CN115305260B - 一种金鲳鱼受精卵的显微注射方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水产动物技术领域，尤其涉及一种金鲳鱼受精卵的显微注射方法及应用。本发明对金鲳受精后10分钟内的受精卵进行酶处理，处理后5分钟内向处于1细胞期的受精卵胚盘附近注射含目的基因的质粒，能同时保证显微注射的成功率在90％以上，以及受体金鲳胚胎的成活率在85％以上。利用该方法对金鲳受精卵进行显微注射，本发明能够获得较高的注射成功率和胚胎存活率。为在金鲳上开展基因功能研究和分子育种提供了强有力的技术支持。

Description

一种金鲳鱼受精卵的显微注射方法及应用

技术领域

本发明涉及水产动物技术领域，尤其涉及一种金鲳鱼受精卵的显微注射方法及应用。

背景技术

金鲳是鲹科鲳鲹属的代表种，具有肉质鲜嫩和生长速度快等特点，目前已成为我国南方地区海水大宗网箱养殖品种之一，前景广阔。作为中国海水网箱养殖量快速增长的重要经济物种之一，金鲳生长具有性别二态性，雌性生长速度比雄性快，并且在养殖后期(8月龄)呈显著差异。然而，由于对金鲳性别决定和分化机制了解较少，严重制约了其性别控制育种技术的发展，开展金鲳基因功能研究，开发分子育种技术具有重要的应用价值。目前，对于金鲳基因功能的研究仅仅停留在基因的发现、克隆和表达模式分析。在金鲳基因具体功能、分子调控机制和分子育种等方面的研究进展缓慢，主要原因是缺乏有效的适用于金鲳的基因敲除技术。

鱼类受精卵显微注射技术是使用显微注射仪在在显微镜或解剖镜下将玻璃注射针中的外源物质注入鱼类受精卵的实验方法，近年来，随着显微注射技术在斑马鱼等模式生物中的快速发展，已经成为进行鱼类基因编辑和功能研究中应用最广泛最有效的基因转移方法，更是成为研究水产动物生命活动机理必不可少的技术手段。

适合进行显微注射的受精卵具有胚胎清晰、卵壳透明、柔软、易刺破等特点。但是，金鲳受精卵遇水后卵壳立即膨胀变厚，并逐渐变硬，弹性增强，玻璃注射针很难刺破卵壳进行显微注射。并且金鲳受精卵卵径较小，且为浮性卵，很难进行固定，更增加了显微注射难度。

针对上述问题，本发明提供了一种金鲳受精卵的快速高效显微注射方法，可以利用该方法对金鲳进行受精卵进行显微注射，对关键功能基因进行精准编辑，为金鲳基因功能、分子调控机制和分子育种等方面的研究提供了强有力的技术手段。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种金鲳鱼受精卵的显微注射方法及应用，该方法注射成功率和注射后胚胎孵化率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种金鲳鱼的显微注射方法，包括：

步骤1)、收集金鲳鱼受精后10分钟内的受精卵；

步骤2)、用含1.8-2mg/mL链霉蛋白酶、0.05-0.1mg/mL的胰蛋白酶的处理液浸泡所述受精卵，去除受精卵透明带；

步骤3)、去除受精卵透明带后5min内，向处于1细胞期的受精卵胚盘附近显微注射包含目的基因片段的质粒。

本发明中，金鲳鱼包括布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)和卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)，包括但不仅限于此。

本发明步骤2)中，所述处理液的溶剂为海水；所述链霉蛋白酶的浓度优选为2mg/mL或1.8mg/mL，胰蛋白酶的浓度为0.1mg/mL或0.05mg/mL。

本发明步骤2)中，所述浸泡的时间为2分钟。

本发明步骤3)中，所述显微注射包括：

将步骤2)中去除透明带的金鲳受精卵置于的显微注射模具上，吸干水分后，置于显微镜下，调至视野清晰，用干净胎毛发圈将受精卵拨至胚盘斜向上位置；调节显微注射针的针头进入显微镜视野，并确定注射针头和待注射胚胎在同一视野下，将显微注射针中的质粒注射到受精卵。

本发明所述的显微注射方法，所述步骤3)之后还包括人工孵化的步骤。

优选地，所述人工孵化为：将步骤3)进行显微注射后的受精卵置于25-26℃的灭菌海水中孵化，中间换水2～3次。

本发明中，所述受精卵为经人工催产、授精获得的受精卵，人工催产和授精采用本领域常用的方法即可。

本发明具体实施例中，所述显微注射方法包括如下步骤：

(1)金鲳亲鱼人工催产、授精

在金鲳繁殖季节，挑选腹部膨大柔软的金鲳亲鱼进行催产。催产后将亲鱼放入室内循环水水泥池中，水泥池中放产卵网，让其自然产卵、授精。

(2)金鲳受精卵收集

金鲳亲鱼催产后效应时间一般为30～40小时，产卵后收集受精卵。

(3)金鲳受精卵透明带去除

将收集的干净受精卵置于2mg/mL的链霉蛋白酶溶液和0.1mg/mL的胰蛋白酶溶液混合液中浸泡2分钟后，逐渐加入干净海水终止消化，即可去除大部分受精卵透明带。

(4)金鲳受精卵显微注射

将去除透明带的金鲳受精卵置于自制的显微注射模具上，吸干水分后放置于显微镜下，调节显微注射针的针头进入显微镜视野，并确定注射针头和待注射胚胎在同一视野下，在受精卵发育至二细胞期之前完成完成注射。

(5)金鲳受精卵孵化

注射后的金鲳受精卵移入26℃的灭菌海水中曝气培养孵化，中间换水2-3次。

本发明还提供了所述的显微注射方法在金鲳基因功能研究中的应用。

本发明所述应用具体为：收集金鲳受精卵，并在授精后10分钟内去除受精卵透明带，处理后5分钟内将包含有目的基因的待注射质粒，利用显微注射的方式向处于1细胞期的受精卵胚盘附近进行显微注射。

附图说明

图1示未经任何处理的金鲳受精卵，卵壳厚、有弹性、不易破；

图2示经过本发明方法处理后的金鲳受精卵，卵壳薄、弹性小、易破；

图3示对经过本发明方法处理后的金鲳受精卵进行显微注射过程；

图4示经过本发明显微注射后正常发育的胚胎(A)和孵化的幼鱼(B)。

具体实施方式

本发明提供了一种金鲳鱼受精卵的显微注射方法及应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，但不构成对本发明的限制。本发明以显微注射对象为卵形鲳鲹受精卵为例进行说明，其他种类的鲳鲹，如布氏鲳鲹等，利用本发明提供的方法，也能成功地实施显微注射及注射后胚胎的正常发育。

实施例1金鲳受精卵的制备

1)金鲳人工催产、授精

选择适龄、体型健壮、健康的金鲳亲鱼，在繁殖季节前3个月采用精养方法进行营养强化。在金鲳繁殖季节，挑选腹部膨大柔软的亲鱼进行催产。催产后将亲鱼放入室内循环水水泥池中，水泥池中放产卵网，让其自然产卵、授精。

2)金鲳受精卵收集

金鲳亲鱼催产后效应时间一般为30～40小时。在产卵前6小时，开始实时观察亲鱼行为，并且每隔10分钟用密网在产卵网中打捞观察，一旦捞到受精卵就立即收集清洗，得到1细胞期金鲳受精卵。

实施例2金鲳受精卵的显微注射方法

1)、金鲳受精卵透明带去除

将收集的干净受精卵置于盐度为30的干净海水中，选择浮在水面的优质受精卵。称取适量链霉蛋白酶和胰蛋白酶试剂，配制浓度为2mg/mL的链霉蛋白酶溶液和0.1mg/mL的胰蛋白酶溶液混合液，将收集的优质金鲳受精卵置于链霉蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液混合液中浸泡2分钟后，逐渐加入干净海水终止消化，即可去除大部分受精卵透明带。

2)、金鲳受精卵显微注射

将去除透明带的金鲳受精卵置于自制的显微注射模具上，吸干水分后放置于显微镜下，调至视野清晰，用干净胎毛发圈将受精卵拨至胚盘斜向上位置。调节显微注射针的针头进入显微镜视野，并确定注射针头和待注射胚胎在同一视野下。在受精卵发育至二细胞期之前完成注射(如图3所示)。将完成注射之后的受精卵和未处理过的受精卵置于显微镜下观察，结果如图1～2所示，未处理的受精卵卵壳厚、有弹性、不易破，经过本发明处理的受精卵卵壳薄、弹性小、易破。

3)、显微注射胚胎阳性检测

将显微注射后的胚胎置于26℃干净海水中培养，使用Leica荧光显微镜观察胚胎，出现绿色荧光的胚胎为显微注射成功地胚胎。

4)、金鲳受精卵孵化

注射后的金鲳受精卵移入26℃的灭菌海水中曝气培养孵化，中间换水2-3次。孵化时，每个1小时观察受精卵情况，将沉底的死胚去除，正常培育35-38小时后孵化出仔鱼。正常发育的胚胎(图4A)和孵化的幼鱼(图4B)。

5)孵化后幼苗培育

出孵仔鱼平均全长为1.5mm左右，卵黄囊较大而透明，呈椭圆形，油球较小，位于卵黄囊巾部靠前端(图4B)。刚孵化的仔盘悬浮于静止的水体中，无运动能力，仅尾部能屈曲、颤动。约在孵化后50小时左右，仔鱼开口，开始摄食，可投喂经100目筛绢网过滤出的轮虫、桡足类幼体等。

实施例3注射成功率和孵化率统计

1)成功率统计

对经本发明处理过的受精卵进行显微注射。经统计，在5批次注射过程中，共注射受精卵498粒，其中注射后还保持外观完整的胚胎个数为465粒，注射成功率为93.4％。

2)孵化率统计

对上述1)中465粒注射后保持外观完整的受精卵进行培养孵化，经36小时孵化，共得到出孵仔鱼398尾，孵化率为85.6％。

对比例1其他处理方法处理胚胎后的胚胎注射成功率和孵化率

1)使用1mg/mL链霉蛋白酶和0.1mg/mL的胰蛋白酶的处理液浸泡受精卵后进行注射。经统计，在3批次注射过程中，共注射受精卵289粒，其中注射后还保持外观完整的胚胎个数为165粒，注射成功率为57.1％，远低于本发明的结果。2)对上述1)中的165粒注射后保持外观完整的受精卵进行培养孵化，经36小时孵化，共得到出孵仔鱼84尾，孵化率为50.9％，远低于本发明的结果。

对比例2正常未经本发明方法处理的胚胎注射成功率和孵化率

1)对正常未经本发明方法处理的胚胎进行显微注射，会出现如下情况：一是胚胎滑动，无法完成注射；二是胚胎破损，由于未处理胚胎卵膜较厚，需用较大压力才能刺破卵膜，故容易导致胚胎破损。对正常未经本发明方法处理的胚胎进行注射，经统计，分3批次共注射146粒，其中注射后还保持外观完整的胚胎个数为24粒，注射成功率为16.4％，远低于本发明的结果。

2)对上述1)中的24粒注射后保持外观完整的受精卵进行培养孵化，经36小时孵化，共得到出孵仔鱼3尾，孵化率为12.5％，远低于本发明的结果。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种金鲳鱼的显微注射方法，其特征在于，包括：

步骤1）、收集金鲳鱼受精后10分钟内的受精卵；

步骤2）、用含2mg/mL链霉蛋白酶、0.1mg/mL的胰蛋白酶的处理液浸泡所述受精卵2分钟，去除受精卵透明带；所述处理液的溶剂为海水；

步骤3）、去除受精卵透明带后5min内，向处于1细胞期的受精卵胚盘附近显微注射包含目的基因片段的质粒；

具体操作为：将步骤2）中去除透明带的金鲳受精卵置于的显微注射模具上，吸干水分后，置于显微镜下，调至视野清晰，用干净胎毛发圈将受精卵拨至胚盘斜向上位置；调节显微注射针的针头进入显微镜视野，并确定注射针头和待注射胚胎在同一视野下，将显微注射针中的质粒注射到受精卵。

2.根据权利要求1所述的显微注射方法，其特征在于，所述的金鲳鱼包括布氏鲳鲹和卵形鲳鲹。

3.根据权利要求1或2所述的显微注射方法，其特征在于，所述步骤3）之后还包括人工孵化的步骤。

4.根据权利要求3所述的显微注射方法，其特征在于，所述人工孵化为将步骤3）进行显微注射后的受精卵置于26℃的灭菌海水中孵化，中间换水2~3次。