CN101843530A - 幼畜卵母细胞体外两次受精方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的幼畜卵母细胞体外两次受精方法，受体均为45-100日龄母幼畜，经FSH超数排卵处理，取卵母细胞100枚/只以上待用；将体外成熟25-26小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；5-6小时进行二次体外受精，过13-14小时，移于培养板培养，48小时后统计卵裂率即可。成熟的卵母细胞需用0.1％的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸脱去部分卵丘细胞，加入2-5小时平衡好的50-70μl/滴的受精液内孵育；水浴解冻精液，放入CO2箱，20-25分钟，取上清液离心2-5分钟，沉淀的精子按2-4×106个/ml的密度加入受精液孵育；将受精5-6小时的卵取出，放入受精液中；用同前的方法解冻精子，加入受精液，经13-14小时，洗涤，移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养。该方法简单易行，能使牛、羊的幼畜受精率达到80-92％，囊胚率达到40-50％。
Description
技术领域
本发明涉及幼畜体外受精，尤其是用于卵母细胞的体外受精方法，采用有效的两次受精，可提高受精率及胚胎发育率。
背景技术
体外受精拟指在体外环境下完成精卵结合的过程。JIVET(juvenile invitro embryo transfer)即幼畜早期辅助繁殖技术，是集诱导幼畜卵泡发育技术，体外受精，胚胎移植等技术为一体的胚胎生物技术体系；其主要技术环节包括幼畜超排，卵母细胞采集，体外成熟培养，体外受精，早期胚胎体外发育，胚胎移植等，体外受精是其关键步骤之一。传统的成年动物卵母细胞体外受精技术是将体外成熟26小时的卵母细胞进行一次受精，即可获得理想的结果。文献检索由广东省农业科学院兽医研究所王祖昆等4人完成的《影响猪卵母细胞体外成熟受精和发育因素的研究》研究成果，首次提出了两次体外受精法的新理论和新方法，主要是针对猪卵子体外受精中成熟不同步，一次受精难以满足大多数卵子适时受精的需要，采用两次体外受精法，可以满足大部分卵子的受精需求；结果是卵裂率显著高于一次或三次受精法的卵裂率，显著提高卵子的体外受精率。由此表明，国内有关猪卵细胞体外两次受精的研究已见文献报道，但有关幼畜卵细胞体外两次受精的报道较少。本发明以此为切入点，展开的实验研究方法具有科学性与实践性。
发明内容
本发明的目的在于：提供用于幼畜卵母细胞体外两次受精方法，目的是提高受精率及胚胎发育率。
本发明的目的是这样实现的：幼畜卵母细胞体外两次受精方法，受体均为45-100日龄母幼畜，经FSH-PMSG超数排卵处理后，手术抽取卵母细胞100枚/只以上待用；将体外成熟25-26小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；5-6小时进行二次体外受精，再经13-14小时，入培养板；最佳效果是：将体外成熟25小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；5小时进行二次体外受精，再经13小时；入培养板内培养，48小时后统计卵裂率即可；
其中，将卵母细胞用成熟液洗涤3-4遍，按25-30枚/滴的密度加入经3-5小时平衡，体积为75-100μl/滴的成熟液中，入CO2箱，在5％CO2、95％的空气条件下培养；
其中，将成熟卵母细胞，用0.1％的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸，脱去部分卵丘细胞，用受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/滴的密度加入经2-5小时平衡，体积为50-70μl/滴的受精液中；水浴解冻精液，移入经2-3小时平衡，含受精液的试管中，放入CO2箱，上游20-25分钟后，取上清液以1500转/分钟的转速离心2-5分钟，将沉淀的精子按2-4×106个/ml的密度加入受精液，与卵母细胞共同孵育；
其中，将受精5-6小时的卵取出，采用平衡好的受精液洗涤2-3遍，放入备用的受精液中；用同前的方法解冻精子，再按2-4×106个/ml的密度加入受精液，过13-14小时，将受精卵移至平衡好的培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4遍，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养。
所述的体外两次受精方法，使用药剂的配制：
抽卵液：TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素钠；
成熟液：TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml雌二醇+24.2mg/L丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；
SOF：由6.29mg/ml NaCL+0.534mg/mlKCL+0.162mg/mlKH2PO4+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/ml MgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O组成
受精液：SOF+20％发情羊血清+6IU/ml肝素钠+2.5IU/ml庆大霉素；
培养液：SOF+3mg/mlBSA。
所述的体外两次受精方法，取卵巢表面的卵泡时，选用18-20G针头，在吸入抽卵液2-3ml时，即可抽取。
所述的体外两次受精方法，采用两次体外受精，受精率达80-92％，囊胚率达到40-50％。
所述的体外两次受精方法，选用的幼畜，绵羊、山羊、杂交羊为40-70日龄；黄牛、水牛、奶牛为80-100日龄。
所述的体外两次受精方法，选用的实验材料除羊血清自制外，其他均为市售产品。
本发明的构思及研究机理：
传统的体外受精技术是一次即可，但由于幼畜早期辅助繁殖技术(JIVET)中所获得的卵母细胞来源于尚未成熟的幼畜卵巢，经过体外成熟培养后发育同步性差，体外成熟25小时后只有近一半的卵母细胞达到细胞核成熟，体外成熟30小时后，虽然成熟的比例上升，但早期成熟的卵母细胞退化的比例也在上升；若此时受精，受精率低；若后期受精，受精率虽高，但退化率高，后期发育率(囊胚率)低；采用间隔5-6小时两次受精，受精率、囊胚率都会大幅度的提高。其研究机理是早成熟的卵母细胞在第一次与精子混合的时候就可以完成受精，受精后通过透明带反应，阻止多精子入卵，所以在第二次与精子混合后已经受精的卵不会再参与受精；未成熟的卵母细胞仍在继续成熟，体外成熟培养30小时后，未受精的卵母细胞基本成熟，在第二次与精子混合13小时后即可完成受精。
本发明统计30小时后卵裂率；统计7天后囊胚率；结果见表。
表
本发明构思的技术效果：
取卵选择45-100日龄幼畜为宜，日龄大，超排效果不好。
抽吸突出卵巢表面的卵泡，选用18-20G针头，针头大回收率低，针头小颗粒细胞易脱落可用率降低。
将显微镜下回收的卵母细胞，经成熟液洗涤，加入培养液，入CO2箱在5％CO2、95％的空气条件下培养，能促进细胞生长。
精液采用1500转/分钟的转速离心2-5分钟，可避免转速大、时间长，影响精子活力；转速小，时间短，离出的精子少的弊端。
精子按2-4×106个/ml的密度加入受精液，可避免密度低，影响受精率；密度太大，增加多精受精率，后期发育率低的弊端。
受精的卵母细胞需采用0.1％的透明质酸酶处理30-60s，可避免时间长，影响后期发育，时间短，脱颗粒细胞效果不好的弊端。
受精卵移至平衡好的培养液内时，需脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，避免影响后期发育。
本发明以提高幼畜的受精率及胚胎发育率为突破口，通过精心设计与方法实践，采用间隔5-6小时体外两次受精方法，受精率可达到80-92％，囊胚率达到40-50％，效果极佳，尤其适宜羊、牛的母幼畜，为畜牧业的种群发展提供了科学依据，彰显技术进步。
具体实施方式
下面将结合实施例就发明作进一步的说明。幼畜卵母细胞体外两次受精方法的实施方案如下。
实施例
受精步骤：选择50日龄羔羊或90日龄牛犊，在第1-3天共实施6次FSH间隔12小时肌肉注射超数排卵，第4天，手术方法抽取卵母细胞的卵子100枚/只以上，在体外成熟26小时后与精子混合，完成一次体外受精；6小时后进行二次体外受精，14小时后，移入培养板中培养，48小时后统计卵裂率即可。
最佳效果是：将体外成熟25小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；5小时进行二次体外受精，再经13小时；移入培养板中培养，48小时后统计卵裂率即可。
药剂的配制：
抽卵液：TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素钠；
成熟液：TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml雌二醇+24.2mg/L丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；
SOF：由6.29mg/ml NaCL+0.534mg/mlKCL+0.162mg/mlKH2PO4+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/ml MgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O组成
受精液：SOF+20％发情羊血清+6IU/ml肝素钠+2.5IU/ml庆大霉素；
培养液：SOF+3mg/mlBSA。
方法操作：
卵母细胞的处置：
采用18G针头，10ml注射器，吸入抽卵液3ml后抽取卵母细胞120枚/只，将其注入60mm大皿，在显微镜下回收卵母细胞，用成熟液洗涤3遍，按25枚/滴的密度加入3小时前平衡好的体积为80μl/滴的培养液中，入CO2箱，在5％CO2、95％空气条件培养成熟。
体外受精操作：
第一次：将体外成熟25小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理30s，用口吸管轻轻吹吸，以脱去部分卵丘细胞，用受精液洗涤3遍，按30枚/滴放入3小时前预先平衡好的50μl的受精液内；同时，将在39℃水浴下解冻精液，移入3小时前平衡好的受精液中，放入CO2箱，上游20分钟，取上清液，以1500转/分钟的转速离心4分钟，以精子沉淀密度计算，按3×106个/ml的密度加入受精液，与处理好的卵母细胞共同孵育。
第二次：受精卵5小时后取出，用平衡好的受精液洗涤3遍，放入受精液中；用前的方法解冻精子，按2×106个/ml的密度加入受精液中，经13小时后，将受精卵移至平衡好的培养液内，用口吸管反复吹吸，以脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，培养液洗涤3遍，按50枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养，48小时后统计卵裂率。
Claims (6)
1.幼畜卵母细胞体外两次受精方法，其特征在于：受体均为45-100日龄母幼畜，经FSH-PMSG超数排卵处理后，手术抽取卵母细胞100枚/只以上待用；将体外成熟25-26小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；5-6小时进行二次体外受精，再经13-14小时，入培养板；最佳效果是：将体外成熟25小时的卵母细胞与精子混合，完成一次体外受精；5小时进行二次体外受精，再经13小时，入培养板内培养，48小时后统计卵裂率即可；
其中，将卵母细胞用成熟液洗涤3-4遍，按25-30枚/滴的密度加入经3-5小时平衡，体积为75-100μl/滴的成熟液中，入CO2箱，在5％CO2、95％的空气条件下培养；
其中，将成熟卵母细胞，用0.1％的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸，脱去部分卵丘细胞，用受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/滴的密度加入经2-5小时平衡，体积为50-70μl/滴的受精液中；水浴解冻精液，移入经2-3小时平衡，含受精液的试管中，放入CO2箱，上游20-25分钟后，取上清液以1500转/分钟的转速离心2-5分钟，将沉淀的精子按2-4×106个/ml的密度加入受精液，与卵母细胞共同孵育；
其中，将受精5-6小时的卵取出，采用平衡好的受精液洗涤2-3遍，放入备用的受精液中；用同前的方法解冻精子，再按2-4×106个/ml的密度加入受精液，过13-14小时，将受精卵移至平衡好的培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4遍，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养。
2.根据权利要求1所述的体外两次受精方法，其特征在于：使用药剂的配制：
抽卵液：TCM199-hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素钠；
成熟液：TCM199-HCO3+10％FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml雌二醇+24.2mg/L丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗；
SOF：由6.29mg/ml NaCL+0.534mg/mlKCL+0.162mg/mlKH2PO4+0.6μl/ml乳酸钠+0.089mg/ml MgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O组成
受精液：SOF+20％发情羊血清+6IU/ml肝素钠+2.5IU/ml庆大霉素；
培养液：SOF+3mg/ml BSA。
3.根据权利要求1所述的体外两次受精方法，其特征在于：取卵巢表面的卵泡时，选用18-20G针头，在吸入抽卵液2-3ml时，即可抽取。
4.根据权利要求1所述的体外两次受精方法，其特征在于：采用两次体外受精，受精率达80-92％，囊胚率达到40-50％。
5.根据权利要求1所述的体外两次受精方法，其特征在于：选用的幼畜，绵羊、山羊、杂交羊为40-70日龄；黄牛、水牛、奶牛为80-100日龄。
6.根据权利要求1所述的体外两次受精方法，其特征在于：选用的实验材料除羊血清自制外，其他均为市售产品。
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