CN106520838A - 一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法 - Google Patents

一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106520838A
CN106520838A CN201610945400.9A CN201610945400A CN106520838A CN 106520838 A CN106520838 A CN 106520838A CN 201610945400 A CN201610945400 A CN 201610945400A CN 106520838 A CN106520838 A CN 106520838A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
cell
embryo
oocyte
transferred
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610945400.9A
Other languages
English (en)
Inventor
华再东
郑新民
任红艳
李莉
毕延震
张立苹
肖红卫
刘西梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610945400.9A priority Critical patent/CN106520838A/zh
Publication of CN106520838A publication Critical patent/CN106520838A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C12N15/8778—Swine embryos
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，该方法包括以下步骤：目的基因的制备、体细胞核移植以及显微注射技术。在获取目的基因之后，构建表达载体，利用显微操作去除卵母细胞的细胞核，然后将体细胞注入去核的卵母细胞间隙，再将外源基因直接注入体细胞，通过一步电融合、激活，构建重组胚胎，胚胎移植获取转基因后代。本发明避免大片段的基因转染细胞、筛选，提高了转基因效率，节约时间，扩大了转基因应用范围。需要特别注意的是，在核移植操作过程中，采用透明带下注射体细胞，易于显微注射外源目的基因。

Description

一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法。
背景技术
体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)又称体细胞克隆，是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，重新组成一个新的胚胎，不经精子穿透等有性过程即被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制,经过体外培养后，将发育良好的胚胎移植到动物体内的技术。用体细胞核移植的方法最终得到的产物，我们称之为克隆动物。哺乳动物细胞核移植研究经历时间不长，以1997年英国Roslin研究所Wilmut实验室“多利羊”的诞生为标志，揭开了体细胞核移植的序幕。体细胞核移植技术在拯救珍稀濒危动物、进行异体器官移植、应用在克隆性治疗上及生产药用蛋白等方面，具有广阔的应用前景，尤其与基因工程、干细胞技术结合无疑会对自然界及人类社会产生极其深远的影响。
利用SCNT生产转基因动物的过程是首先将外源DNA转染体外培养的体细胞，然后筛选出转基因体细胞作为核供体，将转基因体细胞核移入去核卵母细胞中再通过胚胎移植获得转基因动物，减少转基因动物建系时间，且所需动物数量比原核显微注射法大幅度降低。但是，利用SCNT技术生产转基因猪面临两个重大瓶颈问题，一是至今没有真正分离到具有种系嵌合能力的猪胚胎干细胞系；二是核移供体采用的体细胞，转染大片段目的基因后筛选困难，而且筛选过程中携带选择标记，这也不符合国家转基因生物安全要求。针对以上技术瓶颈问题，本研究者发明一种制备转基因动物的新方法，即将目的基因通过显微注射直接注入体细胞核移植重组胚的供体细胞内，通过一步电融合激活，构建重组胚胎，获取转基因后代。该技术很好的解决了以上两大瓶颈问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，该方法避免采用猪胚胎干细胞作为供体细胞，同时大片段目的基因转染、筛选，以及细胞筛选过程中的标记基因删除，提高了转基因效率，节约时间，扩大了转基因应用范围。需要特别注意的是，在核移植操作过程中，采用透明带下注射体细胞，易于显微注射外源目的基因。
其具体技术方案为：
一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，包括以下步骤：
步骤1、目的基因的制备
获取目的基因，构建表达载体；
步骤2、供体细胞的分离培养
从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养6～8h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；
步骤3、受体细胞的制备
猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为3～6mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置15～20min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗3～5遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后22～44h不加激素；间隔24h调换约1/2～2/3的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；
步骤4、显微操作
将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500Leica上，用固定吸管(内径为25～30μm，外径100～120μm)吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复0.5～1h，然后对完整的存活卵进行激活操作；
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤3～5遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重构卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养0.5～1h后判定融合；
步骤5、胚胎培养与移植
转基因克隆胚胎体外培养1～2天后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植150～250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于28～30d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。
进一步，步骤4中固定吸管的内径为25～30μm，外径100～120μm。
进一步，步骤4中融合槽为BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明致力于生产转基因动物的方法，通过显微注射技术直接将外源目的基因导入重组胚的供体细胞中，避免体细胞转染大片段目的基因后筛选的困难，而且生产的转基因后代不携带任何选择性标记，也符合国家转基因生物安全的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1.本发明大致由三部分组成，目的基因构建、体细胞核移植以及显微注射技术。在获取目的基因之后，构建表达载体，利用显微操作去除卵母细胞的细胞核，然后将体细胞(成纤维细胞)注入去核的卵母细胞间隙，再将外源基因直接注入体细胞，通过一步电融合激活，构建重组胚胎移植给代孕母猪获取转基因后代。
2.本发明与一般核移植转基因实验的不同之处在于，避免大片段的基因转染细胞、筛选，获得的转基因后代不携带任何选择标记，提高了转基因效率，节约时间，扩大了转基因应用范围。需要特别注意的是，在核移植操作过程中，采用透明带下注射体细胞，易于显微注射外源目的基因。
3.重组胎体外培养，1-cell和2-cell期核移植重组胚经过胚胎移植技术植入代孕母畜输卵管内，8-cell期及以上的重组胚胎移入代孕母畜子宫内。在胚胎移植时，用孤雌激活胚与核移植注射基因胚胎共同移植，这样有利于提高代孕母畜的受孕率。
实施例1
一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，包括以下步骤：
步骤1、目的基因的制备
获取目的基因，构建表达载体；
步骤2、供体细胞的分离培养
从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养6h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；
步骤3、受体细胞的制备
猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为3mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置15min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗3遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后22h不加激素；间隔24h调换约1/2的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；
步骤4、显微操作
将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500Leica上，用固定吸管(内径为25～30μm，外径100～120μm)吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复0.5～1h，然后对完整的存活卵进行融合激活操作；
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤3遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重组卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养0.5h后判定融合；
步骤5、胚胎的培养与移植
转基因克隆胚胎体外培养24h后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于28d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。
实施例2
一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，包括以下步骤：
步骤1、目的基因的制备
获取目的基因，构建表达载体；
步骤2、供体细胞的分离培养
从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养7h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；
步骤3、受体细胞的制备
猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为4mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置18min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗4遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后230h不加激素；间隔24h调换约2/3的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；
步骤4、显微操作
将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500Leica上，用固定吸管(内径为25～30μm，外径100～120μm)吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复0.8h，然后对完整的存活卵进行激活操作；
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤4遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重构卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养0.8h后判定融合；
步骤5、胚胎的培养与移植
转基因克隆胚胎体外培养2天后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于29d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。
实施例3
一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，包括以下步骤：
步骤1、目的基因的制备
获取目的基因，构建表达载体；
步骤2、供体细胞的分离培养
从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养8h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；
步骤3、受体细胞的制备
猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为6mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置20min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗5遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后44h不加激素；间隔24h调换约2/3的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；
步骤4、显微操作
将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500，Leica上，用固定吸管(内径为25～30μm，外径100～120μm)吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复1h，然后对完整的存活卵进行激活操作；
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤5遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重构卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养1h后判定融合；
步骤5、胚胎的培养与移植
转基因克隆胚胎体外培养1～2天后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于30d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、目的基因的制备
获取目的基因，构建表达载体；
步骤2、供体细胞的分离培养
从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养6～8h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；
步骤3、受体细胞的制备
猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为3～6mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置15～20min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗3～5遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后22～44h不加激素；间隔24h调换约1/2～2/3的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极体排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；
步骤4、显微操作
将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500Leica上，用固定吸管吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复0.5～1h，最后对完整的存活卵进行激活操作；
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤3～5遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重构卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养0.5～1h后判定融合；
步骤5、胚胎的培养与移植
转基因克隆胚胎体外培养1～2天后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于28～30d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。
2.根据权利要求1所述的体细胞核移植重组胚注射基因新方法，其特征在于，步骤4中固定吸管的内径为25～30μm，外径100～120μm。
3.根据权利要求1所述的体细胞核移植重组胚注射基因新方法，其特征在于，步骤4中融合槽为BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽。
CN201610945400.9A 2016-10-24 2016-10-24 一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法 Pending CN106520838A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610945400.9A CN106520838A (zh) 2016-10-24 2016-10-24 一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610945400.9A CN106520838A (zh) 2016-10-24 2016-10-24 一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106520838A true CN106520838A (zh) 2017-03-22

Family

ID=58293190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610945400.9A Pending CN106520838A (zh) 2016-10-24 2016-10-24 一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106520838A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107227298A (zh) * 2017-05-15 2017-10-03 华南农业大学 一种克隆胚胎处理液及其使用方法以及该处理液的用途
CN107988267A (zh) * 2017-12-18 2018-05-04 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种高通量对受精卵进行基因编辑的电转方法
CN109234225A (zh) * 2018-11-02 2019-01-18 温氏食品集团股份有限公司 一种胚胎培养液及一种体细胞克隆胚胎的处理方法
CN111849768A (zh) * 2020-07-14 2020-10-30 苏州大学 一种卵细胞多效能精准电刺激装置及方法
CN113355364A (zh) * 2021-06-09 2021-09-07 深圳市华大农业应用研究院 利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法
CN114107180A (zh) * 2021-10-21 2022-03-01 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 无透明带体细胞克隆1-细胞期胚胎聚合及体外培养的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773805A (zh) * 2014-01-17 2014-05-07 中山大学 一种猪克隆胚胎的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773805A (zh) * 2014-01-17 2014-05-07 中山大学 一种猪克隆胚胎的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李瑞国: "体细胞基因打靶—核移植技术研究进展", 《中国生物工程杂志》 *
沃兴德 等: "利用爪蟾卵母细胞建立人类低密度脂蛋白受体基因表达系统", 《中国动脉硬化杂志》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107227298A (zh) * 2017-05-15 2017-10-03 华南农业大学 一种克隆胚胎处理液及其使用方法以及该处理液的用途
CN107227298B (zh) * 2017-05-15 2021-06-25 华南农业大学 一种克隆胚胎处理液及其使用方法以及该处理液的用途
CN107988267A (zh) * 2017-12-18 2018-05-04 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种高通量对受精卵进行基因编辑的电转方法
CN109234225A (zh) * 2018-11-02 2019-01-18 温氏食品集团股份有限公司 一种胚胎培养液及一种体细胞克隆胚胎的处理方法
CN109234225B (zh) * 2018-11-02 2022-03-11 温氏食品集团股份有限公司 一种胚胎培养液及一种体细胞克隆胚胎的处理方法
CN111849768A (zh) * 2020-07-14 2020-10-30 苏州大学 一种卵细胞多效能精准电刺激装置及方法
CN111849768B (zh) * 2020-07-14 2022-07-19 苏州大学 一种卵细胞多效能精准电刺激装置及方法
CN113355364A (zh) * 2021-06-09 2021-09-07 深圳市华大农业应用研究院 利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法
CN114107180A (zh) * 2021-10-21 2022-03-01 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 无透明带体细胞克隆1-细胞期胚胎聚合及体外培养的方法
CN114107180B (zh) * 2021-10-21 2024-03-08 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 无透明带体细胞克隆1-细胞期胚胎聚合及体外培养的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106191064B (zh) 一种制备mc4r基因敲除猪的方法
CN106520838A (zh) 一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法
US5057420A (en) Bovine nuclear transplantation
CN104419719B (zh) 一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法
CN101302497B (zh) 利用牛体细胞核移植克隆胚胎的方法
US20190032086A1 (en) Method for preparing a gene knock-out canine with somatic cell cloning technology
CN100334205C (zh) 一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法
CN103993027B (zh) 一种转基因猪筛选标记基因敲除的方法
US6590139B1 (en) Method for producing cloned cows
CN101492669A (zh) 牛精子克隆胚胎的方法
Church Embryo manipulation and gene transfer in domestic animals
RU2216591C2 (ru) Способ получения клонированных эмбрионов человека путем применения способа межвидовой трансплантации ядер
CN100404675C (zh) 一种生产体细胞克隆猪的方法
CN1735338A (zh) 利用体细胞核转移胚胎作为细胞供体进行附加核转移的方法和系统
CN110684720B (zh) 一种以异种动物间的卵母细胞为介质获得雄原核的方法
CN103952424B (zh) 生产mstn双侧基因敲除的双肌性状体细胞克隆猪的方法
CN102344941A (zh) 一种培育克隆动物或转基因克隆动物的方法
US7411111B2 (en) Method for cloning of the rat by nuclear transfer
JP2002511234A (ja) ブタの核移植
CN104651407A (zh) 一种猪克隆胚胎的高效制备方法
KR20080077738A (ko) 돼지 미성숙란의 체외배양 방법
CN104630277A (zh) 一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法
CN104450673B (zh) 一种y染色体修饰方法及其应用
CN100526456C (zh) 一种同体细胞核移植方法
JP4119513B2 (ja) クローン動物の作出方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170322

RJ01 Rejection of invention patent application after publication