CN105087653A - 制备克隆小型动物胚胎的方法 - Google Patents
制备克隆小型动物胚胎的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105087653A CN105087653A CN201410189550.2A CN201410189550A CN105087653A CN 105087653 A CN105087653 A CN 105087653A CN 201410189550 A CN201410189550 A CN 201410189550A CN 105087653 A CN105087653 A CN 105087653A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oocyte
- embryo
- sodium
- fusion
- enucleated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 37
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 120
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 13
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 34
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 claims description 29
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 claims description 29
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 27
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 claims description 24
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 claims description 24
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 24
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims description 22
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 20
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 17
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 16
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 15
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 15
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 15
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 13
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 claims description 12
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 12
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 claims description 12
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 12
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 claims description 12
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 claims description 12
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 claims description 12
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 229920003020 cross-linked polyethylene Polymers 0.000 claims description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 claims description 8
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 5
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940047908 strontium chloride hexahydrate Drugs 0.000 claims description 5
- AMGRXJSJSONEEG-UHFFFAOYSA-L strontium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.Cl[Sr]Cl AMGRXJSJSONEEG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 4
- 241000282324 Felis Species 0.000 claims description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 abstract description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 13
- 239000003866 digestant Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 8
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 5
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 5
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 4
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 4
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 4
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 4
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 4
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 4
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 2
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical class N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N cytochalasin Natural products N1C(=O)C2(C(C=CC(C)CC(C)CC=C3)OC(C)=O)C3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N cytochalasin-A Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(=O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 2
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000624 ovulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了制备克隆小型动物胚胎的方法，其包括以下步骤：提供离体的供体核细胞；提供离体的卵母细胞；于含有透明带消化剂的卵母细胞去核液中，将卵母细胞进行去核处理，以便获得去核卵母细胞；将去核卵母细胞与供体核细胞融合，以便获得重构胚；将重构胚进行体外激活，以便获得激活的重构胚；以及将激活的重构胚进行培养，以便获得克隆小型动物胚胎。采用本发明的方法，能够在消化卵母细胞透明带的同时，适时快速进行切割去核，从而操作人员可以精确的把握去核时间，成功实现卵母细胞去核，并保证囊胚形成率，高效制备克隆小型动物胚胎。
Description
技术领域
本发明涉及动物细胞工程技术领域。具体地，本发明涉及制备克隆小型动物胚胎的方法。
背景技术
体细胞核移植又称克隆，是动物细胞工程中最常用的技术手段。通过电击法或直接显微注射法将具有较高分化程度的体细胞转移至卵母细胞中，再经过化学激活，使其重新编程发育成胚胎，将其移植入代孕母体内，出生完整个体。1996年通过传统克隆技术，在显微操作仪器辅助下，首次获得的体细胞克隆绵羊。2001年，科学家GavorVajta首次提出了手工克隆技术，该技术在体视显微镜下，手持特制刀片将无透明带卵母细胞的核切除，从而达到去核目的。手工克隆与传统克隆相比，无需使用显微操作仪，及尖端的技术人员。但这些技术方法主要适用于大动物。
因而，现阶段适于小型动物的手工克隆技术的研究具有重大的意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种适于小型动物，并能够有效保证囊胚形成率的手工克隆技术。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备克隆小型动物胚胎的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：提供离体的供体核细胞；提供离体的卵母细胞；于含有透明带消化剂的卵母细胞去核液中，将所述卵母细胞进行去核处理，以便获得去核卵母细胞；将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合，以便获得重构胚；将所述重构胚进行体外激活，以便获得激活的重构胚；以及将所述激活的重构胚进行培养，以便获得所述克隆小型动物胚胎。发明人惊奇的发现，采用本发明的方法，能够在透明带为半消化状态，即在消化透明带的同时，适时快速进行切割去核，从而操作人员可以精确的把握去核时间，成功实现卵母细胞去核，并保证囊胚形成率，高效制备克隆小型动物胚胎。此外，根据本发明的实施例，本发明的方法成本低、操作简单，易于推广。
根据本发明的实施例，本发明制备克隆小型动物胚胎的方法还可以进一步具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述透明带消化剂为选自链蛋白酶和细胞松弛素B的至少一种。由此，能够有效消化透明带，便于精准的把握去核时间，易于去核操作。
根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中包含：5-15μg/mL链蛋白酶；和/或1-5μg/mL细胞松弛素B。由此，透明带半消化效果较好，易于去核操作。
根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中包含：10μg/mL链蛋白酶；和/或2.5μg/mL细胞松弛素B。由此，透明带半消化效果好，易于去核操作。
根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中进一步包含：5-15体积％的TCM199培养基；0.1-0.3mg/mL碳酸氢钠；0.1-0.3mg/mL丙酮酸钠；3-4mg/mL赫佩斯钠盐；2-3mg/mL赫佩斯酸；0.1-0.3mg/mL谷氨酰胺；以及15-25体积％的牛血清。由此，能够有效提高卵母细胞去核后的成活率。
根据本发明的实施例，所述卵母细胞去核液中包含：10体积％的TCM199培养基；0.17mg/mL碳酸氢钠；0.20mg/mL丙酮酸钠；3.60mg/mL赫佩斯钠盐；2.63mg/mL赫佩斯酸；0.20mg/mL谷氨酰胺；以及20体积％的牛血清。由此，去核过程中，卵母细胞损伤小，能够有效提高卵母细胞去核后的成活率。
根据本发明的实施例，当所述卵母细胞的透明带半消化时，根据极体定位的方法，将所述卵母细胞的第一极体连同部分卵母细胞质切除，以便实现所述去核处理。由此，能够适时快速进行切割去核，操作简单，对细胞损伤小，去核成功率高。
根据本发明的实施例，将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合，包括：将所述去核卵母细胞均分为两组；将其中一组去核卵母细胞与所述供体核细胞进行第一融合，以便形成去核卵母细胞-体细胞复合体；以及将另一组去核卵母细胞与所述去核卵母细胞-体细胞复合体进行第二融合，以便形成三体结构的去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞，所述三体结构的去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞即为所述重构胚。由此，融合效果好，重构胚的成活率高，进而能够有效提高囊胚形成率。
根据本发明的实施例，利用细胞融合仪，于融合操作液中进行所述第一融合和所述第二融合，其中，所述融合操作液包含：54.65mg/mL甘露醇；1mg/mL聚乙烯醇；以及0.145mg/mL硫酸镁，所述细胞融合仪的参数设置为DC80V、40μs、AC9V。由此，能够促进细胞融合，并进一步提高囊胚形成率。
根据本发明的实施例，将所述重构胚置于化学激活操作液中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养4-8小时，优选6小时，以便实现所述体外激活，其中，所述化学激活操作液包含：4.789mg/mL氯化钠；0.36mg/mL氯化钾；0.159mg/mL磷酸钾；0.291mg/mL七水硫酸镁；2.1mg/mL碳酸氢钠；1mg/mL葡萄糖；0.029mg/mL丙酮酸钠；0.146mg/mL谷氨酰胺；0.37体积％的乳酸钠(60％糖浆)；0.038mg/mL乙二胺四乙酸；0.1mg/mL聚乙烯醇；5mg/mL牛血清白蛋白；5μg/mL细胞松弛素B；以及2.666mg/mL六水氯化锶。由此，能够有效激活重构胚，进而促进囊胚形成，提高囊胚形成率。
根据本发明的实施例，将所述激活的重构胚置于胚胎培养液中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养100-120小时优选108小时，以便获得所述克隆小鼠胚胎，其中，所述胚胎培养液包含：4.789mg/mL氯化钠；0.36mg/mL氯化钾；0.159mg/mL磷酸钾；0.291mg/mL七水硫酸镁；2.1mg/mL碳酸氢钠；1mg/mL葡萄糖；0.029mg/mL丙酮酸钠；0.251mg/mL二水氯化钙；0.146mg/mL谷氨酰胺；0.37体积％的乳酸钠；0.038mg/mL乙二胺四乙酸；0.1mg/mL聚乙烯醇；以及5mg/mL牛血清白蛋白。由此，能够有效促进激活后的重构胚发育形成囊胚，提高囊胚形成率。
根据本发明的实施例，所述小型动物为哺乳动物，优选为鼠科、兔科、猫科、或犬科的至少一种，更优选为小鼠。
附图说明
图1是根据本发明一个实施例，切割未消化透明带细胞，去核刀未触碰到卵母细胞胞质中细胞核的部分的显微镜示意图；
图2是根据本发明一个实施例，切割未消化透明带细胞，去核刀暴力挤压下，透明带中卵母细胞胞质涣散，卵母细胞死亡的显微镜示意图；
图3是根据本发明一个实施例的去核操作盘示意图；
图4是根据本发明一个实施例的融合操作盘示意图；
图5是根据本发明一个实施例的培养盘示意图；
图6是根据本发明一个实施例，小鼠第二次减数分裂中期卵母细胞的显微图片；
图7是根据本发明一个实施例，CF-C细胞系小鼠供体核细胞，在200倍倒置相差显微镜条件下的显微图片；
图8是根据本发明一个实施例，半消化透明带条件下，去核刀切割含有细胞核部分的卵母细胞胞质的显微图片；
图9是根据本发明一个实施例，小鼠手工克隆重构胚培养108小时后形成的囊胚，在20倍体视显微镜条件下的显微图片；以及
图10是根据本发明一个实施例，小鼠手工克隆重构胚培养108小时后形成的囊胚，在56倍体视显微镜条件下的显微图片。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
发明人发现，与猪牛羊等大动物相比，小型动物的卵子体积小，胞质也较为脆弱，在按照现有技术去除卵母细胞核的操作过程中，去核刀如果直接挤压未经过预处理的透明带，会出现以下两种情况：情况一：卵母细胞翻滚，去核刀未触碰到卵母细胞胞质中细胞核的部分(如图1所示)；情况二：去核刀暴力挤压，导致透明带中卵母细胞胞质涣散，卵母细胞死亡(如图2所示)。在去除卵母细胞核操作过程中，由于胞质的脆弱性，去核刀如果挤压完全消化掉透明带的卵母细胞胞质会导致卵母细胞涣散进而死亡。其中，需要说明的是，在本发明中所使用的术语“小型动物”是指是相对于猪牛羊等大型动物体型较小的动物，其种类不受特别限制，例如可以为鼠科、兔科、猫科、或犬科的小型动物，例如小鼠、兔、猫、狗等。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备克隆小型动物胚胎的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
首先，提供离体的供体核细胞。其中，根据本发明的实施例，所述小型动物为哺乳动物，优选为选自鼠科、兔科、猫科、或犬科的至少一种，更优选为小鼠。
其次，提供离体的卵母细胞。
接着，于含有透明带消化剂的卵母细胞去核液中，将所述卵母细胞进行去核处理，以便获得去核卵母细胞。
其中，透明带消化剂的种类不受特别限制，只要能够有效消化透明带即可。根据本发明的实施例，所述透明带消化剂为选自链蛋白酶和细胞松弛素B的至少一种。由此，能够有效消化透明带，便于精准的把握去核时间，易于去核操作。根据本发明的一些实施例，所述卵母细胞去核液中包含：5-15μg/mL链蛋白酶；和/或1-5μg/mL细胞松弛素B。由此，透明带半消化效果较好，易于去核操作。根据本发明的一些优选实施例，所述卵母细胞去核液中包含：10μg/mL链蛋白酶；和/或2.5μg/mL细胞松弛素B。由此，透明带半消化效果好，易于去核操作。
此外，根据本发明的另一些实施例，所述卵母细胞去核液中进一步包含：5-15体积％的TCM199培养基；0.1-0.3mg/mL碳酸氢钠；0.1-0.3mg/mL丙酮酸钠；3-4mg/mL赫佩斯钠盐；2-3mg/mL赫佩斯酸；0.1-0.3mg/mL谷氨酰胺；以及15-25体积％的牛血清。由此，能够有效提高卵母细胞去核后的成活率。根据本发明的一些具体示例，所述卵母细胞去核液中包含：10体积％的TCM199培养基；0.17mg/mL碳酸氢钠；0.20mg/mL丙酮酸钠；3.60mg/mL赫佩斯钠盐；2.63mg/mL赫佩斯酸；0.20mg/mL谷氨酰胺；以及20体积％的牛血清。由此，去核过程中，卵母细胞损伤小，能够有效提高卵母细胞去核后的成活率。
根据本发明的实施例，进行去核操作的方法不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，当所述卵母细胞的透明带半消化时，根据极体定位的方法，将所述卵母细胞的第一极体连同部分卵母细胞质切除，以便实现所述去核处理。由此，能够适时快速进行切割去核，操作简单，对细胞损伤小，去核成功率高。
接下来，将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合，以便获得重构胚。
根据本发明的实施例，将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合的方法不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，其包括：将所述去核卵母细胞均分为两组；将其中一组去核卵母细胞与所述供体核细胞进行第一融合，以便形成去核卵母细胞-体细胞复合体；以及将另一组去核卵母细胞与所述去核卵母细胞-体细胞复合体进行第二融合，以便形成三体结构的去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞，所述三体结构的去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞即为所述重构胚。由此，融合效果好，重构胚的成活率高，进而能够有效提高囊胚形成率。
根据本发明的一些优选实施例，利用细胞融合仪，于融合操作液中进行所述第一融合和所述第二融合，其中，所述融合操作液包含：54.65mg/mL甘露醇；1mg/mL聚乙烯醇；以及0.145mg/mL硫酸镁，所述细胞融合仪的参数设置为DC80V、40μs、AC9V。由此，能够促进细胞融合，并进一步提高囊胚形成率。
接着，将所述重构胚进行体外激活，以便获得激活的重构胚。根据本发明的实施例，将所述重构胚进行体外激活的方法不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，将所述重构胚置于化学激活操作液中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养4-8小时，优选6小时，以便实现所述体外激活，其中，所述化学激活操作液包含：4.789mg/mL氯化钠；0.36mg/mL氯化钾；0.159mg/mL磷酸钾；0.291mg/mL七水硫酸镁；2.1mg/mL碳酸氢钠；1mg/mL葡萄糖；0.029mg/mL丙酮酸钠；0.146mg/mL谷氨酰胺；0.37体积％的乳酸钠(60％糖浆)；0.038mg/mL乙二胺四乙酸；0.1mg/mL聚乙烯醇；5mg/mL牛血清白蛋白；5μg/mL细胞松弛素B；以及2.666mg/mL六水氯化锶。由此，能够有效激活重构胚，进而促进囊胚形成，提高囊胚形成率。
然后，将所述激活的重构胚进行培养，以便获得所述克隆小型动物胚胎。根据本发明的实施例，将所述激活的重构胚进行培养的方法不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，将所述激活的重构胚置于胚胎培养液中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养100-120小时优选108小时，以便获得所述克隆小鼠胚胎，其中，所述胚胎培养液包含：4.789mg/mL氯化钠；0.36mg/mL氯化钾；0.159mg/mL磷酸钾；0.291mg/mL七水硫酸镁；2.1mg/mL碳酸氢钠；1mg/mL葡萄糖；0.029mg/mL丙酮酸钠；0.251mg/mL二水氯化钙；0.146mg/mL谷氨酰胺；0.37体积％的乳酸钠；0.038mg/mL乙二胺四乙酸；0.1mg/mL聚乙烯醇；以及5mg/mL牛血清白蛋白。由此，能够有效促进激活后的重构胚发育形成囊胚，提高囊胚形成率。
发明人惊奇的发现，采用本发明的制备克隆小型动物胚胎的方法，能够在透明带是半消化状态，即在消化透明带的同时，适时快速进行切割去核，从而操作人员可以精确的把握去核时间，保证脆弱的小型动物卵子能成功去核并保留存活的胞质部分，进而最终能够有效提高囊胚形成率。此外，根据本发明的实施例，本发明的方法成本低、操作简单，易于推广。
此外，根据本发明的一些优选实施例，本发明的制备克隆小型动物胚胎的方法，还可以包括：使用包含5μg/mL细胞松弛素B(CB)和10μg/mL链蛋白酶(Pronase)的卵母细胞去核液(CBMP)将小型动物卵母细胞的透明带半消化，用去核刀切除卵母细胞核；然后把去核的两枚卵母细胞胞质与小型动物体细胞放置于650μm宽度的融合槽内，用融合操作液，在DC80V、40μs的电融合参数下，采用一次电融合法将三者融合，形成重构胚；将重构胚置于胚胎培养液中，在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养1小时后取出，然后转入化学激活操作液，37℃、5％二氧化碳培养箱内，激活6小时；最后再次转入胚胎培液，形成空中空(WOW)系统，37℃、5％二氧化碳培养箱内培养108小时。由此，能够高效地获得体外手工克隆的小型动物胚胎。
下面参考具体的实施例对本发明进行说明，本领域技术人员可以理解，下列实施例仅仅用于说明目的，而不对本发明的范围做出限制。在下列实施例中所采用的材料均为市售可得的，在下列实施例中没有描述的方法步骤均为已知的，本领域技术人员可以参考相关文献获得。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
实验仪器：
体视显微镜、二氧化碳培养箱、热台、细胞融合仪、电融合糟、涡漩振荡器、胚胎聚集针、离心机、移液枪等。
实验耗材：
30mm培养皿、35mm培养皿、60mm培养皿、巴氏滴管、显微操作刀片、1.5mL离心管等。
实验试剂：
供体核细胞培养液：高糖DMEM细胞培养基、牛血清：15％、非必需氨基酸：1×、b成纤维细胞生长因子(bFGF)：10ng/mL；
卵母细胞采集液：TCM199培养基[10×]：10％v/v、碳酸氢钠：0.17mg/mL、丙酮酸钠：0.20mg/mL、赫佩斯钠盐：3.60mg/mL、赫佩斯酸：2.63mg/mL、谷氨酰胺：0.20mg/mL、两性霉素B：3.00μg/mL、肝素钠：30IU/mL、牛血清：2％；
卵母细胞操作液(M2)：氯化钠：5.533mg/mL、氯化钾：0.356mg/mL、二水氯化钙：0.252mg/mL、磷酸钾：0.162mg/mL、七水硫酸镁：0.293mg/mL、碳酸氢钠：0.349mg/mL、赫佩斯钠盐：4.969mg/mL、乳酸钠(60％糖浆)：4.349mg/mL、丙酮酸钠：0.036mg/mL、葡萄糖：1mg/mL、牛血清白蛋白：4mg/mL、青霉素G盐钾：0.06mg/mL、硫酸链霉素：0.05mg/mL、酚红：0.01mg/mL；
卵母细胞去核液(CBMP)：TCM199培养基[10×]：10％v/v、碳酸氢钠：0.17mg/mL、丙酮酸钠：0.20mg/mL、赫佩斯钠盐：3.60mg/mL、赫佩斯酸：2.63mg/mL、谷氨酰胺：0.20mg/mL、链蛋白酶(Pronase):10μg/mL、细胞松弛素(CB)：2.5μg/mL、牛血清：20％；
电融合操作液(PFM)：甘露醇：54.65mg/mL、聚乙烯醇：1mg/mL、硫酸镁：0.145mg/mL；
化学激活操作液：氯化钠：4.789mg/mL、氯化钾：0.36mg/mL、磷酸钾：0.159mg/mL、七水硫酸镁：0.291mg/mL、碳酸氢钠：2.1mg/mL、葡萄糖：1mg/mL、丙酮酸钠：0.029mg/mL、谷氨酰胺：0.146mg/mL、乳酸钠(60％糖浆)：0.37％、乙二胺四乙酸：0.038mg/mL、聚乙烯醇：0.1mg/mL、牛血清白蛋白：5mg/mL、细胞松弛素B(CB)：5ug/mL、六水氯化锶：2.666mg/mL；
胚胎培养液(CZB)：氯化钠：4.789mg/mL、氯化钾：0.36mg/mL、磷酸钾：0.159mg/mL、七水硫酸镁：0.291mg/mL、碳酸氢钠：2.1mg/mL、葡萄糖：1mg/mL、丙酮酸钠：0.029mg/mL、二水氯化钙：0.251mg/mL、谷氨酰胺：0.146mg/mL、乳酸钠(60％糖浆)：0.37％、乙二胺四乙酸：0.038mg/mL、聚乙烯醇：0.1mg/mL、牛血清白蛋白：5mg/mL；
其它试剂：磷酸盐缓冲液(PBS)、0.05％胰蛋白酶(Trysin)、200mg/L乙二胺四乙酸(EDTA)、明胶、植物凝集素(PHA)、细胞松弛素B(CB)、放线菌酮、透明质酸酶(Hya)、孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)。
一般方法：
根据本发明的实施例的制备克隆小型动物胚胎的方法，一般包括以下步骤：
1、提供离体的供体核细胞
雌雄动物交配，断颈处死怀孕雌性动物，取出子宫内胎儿。采用组织建系法进行CF-C细胞系建系，用供体核细胞培养液对供体细胞进行培养，克隆操作前1小时，收集生长良好的供体核细胞，将其转移至离心管中，得到供体核细胞。
2、提供离体的卵母细胞
处死排卵期的雌性动物，剪下与卵巢段连接的输卵管，显微镜下，挑破输卵管膨大部，用卵母细胞采集液收集卵丘卵母细胞复合体(COCs)，得到卵母细胞。
3、卵母细胞去核
使用卵母细胞操作液(M2)配制的并含5μg/mL细胞松弛素B(CB)和10μg/mL链蛋白酶(Pronase)的卵母细胞去核液(CBMP)将小鼠卵母细胞的透明带半消化，用去核刀切除卵母细胞核，得到去核卵母细胞。
4、细胞融合
将去核的卵母细胞胞质与供体体细胞放置于650μm宽度的融合槽内，用电融合操作液(PFM)，在DC80V、40μs的电融合参数下，采用一次电融合法将三者融合，形成重构胚。
5、激活重构胚
将重构胚置于胚胎培养基(CZB)中，在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养1小时后取出，然后转入化学激活操作液，37℃、5％二氧化碳培养箱内，激活6小时，获得激活的重构胚。
6、形成囊胚
然后将激活的重构胚转入胚胎培养基(CZB)，形成空中空(WOW)系统，37℃、5％二氧化碳培养箱内培养108小时，观察并收集囊胚，最终获得体外手工克隆小型动物胚胎。
实施例1
根据本发明的制备克隆小型动物胚胎的方法，按照以下步骤，制备克隆小鼠胚胎：
1、动物超数排卵
室温下，6只7-8周龄的昆明品系母鼠，腹腔给药10IU的孕马血清促性腺激素(PMSG)，48小时后腹腔注射10IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)。
2、细胞采集
注射hCG13小时后，断颈处死6只母鼠，剪下与卵巢段连接的输卵管，显微镜下，挑破输卵管膨大部，用卵母细胞采集液收集卵丘卵母细胞复合体(COCs)共256个。
其中卵母细胞采集液的体成份如下：10％v/vTCM199培养基(10×)、0.17mg/mL碳酸氢钠、0.20mg/mL丙酮酸钠、3.60mg/mL赫佩斯钠盐、2.63mg/mL赫佩斯酸、0.20mg/mL谷氨酰胺、3.00μg/m两性霉素B、30IU/m肝素钠和2体积％牛血清；
将COCs放入含有透明质酸酶(Hya)的卵母细胞操作液(M2)滴中，将卵丘细胞脱落后的卵母细胞在M2中洗涤3遍后，转移至去核操作盘内的M2滴中，得到227枚脱去卵丘细胞的卵母细胞。
其中卵母细胞操作液(M2)的成份如下：5.533mg/mL氯化钠、0.356mg/mL氯化钾、0.252mg/mL二水氯化钙、0.162mg/mL磷酸钾、0.293mg/mL七水硫酸镁、0.349mg/mL碳酸氢钠、4.969mg/mL赫佩斯钠盐、4.349mg/mL乳酸钠(60％糖浆)、0.036mg/mL丙酮酸钠、1mg/mL葡萄糖、4mg/mL牛血清白蛋白、0.06mg/mL青霉素G盐钾、0.05mg/mL硫酸链霉素和0.01mg/mL酚红。
3、供体核细胞制备
供体核细胞系建系：CF-1雄鼠与C57雌鼠交配，断颈处死怀孕12.5天的母鼠，取出子宫内胎儿，采用组织建系法进行CF-C细胞系建系，用供体核细胞培养液对供体细胞进行培养，供体细胞如图7所示。
其中供体核细胞培养液的成份如下：高糖DMEM细胞培养基、15体积％的牛血清、1×非必需氨基酸和10ng/mLb成纤维细胞生长因子(bFGF)。
供体核细胞准备：克隆操作前1小时，选择24孔板中培养的生长汇合率达90％的核供体细胞培养孔，0.05％胰蛋白酶(Trysin)消化细胞，供体核细胞培养液终止消化，轻微吹打后，将液体转移至1.5mL离心管中。
4、卵母细胞去核
将步骤3中获得的227枚脱去卵丘细胞的卵母细胞转移至卵母细胞去核液(CBMP)中，采用极体定位法，将第一极体连同部分卵母细胞质切除，如图8所示，得到172个去核的卵母细胞胞质；
其中卵母细胞去核液(CBMP)的成份如下：10％v/vTCM199培养基(10×)、0.17mg/mL碳酸氢钠、0.20mg/mL丙酮酸钠、3.60mg/mL赫佩斯钠盐、2.63mg/mL赫佩斯酸、0.20mg/mL谷氨酰胺、10μg/mL链蛋白酶(Pronase)、2.5μg/mL细胞松弛素(CB)和20体积％牛血清。
将上述去核的卵母细胞转移至卵母细胞操作液滴M2中待用。
5、卵母细胞与供体细胞融合
将步骤3中移至1.5ml离心管的体细胞置于融合操作盘的M2滴中，呈单个细胞分布状；
将步骤4中获得的去核卵母细胞按数量平均分成两部分，分别转移至如图4所示的融合操作盘的2号和3号M2滴中待用；
将2号M2滴中的去核卵母细胞转移至上述1mg/mL植物凝集素(PHA)滴中，放置1-2秒后迅速将其移至上述含体细胞的M2操作滴中，挑选单个体细胞与之贴合，形成去核卵母细胞-体细胞复合体84个；
将去核卵母细胞-体细胞复合体转移到融合操作液(PFM)滴中平衡5秒。其中电融合操作液(PFM)的成份如下：54.65mg/mL甘露醇、1mg/mL聚乙烯醇和0.145mg/mL硫酸镁。
然后将平衡后的去核卵母细胞-体细胞复合体转移至载有融合操作液的电极融合槽中，细胞融合仪参数为DC80V、40μs、AC9V，同时将3号M2滴中剩余的另一半去核卵母细胞经过PFM滴平衡后也转移到该电极融合槽中，并悬挂于去核卵母细胞-体细胞复合体下，形成去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞的三体结构，进行电击，然后将该三体结构转移到融合操作盘的最后一排M2滴中；
将上述去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞三体结构转入图5所示的培养盘中的2号胚胎培养液(CZB)孔中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养1小时，以便于该三体结构融合成一体，形成单个重构胚结构。84个去核卵母细胞-体细胞复合体中，最终成功获得57个单个重构胚结构。
6、激活重构胚以形成囊胚
从培养箱中取出图5所示的培养盘，将重构胚转移至培养盘的1号化学激活操作液孔中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养6小时，进行化学激活。
其中化学激活操作液的成份如下：4.789mg/mL氯化钠、0.36mg/mL氯化钾、0.159mg/mL磷酸钾、0.291mg/mL七水硫酸镁、2.1mg/mL碳酸氢钠、1mg/mL葡萄糖、0.029mg/mL丙酮酸钠、0.146mg/mL谷氨酰胺、0.37％乳酸钠(60％糖浆)、0.038mg/mL乙二胺四乙酸、0.1mg/mL聚乙烯醇、5mg/mL牛血清白蛋白、5μg/mL细胞松弛素B(CB)和2.666mg/mL六水氯化锶。
将培养盘的3号和4号孔用打孔针打孔，形成孔中孔(WOW)结构。将重构胚从培养盘的1号化学激活操作液孔中移出，移至2号孔清洗5秒钟，然后将上述57枚重构胚胎平均分配至3号和4号孔的小孔内，加入胚胎培养液(CZB)，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养108小时，形成囊胚，囊胚形态如图9和图10所示(观察到13个囊胚)。
其中胚胎培养液(CZB)的成份如下：4.789mg/mL氯化钠、0.36mg/mL氯化钾、0.159mg/mL磷酸钾、0.291mg/mL七水硫酸镁、2.1mg/mL碳酸氢钠、1mg/mL葡萄糖、0.029mg/mL丙酮酸钠、0.251mg/mL二水氯化钙、0.146mg/mL谷氨酰胺、0.37％乳酸钠(60％糖浆)、0.038mg/mL乙二胺四乙酸、0.1mg/mL聚乙烯醇和5mg/mL牛血清白蛋白。
重复进行本实施例的实验31次，共收集到488个卵巢，5308个卵子，最终获得350个囊胚，平均囊胚率达高到29％。
| 实验次数 | 卵巢数量(个) | 卵子数量(个) | 囊胚数量(个) |
| 31 | 488 | 5308 | 350 |
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种制备克隆小型动物胚胎的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供离体的供体核细胞；
提供离体的卵母细胞；
于含有透明带消化剂的卵母细胞去核液中，将所述卵母细胞进行去核处理，以便获得去核卵母细胞；
将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合，以便获得重构胚；
将所述重构胚进行体外激活，以便获得激活的重构胚；以及
将所述激活的重构胚进行培养，以便获得所述克隆小型动物胚胎。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透明带消化剂为选自链蛋白酶和细胞松弛素B的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞去核液中包含：
5-15μg/mL链蛋白酶；和/或
1-5μg/mL细胞松弛素B。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞去核液中包含：
10μg/mL链蛋白酶；和/或
2.5μg/mL细胞松弛素B。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞去核液中进一步包含：
5-15体积％的TCM199培养基；
0.1-0.3mg/mL碳酸氢钠；
0.1-0.3mg/mL丙酮酸钠；
3-4mg/mL赫佩斯钠盐；
2-3mg/mL赫佩斯酸；
0.1-0.3mg/mL谷氨酰胺；以及
15-25体积％的牛血清。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞去核液中包含：
10体积％的TCM199培养基；
0.17mg/mL碳酸氢钠；
0.20mg/mL丙酮酸钠；
3.60mg/mL赫佩斯钠盐；
2.63mg/mL赫佩斯酸；
0.20mg/mL谷氨酰胺；以及
20体积％的牛血清。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述卵母细胞的透明带半消化时，根据极体定位的方法，将所述卵母细胞的第一极体连同部分卵母细胞质切除，以便实现所述去核处理。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述去核卵母细胞与所述供体核细胞融合，包括：
将所述去核卵母细胞均分为两组；
将其中一组去核卵母细胞与所述供体核细胞进行第一融合，以便形成去核卵母细胞-体细胞复合体；以及
将另一组去核卵母细胞与所述去核卵母细胞-体细胞复合体进行第二融合，以便形成三体结构的去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞，所述三体结构的去核卵母细胞-体细胞-去核卵母细胞即为所述重构胚。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用细胞融合仪，于融合操作液中进行所述第一融合和所述第二融合，
其中，
所述融合操作液包含：
54.65mg/mL甘露醇；
1mg/mL聚乙烯醇；以及
0.145mg/mL硫酸镁，
所述细胞融合仪的参数设置为DC80V，40μs，AC9V。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述重构胚置于化学激活操作液中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养4-8小时，优选6小时，以便实现所述体外激活，
其中，所述化学激活操作液包含：
4.789mg/mL氯化钠；
0.36mg/mL氯化钾；
0.159mg/mL磷酸钾；
0.291mg/mL七水硫酸镁；
2.1mg/mL碳酸氢钠；
1mg/mL葡萄糖；
0.029mg/mL丙酮酸钠；
0.146mg/mL谷氨酰胺；
0.37体积％的乳酸钠；
0.038mg/mL乙二胺四乙酸；
0.1mg/mL聚乙烯醇；
5mg/mL牛血清白蛋白；
5μg/mL细胞松弛素B；以及
2.666mg/mL六水氯化锶，
任选地，将所述激活的重构胚置于胚胎培养液中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养100-120小时优选108小时，以便获得所述克隆小鼠胚胎，
其中，所述胚胎培养液包含：
4.789mg/mL氯化钠；
0.36mg/mL氯化钾；
0.159mg/mL磷酸钾；
0.291mg/mL七水硫酸镁；
2.1mg/mL碳酸氢钠；
1mg/mL葡萄糖；
0.029mg/mL丙酮酸钠；
0.251mg/mL二水氯化钙；
0.146mg/mL谷氨酰胺；
0.37体积％的乳酸钠；
0.038mg/mL乙二胺四乙酸；
0.1mg/mL聚乙烯醇；以及
5mg/mL牛血清白蛋白，
任选地，所述小型动物为哺乳动物，优选为鼠科、兔科、猫科、或犬科的至少一种，更优选为小鼠。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410189550.2A CN105087653B (zh) | 2014-05-06 | 2014-05-06 | 制备克隆小型动物胚胎的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410189550.2A CN105087653B (zh) | 2014-05-06 | 2014-05-06 | 制备克隆小型动物胚胎的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105087653A true CN105087653A (zh) | 2015-11-25 |
| CN105087653B CN105087653B (zh) | 2019-01-08 |
Family
ID=54568982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410189550.2A Expired - Fee Related CN105087653B (zh) | 2014-05-06 | 2014-05-06 | 制备克隆小型动物胚胎的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105087653B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106754348A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-05-31 | 南京农业大学 | 一种电激活设备及采用其的卵母细胞或者胚胎的rna干扰新方法 |
| CN107460208A (zh) * | 2017-09-08 | 2017-12-12 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 哺乳动物体细胞克隆方法和使用的培养液 |
| CN110904034A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-03-24 | 芜湖职业技术学院 | 一种去除卵细胞细胞核的方法 |
| CN115305260A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-11-08 | 海南大学 | 一种金鲳鱼受精卵的显微注射方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101313072A (zh) * | 2005-09-08 | 2008-11-26 | 奥尔胡斯大学 | 细胞核移植 |
| CN101429492A (zh) * | 2008-12-12 | 2009-05-13 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种猪卵母细胞体外培养成熟方法 |
-
2014
- 2014-05-06 CN CN201410189550.2A patent/CN105087653B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101313072A (zh) * | 2005-09-08 | 2008-11-26 | 奥尔胡斯大学 | 细胞核移植 |
| CN101313072B (zh) * | 2005-09-08 | 2014-02-12 | 奥尔胡斯大学 | 细胞核移植 |
| CN101429492A (zh) * | 2008-12-12 | 2009-05-13 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种猪卵母细胞体外培养成熟方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 杜卫华等: "化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植", 《中国农业科学》 * |
| 赵禹等: "小鼠卵母细胞化学去核及手工构建核移植胚胎", 《遗传繁育》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106754348A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-05-31 | 南京农业大学 | 一种电激活设备及采用其的卵母细胞或者胚胎的rna干扰新方法 |
| CN106754348B (zh) * | 2016-12-23 | 2024-02-09 | 南京农业大学 | 一种电激活设备及采用其的卵母细胞或者胚胎的rna干扰方法 |
| CN107460208A (zh) * | 2017-09-08 | 2017-12-12 | 英科博雅基因科技（天津）有限公司 | 哺乳动物体细胞克隆方法和使用的培养液 |
| CN110904034A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-03-24 | 芜湖职业技术学院 | 一种去除卵细胞细胞核的方法 |
| CN115305260A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-11-08 | 海南大学 | 一种金鲳鱼受精卵的显微注射方法及应用 |
| CN115305260B (zh) * | 2021-11-30 | 2023-09-22 | 海南大学 | 一种金鲳鱼受精卵的显微注射方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105087653B (zh) | 2019-01-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lagutina et al. | Comparative aspects of somatic cell nuclear transfer with conventional and zona-free method in cattle, horse, pig and sheep | |
| CN108103011B (zh) | 一种牛卵母细胞体外成熟培养液及培养方法 | |
| CN105087653B (zh) | 制备克隆小型动物胚胎的方法 | |
| Peura et al. | A comparison of established and new approaches in ovine and bovine nuclear transfer | |
| Trasorras et al. | In vitro production of embryos in South American camelids | |
| CN105524940A (zh) | 一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体、细胞及方法 | |
| US20190032086A1 (en) | Method for preparing a gene knock-out canine with somatic cell cloning technology | |
| Johnson | Human in vitro fertilisation and developmental biology: a mutually influential history | |
| CN106520838A (zh) | 一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法 | |
| RU2205536C2 (ru) | Способ получения клонированной коровы | |
| CN108707578B (zh) | 一种猪单胚胎体外培养方法 | |
| WO2018205641A1 (zh) | 一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法 | |
| Sparman et al. | Cloning of non-human primates: the road “less traveled by” | |
| Manik et al. | Micromanipulation and cloning studies on buffalo oocytes and embryos using nucleus transfer | |
| CN104388560B (zh) | 一种y染色体标记方法及其应用 | |
| Liu et al. | Fibroblasts from the new-born male testicle of Guangxi Bama mini-pig (Sus scrofa) can support nuclear transferred embryo development in vitro | |
| EP0365562B1 (en) | Bovine nuclear transplantation | |
| Gerger et al. | Impact of cumulative gain in expertise on the efficiency of handmade cloning in cattle | |
| CN108624621B (zh) | 非人灵长类的体细胞克隆动物的制备方法 | |
| Khatir et al. | Preliminary assessment of somatic cell nuclear transfer in the dromedary (Camelus dromedarius) | |
| Goel et al. | Status and Prospects of Reproductive Biotechnologies of Small Ruminants in India: An Overview | |
| CN103710386B (zh) | 转基因动物的制备方法 | |
| CN104450673B (zh) | 一种y染色体修饰方法及其应用 | |
| Moulavi et al. | A Modified Handmade Cloning Method for Dromedary Camels | |
| JP2003503045A (ja) | 異種間核移植技術を用いたクローントラの生産方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200120 Address after: 518120 A205, Peng Fei Road, Dapeng street, Dapeng New District, Shenzhen, Guangdong, China, 7 Patentee after: Shenzhen Huada Gene Agriculture Holding Co.,Ltd. Address before: 518083, 10 floor, Beishan Industrial Zone, 146 North Mountain Road, Yantian District, Guangdong, Shenzhen Co-patentee before: BGI SHENZHEN Co.,Ltd. Patentee before: BGI ARK BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. SHENZHEN |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190108 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |