培养
牛卵巢采自蓟县屠宰场，将卵巢置于含青、链霉素的20～25℃的生理盐水保温瓶中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在高压过的无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含5～15％血清的PBS中清洗三遍。选择形态正常的A、B级卵母细胞用于体外成熟培养。A级卵母细胞为胞质均匀、卵丘细胞致密、最少有5层卵丘细胞完全包裹的卵母细胞；B级卵母细胞的卵丘细胞为2～4层，基本上包裹卵母细胞。
将采集的COCs在成熟液中洗两遍，然后移入装有3毫升成熟液的3cm平皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24-26h。将培养成熟的卵母细胞用PBS液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+的PBS中消化1-2min，并用1000ml移液枪反复吹打COCs，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞挑选有极体的卵母细胞待用。
c.牛体细胞克隆胚的构建
去核：去核前卵母细胞先在含7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342和10％FBS的PBS中孵育15min。在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的部分卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况。完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。
注核和电融合：注核时挑选直径为15～20μm的细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注核后的重组体采用微电极的方法进行融合。融合前，重构体在电融合液中预平衡3min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z”字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组体的供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时长20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1h在显微镜下观察融合情况。
d.牛体细胞克隆胚融合后的处理
为了检测Oxamflatin的处理效果，同时设不加Oxamflatin的对照组，其余操作方法相同。
处理组：分别在含有2mmol/L的6-DMAP的mSOF中添加1μM的Oxamflatin工作液，以及在G1.3中添加1μM的Oxamflatin工作液。对照组不加。
牛体细胞克隆胚的激活：在电融合之后1～2h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处理(用离子霉素(Ionomycin)联合6-DMAP激活)：首先在含5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含12mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液(本文“试验一”之“d、Oxamflatin储存液和工作液体的配置”之“iii)浓度为1μM的Oxamflatin工作液”中制得)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h。
牛克隆胚的体外培养：牛体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含1μmol/L的Oxamflatin的G1.3培养液(本文“试验一”之“d、Oxamflatin储存液和工作液体的配置”之“iii)浓度为1μM的Oxamflatin工作液”中制得)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养8h，G1.3培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚；再用G1.3培养液清洗多次，继续在G1.3培养液中培养至72h；然后将牛体细胞克隆胚转移到G2.3培养液中继续在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。
所述的作为培养基的G1.3培养液上还覆盖有石蜡油(Sigma，M8410)，并预先在CO2培养箱中平衡至少2h。
对照组用不加Oxamflatin的G1.3培养液进行培养。培养48h后记录卵裂数，第7d记录囊胚发育情况。体外培养后7d的结果显示，牛体细胞克隆囊胚的显微视图与试验二基本相同。
与对照组相比，利用Oxamflatin对重构体进行处理后，可以显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎。结果与试验二基本相同，具体表现为：
1)牛体细胞克隆囊胚的发育率：
1μM浓度Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎12个小时，囊胚发育率达41.06±1.03％，显著高于0μM浓度Oxamflatin组(30.18±0.97％，P<0.05)；
结果还显示，在桑椹胚率和囊胚率方面Oxamflatin浓度过低或者浓度过高均不能显著提高，只在中等浓度即1μM浓度的Oxamflatin时才能与对照组相比显著提高桑椹胚率和囊胚率，此结果与试验二基本相同。
2)Oxamflatin处理时间(包括激活和培养的时间总和)：
结果与试验二基本相同，用1μM的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎的最佳时间为12h。
3)牛体细胞克隆囊胚的细胞数的试验结果：
结果与试验二基本相同，例如，1μM的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎12h可以显著提高囊胚的细胞总数、内细胞团细胞数和ICM∶TE的比值。此处理方法得到的囊胚的细胞总数显著高于对照组(112.33±6.73VS 87.72±6.47，P<0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数显著高于对照组(35.53±2.58VS 20.11±1.87，P<0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值显著高于对照组(45.13±1.73VS30.88±1.67，P<0.05)。
4)牛体细胞克隆囊胚的细胞凋亡：结果与试验二基本相同，例如，显示Oxamflatin处理组可以显著降低囊胚细胞凋亡的数，提高牛体细胞克隆囊胚的质量。
试验四、体细胞核移植技术生产牛克隆胚胎的制备(工作液中同时增加了GC和SS
二者)
参考上述试验三的方法进行试验，主要不同在于，在进行“牛体细胞克隆胚的激活”和“牛克隆胚的体外培养”时，所用的mSOF溶液和G1.3培养液是如本文“试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备”之“e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置”中的方法配制的增补了GC和SS的Oxamflatin储存液和工作液。
a.牛胎儿成纤维细胞的培养
从液氮中取一管荷斯坦奶牛的2-5代的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻，加0.8ml的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO2培养箱中38.5℃条件下培养。
待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养。
b.卵母细胞的成熟培养
牛卵巢采自蓟县屠宰场，将卵巢置于含青、链霉素的20～25℃的生理盐水保温瓶中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在高压过的无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含5～15％血清的PBS中清洗三遍。选择形态正常的A、B级卵母细胞用于体外成熟培养。A级卵母细胞为胞质均匀、卵丘细胞致密、最少有5层卵丘细胞完全包裹的卵母细胞；B级卵母细胞的卵丘细胞为2～4层，基本上包裹卵母细胞。
将采集的COCs在成熟液中洗两遍，然后移入装有3毫升成熟液的3cm平皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24-26h。将培养成熟的卵母细胞用PBS液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+的PBS中消化1-2min，并用1000ml移液枪反复吹打COCs，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞挑选有极体的卵母细胞待用。
c.牛体细胞克隆胚的构建
去核：去核前卵母细胞先在含7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342和10％FBS的PBS中孵育15min。在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的部分卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况。完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。
注核和电融合：注核时挑选直径为15～20μm的细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注核后的重组体采用微电极的方法进行融合。融合前，重构体在电融合液中预平衡3min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z”字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组体的供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时长20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1h在显微镜下观察融合情况。
d.牛体细胞克隆胚融合后的处理
为了检测Oxamflatin的处理效果，同时设不加Oxamflatin的对照组，其余操作方法相同。
处理组：分别在含有2mmol/L的6-DMAP的mSOF中添加1μM的Oxamflatin工作液(其中如本文“试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备”之“e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置”还增补了GC和SS)，以及在G1.3中添加1μM的Oxamflatin工作液(其中如本文“试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备”之“e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置”还增补了GC和SS)。对照组不加。
牛体细胞克隆胚的激活：在电融合之后1～2h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处理(用离子霉素(Ionomycin)联合6-DMAP激活)：首先在含5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含12mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液(如上所述，其中还增补了GC和SS)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h。
牛克隆胚的体外培养：牛体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含1μmol/L的Oxamflatin的G1.3培养液(如上所述，其中还增补了GC和SS)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养8h，G1.3培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚；再用G1.3培养液清洗多次，继续在G1.3培养液中培养至72h；然后将牛体细胞克隆胚转移到G2.3培养液中继续在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。
所述的作为培养基的G1.3培养液上还覆盖有石蜡油(Sigma，M8410)，并预先在CO2培养箱中平衡至少2h。
对照组用不加Oxamflatin(同样地亦不加GC和SS，在本发明中如未特别说明均如此)的G1.3培养液进行培养。培养48h后记录卵裂数，第7d记录囊胚发育情况。体外培养后7d的结果显示，牛体细胞克隆囊胚的显微视图相对于试验三有改善。
与对照组相比，利用Oxamflatin(其中还增补了GC和SS)对重构体进行处理后，可以显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎。结果相对于试验三有改善，具体表现为：
1)牛体细胞克隆囊胚的发育率：
1μM浓度Oxamflatin(增补了GC和SS)处理牛体细胞克隆胚胎12个小时，囊胚发育率达61.37±1.77％，显著高于0μM浓度Oxamflatin组(31.23±1.33％，P<0.05)，并且与试验三中(未增补GC和SS)囊胚发育率达41.06％的结果亦有显著差异(P<0.05)；其余结果与试验三基本相同。
2)Oxamflatin处理时间(包括激活和培养的时间总和)：
结果与试验三基本相同，用1μM的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎的最佳时间为12h。
3)牛体细胞克隆囊胚的细胞数的试验结果：
1μM的Oxamflatin(增补了GC和SS)处理牛体细胞克隆胚胎12h可以显著提高囊胚的细胞总数、内细胞团细胞数和ICM∶TE的比值。此处理方法得到的囊胚的细胞总数显著高于对照组(182.62±14.11VS 84.63±6.44，P<0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数显著高于对照组(88.42±2.36VS 21.32±2.44，P<0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值显著高于对照组(93.86±2.13VS 31.37±1.95，P<0.05)。另外，用增补了GC和SS的工作液所得囊胚细胞总数、内细胞团细胞数、内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值三者显著地高于试验三中的三个相应参数。
4)牛体细胞克隆囊胚的细胞凋亡：结果与试验三基本相同，例如，显示Oxamflatin处理组可以显著降低囊胚细胞凋亡的数，提高牛体细胞克隆囊胚的质量。
试验五、体细胞核移植技术生产牛克隆胚胎的制备(工作液中仅增加GC)
参考上述试验三的方法进行试验，主要不同在于，在进行“牛体细胞克隆胚的激活”和“牛克隆胚的体外培养”时，所用的mSOF溶液和G1.3培养液是如本文“试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备”之“e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置”中的方法配制的仅增补了GC的Oxamflatin储存液和工作液。
a.牛胎儿成纤维细胞的培养
从液氮中取一管荷斯坦奶牛的2-5代的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻，加0.8ml的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO2培养箱中38.5℃条件下培养。
待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养。
b.卵母细胞的成熟培养
牛卵巢采自蓟县屠宰场，将卵巢置于含青、链霉素的20～25℃的生理盐水保温瓶中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在高压过的无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含5～15％血清的PBS中清洗三遍。选择形态正常的A、B级卵母细胞用于体外成熟培养。A级卵母细胞为胞质均匀、卵丘细胞致密、最少有5层卵丘细胞完全包裹的卵母细胞；B级卵母细胞的卵丘细胞为2～4层，基本上包裹卵母细胞。
将采集的COCs在成熟液中洗两遍，然后移入装有3毫升成熟液的3cm平皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24-26h。将培养成熟的卵母细胞用PBS液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+的PBS中消化1-2min，并用1000ml移液枪反复吹打COCs，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞挑选有极体的卵母细胞待用。
c.牛体细胞克隆胚的构建
去核：去核前卵母细胞先在含7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342和10％FBS的PBS中孵育15min。在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的部分卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况。完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。
注核和电融合：注核时挑选直径为15～20μm的细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注核后的重组体采用微电极的方法进行融合。融合前，重构体在电融合液中预平衡3min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z”字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组体的供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时长20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1h在显微镜下观察融合情况。
d.牛体细胞克隆胚融合后的处理
为了检测Oxamflatin的处理效果，同时设不加Oxamflatin的对照组，其余操作方法相同。
处理组：分别在含有2mmol/L的6-DMAP的mSOF中添加1μM的Oxamflatin工作液(其中如本文“试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备”之“e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置”还增补了GC)，以及在G1.3中添加1μM的Oxamflatin工作液(其中如本文“试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备”之“e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置”还增补了GC)。对照组不加。
牛体细胞克隆胚的激活：在电融合之后1～2h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处理(用离子霉素(Ionomycin)联合6-DMAP激活)：首先在含5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含12mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液(如上所述，其中还增补了GC)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h。
牛克隆胚的体外培养：牛体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含1μmol/L的Oxamflatin的G1.3培养液(如上所述，其中还增补了GC)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养8h，G1.3培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚；再用G1.3培养液清洗多次，继续在G1.3培养液中培养至72h；然后将牛体细胞克隆胚转移到G2.3培养液中继续在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。
所述的作为培养基的G1.3培养液上还覆盖有石蜡油(Sigma，M8410)，并预先在CO2培养箱中平衡至少2h。
对照组用不加Oxamflatin的G1.3培养液进行培养。培养48h后记录卵裂数，第7d记录囊胚发育情况。体外培养后7d的结果显示，牛体细胞克隆囊胚的显微视图与试验三结果基本相同。
与对照组相比，利用Oxamflatin(其中还增补了GC)对重构体进行处理后，结果与试验三基本相同，例如：
1)牛体细胞克隆囊胚的发育率：
1μM浓度Oxamflatin(增补了GC)处理牛体细胞克隆胚胎12个小时，囊胚发育率达43.26±1.85％。
2)Oxamflatin处理时间(包括激活和培养的时间总和)：
结果与试验三基本相同，用1μM的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎的最佳时间为12h。
3)牛体细胞克隆囊胚的细胞数的试验结果：
1μM的Oxamflatin(增补了GC)处理牛体细胞克隆胚胎12h的囊胚的细胞总数、内细胞团细胞数和ICM∶TE的比值，与试验三基本相同，囊胚细胞总数为112.53±12.17、囊胚的内细胞团细胞为35.84±1.66、囊胚内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值为46.73±2.74，三个参数与试验三中的三个相应参数基本无差异。
4)牛体细胞克隆囊胚的细胞凋亡：结果与试验三基本相同，例如，显示Oxamflatin处理组可以显著降低囊胚细胞凋亡的数，提高牛体细胞克隆囊胚的质量。
试验六、体细胞核移植技术生产牛克隆胚胎的制备(工作液中仅增加SS)
参考上述试验三的方法进行试验，主要不同在于，在进行“牛体细胞克隆胚的激活”和“牛克隆胚的体外培养”时，所用的mSOF溶液和G1.3培养液是如本文“试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备”之“e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置”中的方法配制的仅增补了SS的Oxamflatin储存液和工作液。
a.牛胎儿成纤维细胞的培养
从液氮中取一管荷斯坦奶牛的2-5代的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻，加0.8ml的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO2培养箱中38.5℃条件下培养。
待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养。
b.卵母细胞的成熟培养
牛卵巢采自蓟县屠宰场，将卵巢置于含青、链霉素的20～25℃的生理盐水保温瓶中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在高压过的无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含5～15％血清的PBS中清洗三遍。选择形态正常的A、B级卵母细胞用于体外成熟培养。A级卵母细胞为胞质均匀、卵丘细胞致密、最少有5层卵丘细胞完全包裹的卵母细胞；B级卵母细胞的卵丘细胞为2～4层，基本上包裹卵母细胞。
将采集的COCs在成熟液中洗两遍，然后移入装有3毫升成熟液的3cm平皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24-26h。将培养成熟的卵母细胞用PBS液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+的PBS中消化1-2min，并用1000ml移液枪反复吹打COCs，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞挑选有极体的卵母细胞待用。
c.牛体细胞克隆胚的构建
去核：去核前卵母细胞先在含7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342和10％FBS的PBS中孵育15min。在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的部分卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况。完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。
注核和电融合：注核时挑选直径为15～20μm的细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注核后的重组体采用微电极的方法进行融合。融合前，重构体在电融合液中预平衡3min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z”字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组体的供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时长20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1h在显微镜下观察融合情况。
d.牛体细胞克隆胚融合后的处理
为了检测Oxamflatin的处理效果，同时设不加Oxamflatin的对照组，其余操作方法相同。
处理组：分别在含有2mmol/L的6-DMAP的mSOF中添加1μM的Oxamflatin工作液(其中如本文“试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备”之“e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置”还增补了SS)，以及在G1.3中添加1μM的Oxamflatin工作液(其中如本文“试验一、试剂和培养液/处理液的来源或制备”之“e、增补GC和/或SS的Oxamflatin储存液和工作液的配置”还增补了SS)。对照组不加。
牛体细胞克隆胚的激活：在电融合之后1～2h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处理(用离子霉素(Ionomycin)联合6-DMAP激活)：首先在含5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含12mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液(如上所述，其中还增补了SS)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h。
牛克隆胚的体外培养：牛体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含1μmol/L的Oxamflatin的G1.3培养液(如上所述，其中还增补了SS)中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养8h，G1.3培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚；再用G1.3培养液清洗多次，继续在G1.3培养液中培养至72h；然后将牛体细胞克隆胚转移到G2.3培养液中继续在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。
所述的作为培养基的G1.3培养液上还覆盖有石蜡油(Sigma，M8410)，并预先在CO2培养箱中平衡至少2h。
对照组用不加Oxamflatin的G1.3培养液进行培养。培养48h后记录卵裂数，第7d记录囊胚发育情况。体外培养后7d的结果显示，牛体细胞克隆囊胚的显微视图与试验三结果基本相同。
与对照组相比，利用Oxamflatin(其中还增补了SS)对重构体进行处理后，结果与试验三基本相同，例如：
1)牛体细胞克隆囊胚的发育率：
1μM浓度Oxamflatin(增补了SS)处理牛体细胞克隆胚胎12个小时，囊胚发育率达41.48±2.53％。
2)Oxamflatin处理时间(包括激活和培养的时间总和)：
结果与试验三基本相同，用1μM的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎的最佳时间为12h。
3)牛体细胞克隆囊胚的细胞数的试验结果：
1μM的Oxamflatin(增补了SS)处理牛体细胞克隆胚胎12h的囊胚的细胞总数、内细胞团细胞数和ICM∶TE的比值，与试验三基本相同，囊胚细胞总数为109.73±12.86、囊胚的内细胞团细胞为36.16±2.64、囊胚内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值为49.15±2.17，三个参数与试验三中的三个相应参数基本无差异。
4)牛体细胞克隆囊胚的细胞凋亡：结果与试验三基本相同，例如，显示Oxamflatin处理组可以显著降低囊胚细胞凋亡的数，提高牛体细胞克隆囊胚的质量。
以上结果表明，在牛体细胞克隆胚的激活和牛克隆胚的体外培养的过程中，随Oxamflatin还同时补充添加GC和SS时，与不添加GC和SS相比，能够显著的提高囊胚发育率，同时能够显著的提高囊胚细胞总数、囊胚的内细胞团细胞、囊胚内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值三个参数；但是，当仅添加GC或者仅添加SS时，却不能实现上述技术效果。
试验七、体细胞核移植技术生产犬(猎犬，Retriever)克隆胚胎的制备
依次参照本发明上文试验三、试验四、试验五、试验六的操作，不同的是在“a.牛胎儿成纤维细胞的培养”中改为取Retriever猎犬的2-4代胎儿成纤维细胞进行38℃解冻并进行后续操作，在“b.卵母细胞的成熟培养”中改为取比格犬的卵巢进行操作。
结果表明，在犬体细胞克隆胚的激活和犬克隆胚的体外培养的过程中，随Oxamflatin还同时补充添加GC和SS时，与不添加GC和SS相比，能够显著的提高囊胚发育率(p<0.05)，同时能够显著的提高囊胚细胞总数、囊胚的内细胞团细胞、囊胚内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值三个参数(三个参数的p值均小于0.05)；但是，当仅添加GC或者仅添加SS时，却不能实现上述技术效果(四个参数的p值均大于0.5)。
试验八、体细胞核移植技术生产藏羚羊(Pantholops hodgsoni)克隆胚胎的制备
依次参照本发明上文试验三、试验四、试验五、试验六的操作，不同的是在“a.牛胎儿成纤维细胞的培养”中改为取藏羚羊的3-5代胎儿成纤维细胞进行38℃解冻并进行后续操作，在“b.卵母细胞的成熟培养”中改为取山羊的卵巢进行操作。
结果表明，在羊体细胞克隆胚的激活和羊克隆胚的体外培养的过程中，随Oxamflatin还同时补充添加GC和SS时，与不添加GC和SS相比，能够显著的提高囊胚发育率(P<0.05)，同时能够显著的提高囊胚细胞总数、囊胚的内细胞团细胞、囊胚内细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值三个参数(三个参数的p值均小于0.05)；但是，当仅添加GC或者仅添加SS时，却不能实现上述技术效果(四个参数的p值均大于0.5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种哺乳动物体细胞克隆的方法，该方法包括以下处理哺乳动物体细胞克隆胚的步骤：
1)将待移植的哺乳动物体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后1h，挑选成功融合的哺乳动物体细胞克隆胚进行以下激活处理：首先在含5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含2mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h；
2)哺乳动物体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含0.5～1.5μmol/L(例如1μmol/L)Oxamflatin的G1.3培养液中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4～12h(例如8h)，再用G1.3培养液清洗多次，继续在G1.3培养液中培养至72h；然后将哺乳动物体细胞克隆胚转移到G2.3培养液中继续在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养至第7d。
2.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物选自牛、羊、犬、马、猪。
3.根据权利要求1的方法，其中：所述哺乳动物体细胞克隆胚是通过基于体细胞核移植构建的；或者，所述mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，还包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；或者，步骤1)中进行激活处理时，所用的mSOF溶液中与Oxamflatin一起还增补添加了相对于Oxamflatin而言4摩尔倍量的GC，并且还增补添加了相对于Oxamflatin而言2摩尔倍量的SS；或者，步骤2)中进行培养时，所用的G1.3培养液中与Oxamflatin一起还增补添加了相对于Oxamflatin而言4摩尔倍量的GC，并且还增补添加了相对于Oxamflatin而言2摩尔倍量的SS。
4.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物体细胞克隆胚在进行激活处理或培养时，Oxamflatin的浓度均为1μmol/L。
5.根据权利要求1的方法，其中激活处理和培养处理的总体时间为10～12h。
6.根据权利要求1的方法，其中所述的作为培养基的G1.3培养液上还覆盖有石蜡油，并预先在CO2培养箱中平衡至少2h。
7.根据权利要求1的方法，其中所述的G1.3培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚哺乳动物体细胞克隆胚。
8.根据权利要求1的方法，其中所述的去核后的卵母细胞的制备为：在去核前，卵母细胞先在含有7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342和体积浓度10％FBS的PBS溶液中孵育15min；然后在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团从而检查去核情况；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞应用于核移植。
9.根据权利要求1的方法，其中所述的哺乳动物体细胞注入后的电融合的操作为：挑选直径为15～20μm的待移植的哺乳动物体细胞，注入到去核的卵母细胞透明带下；在进行电融合前，重构体在电融合液中预平衡3min；将重构体的供体、作为受体的去核的卵母细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时为20μs、2次脉冲间隔10ms。
10.一种在哺乳动物体细胞克隆方法的体细胞克隆胚激活过程中使用的培养液，其为包含2mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液；进一步，其中所述哺乳动物体细胞克隆方法如权利要求1任一项所述；或者，一种在哺乳动物体细胞克隆方法的体细胞克隆胚体外培养过程中使用的培养液，其为包含0.5～1.5μmol/L(例如1μmol/L)Oxamflatin的G1.3培养液；进一步，其中所述哺乳动物体细胞克隆方法如权利要求1任一项所述。
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