CN104651407A

CN104651407A - 一种猪克隆胚胎的高效制备方法

Info

Publication number: CN104651407A
Application number: CN201510067003.1A
Authority: CN
Inventors: 吴珍芳; 石俊松; 罗绿花; 周荣; 纪红美; 蔡更元; 贺晓燕
Original assignee: Guangdong Wens Foodstuff Group Co Ltd
Current assignee: Guangdong Wens Foodstuff Group Co Ltd
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2015-02-06
Publication date: 2015-05-27

Abstract

本发明公开了一种猪克隆胚胎的高效制备方法，在成熟的去核猪卵母细胞中注入供体细胞，在无钙融合液中，电刺激使供体细胞融合到去核卵母细胞内，培养1-1.5h；挑出已融合的胚胎，放入钙离子浓度为0.1mmol/L的激活液内，电刺激激活胚胎，即得猪克隆胚胎。本发明先将供体细胞融合到去核猪卵母细胞中并培养1-1.5h，这样在激活前，供体细胞核充分暴露在卵子胞质里，会使染色质长时间凝聚，促进核的重编程，有利于胚胎的激活和发育，从而会显著提高克隆猪生产效率。该方法与常规的融合激活同步方法相比，融合率差异不显著，但本方法克隆胚胎移植到受体猪后，克隆猪的生产效率大大高于常规方法。

Description

一种猪克隆胚胎的高效制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种猪克隆胚胎的高效制备方法。

背景技术

猪体细胞克隆技术是一项复杂的技术，受诸多环节影响，如供体细胞、卵母细胞来源、去核方法、融合激活、胚胎移植等，其中融合激活是克隆胚胎制备和供体核重编程启动的关键因素，影响着克隆胚胎的发育和克隆猪的出生效率。只有供体细胞被激活，才能够使已高度分化的供体细胞核重新编程，克隆胚胎才能开始发育。

目前常用的方法就是一次电击使体细胞融合卵子的同时激活体细胞。具体方法为将构建好的克隆胚胎放在电极中间，然后施加2个100μs，1.4kv/cm的直流电脉冲诱导融合同时激活，转入含有化学物质的辅助激活液中，在培养箱中培养4h后体视显微镜下判定融合。

而现在对电激活的研究主要集中于参数的优化，通过改变场强、脉冲时间和次数的参数，来优化电激活的效率，或者改变融合激活液中成分等方案来提高融合激活效率，而在电激活后，利用化学辅助激活来处理克隆胚胎也研究较多，而所用药品如CB、6-DMAP和CHX等。

在现有的融合激活方案中，是施加一次电击，融合和激活同步进行，但激活时供体细胞核尚未暴露在卵子胞质内，不利于核的重编程，降低了激活的效率。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种高效的猪克隆胚胎的制备方法，该方法通过延迟融合激活而提高克隆效率。

为了实现上述发明目的，本发明采取了如下具体的技术方案：

一种猪克隆胚胎的高效制备方法，包括如下步骤：

(3)、在成熟的去核猪卵母细胞中注入供体细胞，在无钙融合液中，电刺激使供体细胞融合到去核卵母细胞内，培养1-1.5h；

(4)、挑出已融合的胚胎，放入钙离子浓度为0.1mmol/L的激活液内，电刺激激活胚胎，即得猪克隆胚胎。

在其中一些实施例中，步骤(1)中融合后于38.5℃、5％二氧化碳、饱和湿度的培养箱内培养1.5h。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述无钙融合液的配方为Manicol0.25mol/L，MgCl₂·6H₂O 0.1mmol/L，HEPES 0.5mmol/L，PVA 0.1g/L。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述激活液的配方为Manicol 0.25mol/L，CaCl₂·2H₂O 0.1mmol/L，MgCl₂·6H₂O 0.1mmol/L，HEPES 0.5mmol/L，PVA0.1g/L。

在其中一些实施例中，所述供体细胞分离自公猪耳组织成纤维细胞。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述电刺激为2个160μs，1.7kv/cm的直流电脉冲。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述电刺激为2个80μs，1.6kv/cm的直流电脉冲。

本发明提供的猪克隆胚胎的高效制备方法，是在无钙融合液内，对猪克隆胚胎施加一个直流电脉冲后，将胚胎放入培养箱培养1～1.5h后，挑选出体细胞已融合到卵子的胚胎，在钙离子浓度为0.1mmol/L的激活液内，再施加一个直流电脉冲激活胚胎。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明先将供体细胞核融合到去核猪卵母细胞中并培养1～1.5h，这样在激活前，供体细胞核充分暴露在卵子胞质里，会使染色质长时间凝聚，促进核的重编程，有利于胚胎的激活和发育，从而会显著提高克隆猪生产效率。该方法与常规的融合激活同步方法相比，融合率差异不显著，但本方法克隆胚胎移植到受体猪后，克隆猪的生产效率大大高于常规方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中一种猪克隆胚胎的高效制备方法流程图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来详细说明本发明。

以下实施例中的原料除特殊说明外，均来源于市售。

实施例1一种猪克隆胚胎的高效制备方法

如图1所示，为本实施例的通过延迟激活获得猪克隆胚胎后，再获得克隆猪的方法的流程图，包括以下步骤：

1、猪卵母细胞收集及体外成熟培养

屠宰母猪获取卵巢，放入加有各50μg/ml的青霉素和链霉素抗生素的37℃左右的生理盐水内，5h内运回实验室，然后用加有各50μg/ml的青霉素和链霉素抗生素的生理盐水冲洗3遍，用配有18G针头的10mL注射器抽取2～6mm的卵泡，在体视显微镜下用自制捡卵针捡取卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，用洗卵液洗3遍后，再用成熟培养液(基础成熟液TCM199购自Gibco公司，使用时添加10％猪卵泡液，10％胎牛血清，10μg/L EGF，10U/ml hCG,10U/mlPMSG)洗2遍，然后放入已在CO₂培养箱内平衡4h以上的成熟培养液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中成熟培养44h。将成熟培养后的COCs与0.1％透明质酸酶混合，用移液枪反复吹打除去卵丘细胞，去除卵丘细胞的卵母细胞挑选出卵周隙明显且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞进行克隆胚胎的构建。

2、猪耳组织成纤维细胞培养

将猪耳皮组织块剪碎后，用DMEM清洗组织碎片后用适量胎牛血清重悬并转移到培养皿中，37℃、5％CO₂、饱和湿度环境中培养。5-7h后添加含10％胎牛血清的DMEM培养液，观察组织块周围细胞爬出情况，待细胞长至90％汇合时传代培养。用第3-5代的接触抑制的耳皮成纤维细胞作为核供体细胞。

3、猪克隆胚胎构建

成熟的卵母细胞使用显微操作仪采用盲吸法去除极体及附近1/3的胞质，以达到去除卵母细胞核的目的，并注入一个供体细胞完成胚胎重构过程。将重构卵分批放入已经铺满融合液(Manicol 0.25mol/L，MgCl₂·6H₂O 0.1mmol/L，HEPES 0.5mmol/L，PVA 0.1g/L)的融合槽内，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，施加2个160μs，1.7kv/cm的直流电脉冲使体细胞融合到卵子里，然后将胚胎放入38.5℃、5％二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养1-1.5h。1-1.5h后将已融合的胚胎用钙离子浓度为0.1mmol/L激活液(Manicol0.25mol/L，CaCl₂·2H₂O 0.1mmol/L，MgCl₂·6H₂O 0.1mmol/L，HEPES0.5mmol/L，PVA 0.1g/L)洗3遍后，放入钙离子浓度为0.1mmol/L激活液(Manicol 0.25mol/L，CaCl₂·2H₂O 0.1mmol/L，MgCl₂·6H₂O 0.1mmol/L，HEPES0.5mmol/L，PVA 0.1g/L)的融合槽内，施加2个80μs，1.6kv/cm的直流电脉冲激活胚胎，得到猪克隆胚胎。

4、猪克隆胚胎移植到受体猪

将猪克隆胚胎用PZM3培养液(自配：NaCl 107.89mmol/L、NaHCO₃25.07mmol/L、KCl 10mmol/L、KH₂PO₄0.37mmol/L、MgSO₄·7H₂O 0.40mmol/L、sodium pyrubate 0.20mmol/L、Ca-lactate·7H₂O 2mmol/L、L-glutamine 1mmol/L、Hypotaurine 5mmol/L、Penicillin G 0.17mmol/L、streptomycin 0.03mmol/L、BSA3g/L、EAA2％、NEAA 1％、Phenol Red 0.1％)洗涤3遍，立即转入矿物油覆盖的含有CB的辅助激活液(添加5mg/LCB的PZM3)中，在38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱内培养4h后使用手术法移植到受体猪内(每头受体猪移植200-250枚克隆胚胎)。

5、受体猪妊娠检测及克隆仔猪出生跟踪

胚胎移植30天进行超声波妊娠检测，确定受孕的母猪跟踪其受孕情况，114天后克隆仔猪出生，跟踪分娩窝数及仔猪个体数。

对比例1

按实施例1步骤1和步骤2的方法获得成熟的去核卵母细胞和供体细胞，再使用常规融合激活同步方法构建猪克隆胚胎，按实施例1步骤4的方法将猪克隆胚胎移植到受体猪，作为对照，胚胎移植30天进行超声波妊娠检测，确定受孕的母猪跟踪其受孕情况，114天后克隆仔猪出生，跟踪分娩窝数及仔猪个体数。实施例1和对比例1的克隆猪的方法对克隆效率的影响结果如表1所示。

表1 实施例1和对比例1的克隆方法对猪克隆效率的影响

注：同一列标注不同字母表示差异显著，P＜0.05，克隆效率是总仔数/移植总胚胎数％

通过表1的数据统计发现，相对于常规激活方法(即对比例1的方法)，延迟激活方法(即实施例1的方法)可以提高克隆猪的妊娠率、分娩率、每头受体所得的克隆猪总仔数以及克隆效率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、在成熟的去核猪卵母细胞中注入供体细胞，在无钙融合液中，电刺激使供体细胞融合到去核卵母细胞内，培养1-1.5h；

(2)、挑出已融合的胚胎，放入钙离子浓度为0.1mmol/L的激活液内，电刺激激活胚胎，即得猪克隆胚胎。

2.根据权利要求1所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)中融合后于38.5℃、5％二氧化碳、饱和湿度的培养箱内培养1.5h。

3.根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，所述供体细胞分离自公猪耳组织成纤维细胞。

4.根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)所述电刺激为2个60μs，1.7kv/cm的直流电脉冲。

5.根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤(2)所述电刺激为2个80μs，1.6kv/cm的直流电脉冲。

6.根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述无钙融合液的配方为Manicol 0.25mol/L，MgCl₂·6H₂O0.1mmol/L，HEPES 0.5mmol/L，PVA 0.1g/L。

7.根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述激活液的配方为Manicol 0.25mol/L，CaCl₂·2H₂O 0.1mmol/L，MgCl₂·6H₂O 0.1mmol/L，HEPES 0.5mmol/L，PVA 0.1g/L。