CN104630277A - 一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，属于生物工程的动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域。所述方法包括：(1)、用于构建转基因克隆胚胎的转外源基因水牛胎儿成纤维细胞的制备；(2)、用于构建转基因克隆胚胎的受体卵胞质的制备；(3)、水牛转基因克隆重构胚的构建；(4)、水牛转基因克隆重构胚的培养。本发明的方法具有以下优点：用本发明的方法，成功获得了手工克隆水牛转基因胚胎，转基因克隆胚胎的囊胚发育率达到33.3％；相比于显微操作核移植方法，手工克隆无需昂贵仪器设配，简化了克隆的操作流程。

Description

一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法

技术领域

本发明属于生物工程的动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域；具体涉及一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法。

背景技术

转基因动物是指将特定的外源基因导进动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因组并能遗传给后代的一类动物。其主要特点是人类有目的的、有计划、有根据、有预见的改变动物的遗传结构，而赋予转基因动物新的表型特征。

水牛是我国南方一种极具开发前景的重要家畜，因其适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使用年限长和乳品营养价值高等特性，而倍受人们关注与重视。然而，目前我国水牛品种的产奶量和繁殖率低，严重制约水牛奶业的发展，急需应用基因工程技术对其进行改良，克隆技术可为此提供平台。

克隆是英文“clone”的音译，是指一个动物经无性繁殖可孤雌生殖产生的后代，克隆的所有后代的遗传组成是完全相同的，又称无性繁殖细胞系。目前体细胞克隆的方法有显微操作核移植和手工克隆。

发明内容

显微操作核移植是通过显微操作去核，电融合等实验室手段，将核供体细胞与去核的卵母细胞受体胞质进行体外重构。相比于显微核移植技术，手工克隆不需要借助于昂贵的显微操作系统，操作过程简单、快速且后期的囊胚发育率高。所以手工克隆技术更适宜用于大批量生产体细胞克隆水牛胚胎。但是，手工克隆在操作过程中，水牛卵母细胞需消化透明带，其去核方法、融合参数与显微操作核移植有较大差异，且颗粒细胞共培养的胚胎培养体系也无法支持无透明带克隆胚胎的发育。为此，本发明摸索了新的去核方法、手工克隆过程中的相关参数，以及完善了胚胎培养液，建立一种稳定的采用采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法。

为了提供一种稳定的利用手工克隆技术生产水牛转基因克隆胚胎方法，本发明的目的在于公开了一种采用采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，包括下述步骤：

(1)、用于构建转基因克隆胚胎的转外源基因水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的制备；

(2)、用于构建转基因克隆胚胎的受体卵胞质的制备；

(3)、水牛转基因克隆重构胚的构建：步骤(2)的受体卵胞质与步骤(1)的转外源基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的水牛胎儿成纤维细胞供体细胞经植物凝集素作用粘合形成半卵-供体-半卵复合体；并采用一步融合法，通过100V/mm直流电波、脉冲时间10μs、2次脉冲进行电融合以构建得到采用手工克隆技术构建的水牛转基因克隆重构胚；

(4)、水牛转基因克隆重构胚的培养：水牛转基因重构胚经5μmol/L离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤培养3h进行化学激活处理后，置于含有混合培养液的微穴中培养6-7天，可获得发育到囊胚阶段的水牛转基因克隆胚胎，其中混合培养液是由RVCL液与SOF液以体积比1:1混合。

上述技术方案所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其中，步骤(1)的具体过程为：

(A)、采用组织块培养法将剪碎的水牛胎儿的耳部皮肤组织均匀地平铺于60mm的皿底，加入10％FBS的DMEM培养液1ml，轻轻移入38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱中培养5h，待组织块贴壁后，再加入3ml含10％FBS的DMEM培养液，进行原代培养，每隔2～3d换一次液；

(B)、待原代细胞长到80～90％汇合时，开始进行细胞传代：采用常规的细胞传代方法，先用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS洗两遍，加入3ml含0.25％胰蛋白酶的Hank’s液消化3～5min，待细胞变圆时，小心吸出消化液，再加入3ml含10％FBS的DMEM培养液终止消化；弃去皿内组织块，用吸管轻轻吹打使细胞悬浮，收集悬浮液于5ml离心管，采用1200rpm离心5min，重悬液以1×10⁶细胞/ml接种于含有10％FBS的DMEM培养液的新的培养皿中，放入38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱中培养；此后每隔3～4d传一代，传代比例约为1:3；

(C)、使用采用电穿孔转染法将线性质粒pCE-EGFP-IRES-neo转染到第3代的水牛胎儿成纤维细胞：将第3代的水牛胎儿成纤维细胞接种到含10％FBS的DMEM培养液中置于38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱内培养3天；转染前用含0.25％胰蛋白酶的Hank’s液消化3～5min，直到大部分细胞变圆后，加入等体积的含10％FBS的DMEM液终止消化，然后收集细胞，并加入PBS液制成10⁶/mL的细胞悬液转移至0.4cm的电击杯中，同时加入10μg线性质粒pCE-EGFP-IRES-neo混匀后，室温放置5min；使用电融合仪在150V、10ms、1次脉冲的条件下进行电击，电击后冰上放置5min，再接种至含10％FBS的DMEM培养液的培养皿中培养，待细胞生长状态恢复，加入600μg/ml G418进行抗性细胞筛选7天后再用200ng/μl G418筛选7天，每3～4d换液一次，挑取细胞数超过60个的细胞集落进行扩大培养后作为构建水牛转基因克隆胚胎的供体细胞。

上述技术方案所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其中，步骤(2)的具体过程为：

(a)、从屠宰场收集的水牛卵巢上抽取卵母细胞经体外成熟培养22-24h；

(b)、去除卵母细胞周围的卵丘细胞后，经0.5μg/ml秋水仙胺处理15分钟，2mg/ml链蛋白酶消化8分钟去除透明带；

(c)、去除透明带的卵母细胞放置于操作液滴中，于体视显微镜下利用手工克隆专用切割刀将卵母细胞的凸起部分及1/3的胞质切掉以去核，所述操作液滴为含有5mg/L细胞松弛素B的M199基础液；

(d)、去核的卵母细胞移入SOF培养液中，放入胚胎培养箱中恢复培养30min，作为构建水牛转基因克隆胚胎的受体卵胞质。

上述技术方案所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其中，步骤(3)的具体过程为：

(ⅰ)、步骤(1)中培养的转外源基因EGFP的BFF培养皿中DMEM液体吸掉，用无血清的PBS清洗2次，经0.25％胰蛋白酶的Hank’s液消化3～5min后，收集获得的细胞放置于含有0.01g/ml PVA的SOF培养液滴中沉降5～8min；步骤(2)中的一部分去核半卵放置于含0.5mg/ml植物凝集素PHA的SOF培养液微滴中处理5-10s，然后将经植物凝集素PHA处理的去核卵母细胞移至放置有供体细胞的含0.01g/ml PVA的SOF培养液滴中，使用捡卵针吹动受体去核半卵使之与单个供体细胞接触粘合，形成供体-半卵复合体；步骤(2)中的另一部分去核半卵放置于含有0.5mg/ml植物凝集素的SOF培养液滴中处理5-10s，然后移入含有供体-半卵复合体的含0.01g/ml PVA的SOF培养液滴中，用捡卵针吹动其中一个半卵将其与供体-半卵复合体粘合成串，使半卵-供体-半卵三者呈直线排列，形成半卵-供体-半卵复合体，最后将这种半卵-供体-半卵复合体移入SOF液中恢复培养以进一步进行电融合；

(ⅱ)、采用一步融合法进行电融合：粘合后的半卵-供体-半卵复合体先在1ml由0.28mol/L甘露醇、0.1mmol/L CaCl₂、0.1mmol/L MgSO₄、5mmol/L Hepes、0.1％BSA和5mg/L酚红组成的融合液中放置2min，而后将其移入显微操作仪上两电极间的100μl融合液的微滴中，用其中一根铂金丝轻轻拨动细胞调整位置，在100v/mm、10μs条件下、2次电脉冲进行融合，将电刺激后半卵-供体-半卵复合体移入SOF液中，置于胚胎培养箱中恢复培养30min，使细胞相互融合。

上述技术方案所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其中，步骤(4)的具体过程为：

I、步骤(3)中得到的水牛手工克隆转基因重构胚经5μmol/L离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤培养3h以进行化学激活处理；

II、经化学激活处理的重构胚在含有混合培养液的微穴中置于38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱中培养6-7天，获得发育到囊胚阶段的水牛转基因克隆胚胎，其中混合培养液是由RVCL液与SOF液以体积比1:1混合。

本发明具有以下有益效果：

(1)、用本发明的方法，成功获得了手工克隆水牛转基因胚胎，转基因克隆胚胎的囊胚发育率达到33.3％。

(2)、本发明的方法相比于显微操作核移植方法手工克隆无需昂贵仪器设配，简化了克隆的操作流程。

附图说明：

1、图1为本发明获得的半卵-供体-半卵复合体(常光，×100)。

2、图2为半卵-供体-半卵复合体构建示意图。

3、图3为本发明使用的用于培养水牛手工克隆转基因胚胎的微穴。

4、图4为本发明获得的水牛手工克隆转基因囊胚(常光，×100)。

5、图5为本发明获得的水牛手工克隆转基因囊胚(荧光，×100)。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法作进一步的说明。

本发明中，一步融合法采用的细胞融合仪为ECM-2001，电极为两根安装在显微操作仪上可活动的距离为0.2mm的铂金丝。

本发明实施例中所用的SOF培养液的组份为：107.63mmol/L NaCl、7.16mmol/L KCl、1.19mmol/L KH₂PO₄、1.51mmol/L MgSO₄、1.78mmol/L CaCl₂·H₂O、5.35mmol/L SoduimLactate、25mmol/L NaHCO₃、7.27mmol/L NA-pyruvate、0.2mmol/L Glutamine、0.34mmol/LSoduim citrate、2.77mmol/L Myo-inosito、l50ug/ml Gentamycine、10ug/ml phenol-red。

本发明实施例中所用的胰蛋白酶消化体系：Nacl6.7g/L、KCL0.3g/L、NaH2PO40.12g/L、D-Glucose1g/L、HEPES1.2g/L、Sodium pyruvate 0.12g/L、NaHCO32.5g/L、EDTA0.2g/L、Tryspin2.5g/L、Phenol red 0.01g/L、H2O至1L。

本发明实施例中所用的RVCL液购置于澳大利亚COOK公司；M199、DMEM培养液购置于美国GIBCO公司。

实施例1：采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法：

一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，包括下述步骤：

(一)、用于构建转基因克隆胚胎的转外源基因水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的制备：

取屠宰后母水牛腹中的水牛胎儿，将水牛胎儿耳部皮肤组织用75％酒精浸泡30s进行消毒，并用PBS液清洗干净后，用灭菌眼科剪将水牛胎儿的耳部皮肤组织剪碎至2mm 3小块，采用组织块培养法将剪碎的组织均匀地平铺于60mm的皿底；加入10％FBS的DMEM培养液1ml，但要防止组织块飘起来，轻轻移入38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱中培养5h，待组织块贴壁后，再加入3ml含10％FBS的DMEM培养液，进行原代培养，每隔2～3d换一次液；

待原代细胞长到80～90％汇合时，开始进行细胞传代：采用常规的细胞传代方法，先用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS洗两遍，加入3ml含0.25％胰蛋白酶的Hank’s液消化3～5min，待细胞变圆时，小心吸出消化液，再加入3ml含10％FBS的DMEM培养液终止消化。弃去皿内组织块，用吸管轻轻吹打使细胞悬浮，收集悬浮液于5ml离心管，采用1200rpm离心5min，重悬液以1×10⁶细胞/ml接种于含有10％FBS的DMEM培养液的新的培养皿中，放入培养箱中在38.5℃，5％CO₂和100％湿度的条件下进行培养；此后每隔3～4d传一代，传代比例约为1:3；

使用采用电穿孔转染法将pCE-EGFP-IRES-neo线性质粒DNA(由中国农业大学李宁实验室提供)转染到第3代的水牛胎儿成纤维细胞：首先第3代的水牛胎儿成纤维细胞接种到100mm培养皿内，加入含10％FBS的DMEM培养液置38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱内培养3天；转染前用含0.25％胰蛋白酶的Hank’s液消化3～5min，直到大部分细胞变圆后，加入等体积的含10％FBS的DMEM液终止消化，然后收集细胞，并加入PBS液制成10⁶/mL的细胞悬液转移至0.4cm的电击杯中，同时加入10μg的pCE-EGFP-IRES-neo线性质粒DNA混匀后，室温放置5min；使用电融合仪采用150V，10ms，1次脉冲的参数进行电击，电击后冰上放置5min，再接种至含10％FBS的DMEM培养液的体积为100mm培养皿中培养，待细胞生长状态恢复，加入600μg/ml G418进行抗性细胞筛选7天后再用200ng/μl G418筛选7天，每3～4d换液一次，并观察细胞生长情况；最后，挑取细胞数超过60个的细胞集落进行扩大培养后作为构建生产水牛转基因克隆胚胎的供体细胞。

(二)、用于构建转基因克隆胚胎的受体卵胞质的制备：

从屠宰场收集的水牛卵巢，放于盛有37℃的生理盐水保温瓶中，4h以内运到实验室；先用75％的酒精浸泡20-30s，再用经高压灭菌的37℃生理盐水清洗2遍；然后用带有12号针头的10ml注射器抽吸直径为2-6mm卵泡的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocytecomplexes，COCs)。在体视显微镜下挑选出卵母细胞胞质均匀，外层有完整或部分颗粒细胞层的卵母细胞，在M199洗液中洗3遍，放入含有1.5ml由TCM-199、5％OCS和0.1μg/ml FSH组成的成熟液的玻璃培养皿中，在38.5℃，5％CO₂和100％湿度的胚胎培养箱中培养22-24h。

将经过22-24h体外成熟培养的水牛卵母细胞反复吹打去除周围的卵丘细胞，随后将卵母细胞移入0.1％的透明质酸酶(Hyaluronidase solution，Hya)中处理30～60s，轻轻吹打，完全去除卵丘细胞，经0.5μg/ml秋水仙胺处理15分钟，将这些细胞移入浓度为2mg/ml链蛋白酶(Pronase)溶液中，处理8min，待透明带即将消失时移出，洗涤数次后移入38.5℃，5％CO₂和100％湿度的胚胎培养箱中恢复培养10min，再将其移入100μl操作液滴(操作液滴为含5mg/L细胞松弛素B的M199基础液)中(上盖矿物石蜡油)，于体视显微镜下用手工克隆切割刀将卵母细胞的凸起及1/3的胞质切掉以去核，去核的卵母细胞移入SOF胚胎培养液中，放入38.5℃，5％CO₂和100％湿度的胚胎培养箱中恢复培养30min，以便去核后的半卵恢复圆形待用于生产水牛转基因克隆胚胎的受体胞质。

(三)、水牛手工克隆转基因重构胚的构建：

步骤(一)中培养的转外源基因EGFP的BFF培养皿中DMEM液体吸掉，用无血清的PBS清洗2次，经0.25％胰蛋白酶的Hank’s液消化3～5min后，收集获得的细胞放置于含有0.01g/ml PVA的SOF培养液滴中沉降5～8min；步骤(二)中的一部分去核半卵放置于含植物凝集素微滴(含0.5mg/ml植物凝集素PHA的SOF培养液微滴)中处理5-10s，然后将经植物凝集素PHA处理的去核卵母细胞移至放置有供体细胞的含0.01g/ml PVA的SOF培养液滴中，使用捡卵针吹动受体去核半卵使之与单个供体细胞接触粘合，形成供体-半卵复合体；步骤(二)中的另外一部分去核半卵放置于含有0.5mg/ml植物凝集素PHA的SOF培养液滴中处理5-10s，然后移入含有供体-半卵复合体的含0.01g/ml PVA的SOF培养液滴中，用捡卵针吹动其中一个半卵将其与供体-半卵复合体粘合成串，使半卵-供体-半卵三者呈直线排列，形成半卵-供体-半卵复合体(半卵-供体-半卵复合体如图1所示，其构建示意图如图2所示)，最后将这种半卵-供体-半卵复合体移入SOF液中恢复培养以进一步进行电融合；

本发明采用一步融合法，细胞融合仪为ECM-2001，电极为两根安装在显微操作仪上可活动的距离为0.2mm的铂金丝。粘合后的半卵-供体-半卵复合体先在1ml融合液(融合液由0.28mol/L甘露醇、0.1mmol/L CaCl₂、0.1mmol/L MgSO₄、5mmol/L Hepes、0.1％BSA和5mg/L酚红组成)中放置2min，而后将其移入显微操作仪上两电极间的100μl融合液的微滴中，用其中一根铂金丝轻轻拨动细胞，将半卵-供体-半卵复合体调到适当的位置后，采用电融合参数为100v/mm，10μs，2次电脉冲进行融合构建克隆重构胚，将电刺激后半卵-供体-半卵复合体移入SOF培养液中，置于38.5℃，5％CO₂和100％湿度的胚胎培养箱中恢复培养30min以便细胞融合在一起。

(四)、水牛手工克隆转基因重构胚的培养：

经步骤(三)电融合后的水牛半卵-供体-半卵复合体在体视显微镜下检查重构胚的融合情况，将已经融合在一起并变为圆形的重构胚置于100μl含5μmol/L离子霉素的M199液滴中处理5min后，用M199培养液清洗2次，再用1ml的含2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤的M199液培养液培养3h以进行化学激活处理；

重构胚的培养采用的是四孔板，每个孔制备了20个微穴(如图3所示)，并加入总体积为400μl的混合培养液(混合培养液是由RVCL液与SOF液以体积比1:1混合)，预热2～3h。将激活后的水牛手工克隆重构胚移入预先制备好的微穴、并预热有培养液的四孔板中，每个微穴放一枚重构胚，然后轻放于38.5℃、5％CO_2，100％湿度的培养箱中进行体外培养；水牛手工克隆重构胎在体外培养6-7d后，获得发育至囊胚阶段的水牛转基因克隆胚胎(如图4所示)，同时可将获得的核移植囊胚在倒置荧光显微镜下观察EGFP的表达情况(如图5所示)。

实施例2：

2013和2014年，采用实施例1的方法生产水牛转外源基因EGFP囊胚516枚，其囊胚率可达33.3％，囊胚内细胞团清晰可见，细胞排列紧密。获得的克隆囊胚在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况，这些转基因胚胎均表达EGFP标记基因，证明用本发明的方法可成功生产水牛转基因克隆胚胎。

综上所述，本发明通过对水牛卵母细胞诱导凸起，切割去核，植物凝集素粘合成半卵-供体-半卵复合体，电融合等过程可构建水牛手工克隆转基因胚胎，RVCL培养液与SOF液按1：1混合的培养液可脱离颗粒细胞共培养体系支持水牛手工克隆胚胎的发育。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，包括下述步骤：

(1)、用于构建转基因克隆胚胎的转外源基因水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的制备；

(2)、用于构建转基因克隆胚胎的受体卵胞质的制备；

(3)、水牛转基因克隆重构胚的构建：步骤(2)的受体卵胞质与步骤(1)的转外源基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的水牛胎儿成纤维细胞供体细胞经植物凝集素作用粘合形成半卵-供体-半卵复合体；并采用一步融合法，通过100V/mm直流电波、脉冲时间10μs、2次脉冲进行电融合以构建得到采用手工克隆技术构建的水牛转基因克隆重构胚；

(4)、水牛转基因克隆重构胚的培养：水牛转基因重构胚经5μmol/L离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤培养3h进行化学激活处理后，置于含有混合培养液的微穴中培养6-7天，可获得发育到囊胚阶段的水牛转基因克隆胚胎，其中混合培养液是由RVCL液与SOF液以体积比1:1混合。

2.根据权利要求1所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其特征在于，步骤(1)的具体过程为：

(A)、采用组织块培养法将剪碎的水牛胎儿的耳部皮肤组织均匀地平铺于60mm的皿底，加入10％FBS的DMEM培养液1ml，轻轻移入38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱中培养5h，待组织块贴壁后，再加入3ml含10％FBS的DMEM培养液，进行原代培养，每隔2～3d换一次液；

(B)、待原代细胞长到80～90％汇合时，开始进行细胞传代：采用常规的细胞传代方法，先用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS洗两遍，加入3ml含0.25％胰蛋白酶的Hank’s液消化3～5min，待细胞变圆时，小心吸出消化液，再加入3ml含10％FBS的DMEM培养液终止消化；弃去皿内组织块，用吸管轻轻吹打使细胞悬浮，收集悬浮液于5ml离心管，采用1200rpm离心5min，重悬液以1×10⁶细胞/ml接种于含有10％FBS的DMEM培养液的新的培养皿中，放入38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱中培养；此后每隔3～4d传一代，传代比例约为1:3；

(C)、使用采用电穿孔转染法将线性质粒pCE-EGFP-IRES-neo转染到第3代的水牛胎儿成纤维细胞：将第3代的水牛胎儿成纤维细胞接种到含10％FBS的DMEM培养液中置于38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱内培养3天；转染前用含0.25％胰蛋白酶的Hank’s液消化3～5min，直到大部分细胞变圆后，加入等体积的含10％FBS的DMEM液终止消化，然后收集细胞，并加入PBS液制成10⁶/mL的细胞悬液转移至0.4cm的电击杯中，同时加入10μg线性质粒pCE-EGFP-IRES-neo混匀后，室温放置5min；使用电融合仪在150V、10ms、1次脉冲的条件下进行电击，电击后冰上放置5min，再接种至含10％FBS的DMEM培养液的培养皿中培养，待细胞生长状态恢复，加入600μg/ml G418进行抗性细胞筛选7天后再用200ng/μl G418筛选7天，每3～4d换液一次，挑取细胞数超过60个的细胞集落进行扩大培养后作为构建水牛转基因克隆胚胎的供体细胞。

3.根据权利要求1所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其特征在于，步骤(2)的具体过程为：

(a)、从屠宰场收集的水牛卵巢上抽取卵母细胞经体外成熟培养22-24h；

(b)、去除卵母细胞周围的卵丘细胞后，经0.5μg/ml秋水仙胺处理15分钟，2mg/ml链蛋白酶消化8分钟去除透明带；

(c)、去除透明带的卵母细胞放置于操作液滴中，于体视显微镜下利用手工克隆专用切割刀将卵母细胞的凸起部分及1/3的胞质切掉以去核，所述操作液滴为含有5mg/L细胞松弛素B的M199基础液；

(d)、去核的卵母细胞移入SOF培养液中，放入胚胎培养箱中恢复培养30min，作为构建水牛转基因克隆胚胎的受体卵胞质。

4.根据权利要求1所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其特征在于，步骤(3)的具体过程为：

(ⅰ)、步骤(1)中培养的转外源基因EGFP的BFF培养皿中DMEM液体吸掉，用无血清的PBS清洗2次，经0.25％胰蛋白酶的Hank’s液消化3～5min后，收集获得的细胞放置于含有0.01g/ml PVA的SOF培养液滴中沉降5～8min；步骤(2)中的一部分去核半卵放置于含0.5mg/ml植物凝集素PHA的SOF培养液微滴中处理5-10s，然后将经植物凝集素PHA处理的去核卵母细胞移至放置有供体细胞的含0.01g/ml PVA的SOF培养液滴中，使用捡卵针吹动受体去核半卵使之与单个供体细胞接触粘合，形成供体-半卵复合体；步骤(2)中的另一部分去核半卵放置于含有0.5mg/ml植物凝集素的SOF培养液滴中处理5-10s，然后移入含有供体-半卵复合体的含0.01g/ml PVA的SOF培养液滴中，用捡卵针吹动其中一个半卵将其与供体-半卵复合体粘合成串，使半卵-供体-半卵三者呈直线排列，形成半卵-供体-半卵复合体，最后将这种半卵-供体-半卵复合体移入SOF液中恢复培养以进一步进行电融合；

(ⅱ)、采用一步融合法进行电融合：粘合后的半卵-供体-半卵复合体先在1ml由0.28mol/L甘露醇、0.1mmol/L CaCl₂、0.1mmol/L MgSO₄、5mmol/L Hepes、0.1％BSA和5mg/L酚红组成的融合液中放置2min，而后将其移入显微操作仪上两电极间的100μl融合液的微滴中，用其中一根铂金丝轻轻拨动细胞调整位置，在100v/mm、10μs条件下、2次电脉冲进行融合，将电刺激后半卵-供体-半卵复合体移入SOF液中，置于胚胎培养箱中恢复培养30min，使细胞相互融合。

5.根据权利要求1所述的一种采用手工克隆技术构建水牛转基因克隆胚胎的方法，其特征在于，步骤(4)的具体过程为：

I、步骤(3)中得到的水牛手工克隆转基因重构胚经5μmol/L离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤培养3h以进行化学激活处理；

II、经化学激活处理的重构胚在含有混合培养液的微穴中置于38.5℃，5％CO₂和100％湿度的培养箱中培养6-7天，获得发育到囊胚阶段的水牛转基因克隆胚胎，其中混合培养液是由RVCL液与SOF液以体积比1:1混合。