CN103445882A - 提高牛冷冻精液精子运动性和体外受精率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法。该方法的特征在于：在牛冷冻精液的前期处理阶段中用SP-TALP洗涤液洗涤时，或在受精前精液的获能处理阶段中使用PHE获能液进行获能处理时，或在体外受精阶段中制备受精滴时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因；其中每支牛冷冻精液的受精过程中，在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中或在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE获能液的混合液中或在含有卵母细胞的受精滴与牛精液混合液中的终浓度均为5mmol/L。本发明将两种物质联合分别应用到牛冷冻精液受精过程中的三个阶段中，大大提高精子的运动性，提高精子的受精率。
Description
技术领域
本发明属于家畜胚胎工程技术领域，具体涉及一种能通过添加生物活性物质提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法。
背景技术
目前牛的冷冻精液已经进入商业化生产，而且被广泛应用于人工受精技术。但是，精液生产和使用中的冷冻解冻过程破坏了精子的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)在正常生理条件下的动态平衡状态，导致精子ROS增加，引起精子膜的过氧化和DNA损伤，从而影响精子活力、质膜完整性及受精潜力等，降低了精液品质。
谷胱甘肽(GSH)是哺乳动物细胞中重要的非蛋白硫氢化合物，它作为过氧化—还原酶系统的作用物之一，能及时保护精子免遭氧化及过氧化反应终结产物的伤害，使精子脂膜结构保持稳定。人类和其它哺乳动物包括牛、猪的精子经过冷冻和解冻处理后，细胞中GSH的含量显著下降，精子的运动性和生存能力也因此而显著降低。Gadea等（2011）报道指出，在人类精液冷冻液中添加1mmol/L谷胱甘肽，能提高总体精子活率，同时能改变精子直线运动速度、平均路径速度和运动的摆动性。在解冻液中添加1mmol/L或者5mmol/L的谷胱甘肽，能提高总体精子活率和直线运动的精子活率。张文举等（1997）在牛稀释精液中添加3mmol/L的谷胱甘肽，明显提高了公牛的冻精活力，顶体完整率，并且使母牛情期受胎率提高了6.4％；Saweta等（1995）向牛冷冻稀释液中添加5mmol/L的谷胱甘肽，冷冻3.0h后解冻，发现精子活力比未添加谷胱甘肽的精子活力提高了6.4％，精子的顶体完整率提高了3-8％，受胎率提高了6.3％；刘璐等(2010)在常规冷冻稀释液中添加5mmol/L谷胱甘肽解冻后，精子活力、顶体完整率均优于对照组，畸形率低于对照组；但是浓度高于5mmol/L时，精液活力有所下降。
咖啡因作为环状核苷酸酯酶的一种抑制剂，主要通过抑制环腺苷酸酶来使细胞内积累充分的cAMP，使精子内与精子运动、获能、顶体反应相关的环状磷酸腺苷(cAMP)含量增高。能在ATP酶活性低的情况下维持精子活力，从而增强精子活动能力。大量的研究表明，添加不同浓度的咖啡因对精子活动能力的影响不同。牛原精液在含6mmol/L咖啡因的基质中，37℃培养4h，精子活率为55.2%，显著高于对照组（27.2%）（Garbers et al.,1971）。咖啡因的浓度为60mmol/L时，人精子的总活率、运动速度、直线运动的精子活率和运行速度都被抑制，浓度达到120mmol/L时，精子完全停止运动（Moμssa，1983）。同时Garbers等（1971）的研究还发现，咖啡因对不同公牛个体精子的作用不同，咖啡因可以迅速激活低活率个体的精子，但是对于高活率个体精子的刺激作用不明显。文国艺(2000）报道指出，咖啡因在提高精子活率促进精子获能的同时，对卵母细胞和早期胚胎有毒害作用并最终影响胚胎质量，并且毒性作用随浓度的增加和时间的延长而增强。因此，咖啡因的添加浓度以及与其它物质是否可以协同使用减少其毒害作用有待于我们的进一步研究。
在精液的稀释和冷冻过程中单独添加谷胱甘肽和咖啡因这两种精子活性物质能改善精子运动能力的报道较多，由于这两种物质对精子的作用机制不同，两者是否存在协同作用以及合适浓度的组合都尚未见报道。但是在精子代谢的过程中，谷胱甘肽和咖啡因有共同作用的位点（Ferrero JL,NeimsAH.1983;Hong et al.,1984），这为两种物质的联合应用提供了可能。尽管通过分析精子的运动能力可以预测精子的受精能力，但是要全面评价谷胱甘肽和咖啡因这两种活性物质对体外受精后胚胎的发育情况的影响，仍然需要体外受精试验的进一步验证。
以下是申请人检索的相关资料：
1、Gadea J,Molla M,Selles E,Marco MA,Garcia-Vazqμez FA,Gardon JC.Redμced glμtathionecontent in hμman sperm is decreased after cryopreservation:Effect of the addition of redμcedglμtathione to the freezing and thawing extenders.Cryobiology.2011;62:40-6。
2、张文举，杨军祥，黄全成，等.谷胱甘肽提高牛冻精活力及受胎率的研究．甘肃畜牧兽医，1997(2)：13。
3、刘璐，张劭俣，张彧，等.犬常规冷冻稀释液中添加谷胱甘肽的研究.北京农业.2010,12:1-9
4、Garbers DL,First NL,Sμllivan JJ,Lardy HA.Stimμlation and maintenance of ejacμlatedbovine spermatozoan respiration and motility by caffeine.Biology of reprodμction.1971;5:336-9。
5、Moμssa MM.Caffeine and sperm motility.Fertility and sterility.1983;39:845-8。
6、文国艺.咖啡因预处理解冻精液对牛体外受精的影响.西南农业学报.2000,13(2):95-98。
7、Ferrero JL,Neims AH.Metabolism of caffeine by moμse liver microsomes:GSH or cytosolcaμses a shift in prodμcts from1,3,7-trimethylμrate to a sμbstitμted diaminoμracil.Life sciences.1983;33:1173-8。
8、Hong CY,Chiang BN,KμJ,Wei YH.Glμtathione and caffeine antagonize thesperm-immobilizing effect of a vaginal contraceptive.Hμman toxicology.1984;3:271-7。
发明内容
本发明是为了解决因牛冷冻精液解冻后精子活性氧增加，而导致的精液品质降低以及体外受精后胚胎早期发育率低的问题，提供了一种通过添加生物活性物质，可以提高冷冻精子运动能力、及时清除体外受精环境中过量的自由基，从而提高牛早期胚胎发育率的方法。
本发明提供的技术方案：所述一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，依次包括牛冷冻精液的前期处理、受精前精液的获能处理和与加入卵母细胞的受精滴进行体外受精三个阶段，其特征在于：在牛冷冻精液的前期处理阶段中用SP-TALP洗涤液对牛精液处理时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在受精前精液的获能处理阶段中使用PHE获能液对牛精液进行获能处理时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在体外受精阶段中制备含有卵母细胞的受精滴时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，在每个阶段加入谷胱甘肽和咖啡因时，其它阶段都与现有受精方法相同；其中每支牛冷冻精液的受精过程中，每支牛冷冻精液都是固定的体积为250μl，在牛冷冻精液的前期处理阶段加入的谷胱甘肽和咖啡因时，两者在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中浓度均为5mmol/L，在受精前精液的获能处理阶段加入的谷胱甘肽和咖啡因时，两者在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE获能液的混合液中浓度均为5mmol/L，在体外受精阶段加入的谷胱甘肽和咖啡因时，两者在含有卵母细胞的受精滴与牛精液混合液中的终浓度均为5mmol/L。其中所述谷胱甘肽和咖啡因均有商业化的产品出售，本发明中所用的谷胱甘肽由Sigma公司提供的，咖啡因由Amresco公司提供。
本发明提供的一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于在牛冷冻精液的前期处理阶段加入谷胱甘肽和咖啡因时，其体外受精的具体步骤如下：（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后收集至离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入SP-TALP洗涤液中混合均匀，并向牛精液和SP-TALP洗涤液的混合液中添加纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，致使谷胱甘肽和咖啡因在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中的浓度均为5mmol/L，然后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min，，离心时间5-8min；
（2）将步骤（1）中温育处理后的混合液放入离心管中第二次离心并弃上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液，调整精子的浓度为3×106个/mL～4×106个/mL，之后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中储存备用；其中第二次离心的离心速度为1500-1700r/min，离心时间为5-10min，二次离心弃上清后留取的牛精液沉淀混合物为100-120μL；
（3）将步骤（2）中准备的含有精子的IVF-TALP受精液与PHE获能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的混合获能液，并放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（4）取40-50μL的IVF-TALP受精液，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞制备成60μL含有牛卵母细胞的受精滴，并放入温度为38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱备用；
（5）将步骤（4）中制备的含有牛卵母细胞的受精滴与步骤（3）中获能处理后的含有牛精液的混合获能液按照体积比1:1的比例混合后放入38.5℃，5%的CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中培养18-20h；
本发明提供的一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于在受精前精液的获能处理阶段加入谷胱甘肽和咖啡因时，其体外受精的具体步骤如下：（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后收集至离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入SP-TALP洗涤液中混合均匀后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min2000r/min，离心时间5-8min；
（2）将步骤（1）中温育处理后的混合液放入离心管中第二次离心并弃上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液调整精子的浓度为3×106个/mL～4×106个/mL，之后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中储存备用；其中第二次离心的离心速度为1500-1700r/min，离心时间为5-10min，二次离心弃上清后留取的牛精液沉淀混合物为100-120μL；
（3）将步骤（2）中准备的含有精子的IVF-TALP受精液与PHE获能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合获能液，向混合获能液内添加纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，致使谷胱甘肽和咖啡因在含有牛精液的获能混合液中的终浓度为5mmol/L，之后将其放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（4）取40-50μL的IVF-TALP受精液，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞制备成60μL含有牛卵母细胞的受精滴，放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（5）将步骤（4）中制备的含有牛卵母细胞的受精滴与步骤（3）中获能处理后的含有牛精液的混合获能液等体积混合后放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中培养18-20h。
本发明提供的一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于在体外受精阶段加入谷胱甘肽和咖啡因时，其体外受精的具体步骤如下：（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后放入离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入SP-TALP洗涤液中混合均匀后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min，离心时间5-8min；
（2）将步骤（1）中温育处理后的混合液放入离心管中第二次离心并弃上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液调整精子的浓度为3×106个/mL～4×106个/mL，之后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中储存备用；其中第二次离心的离心速度为1500-1700r/min，离心时间为5-10min，二次离心弃上清后留取的牛精液沉淀混合物为100-120μL；
（3）将步骤（2）中准备的含有精子的IVF-TALP受精液与PHE获能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的获能混合液，放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（4）取40-45μL的IVF-TALP受精液制备成受精滴，放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中预孵2小时，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞，然后添加10mmol/L的纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，制备成体积为60μL的含有卵母细胞的受精滴，并放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（5）将步骤（4）中制备的受精滴与步骤（3）中获能处理后的含有牛精液的获能混合液等体积混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的终浓度为5mmol/L，然后放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中培养18-20h。
本发明进一步的技术方案：在牛冷冻精液的前期处理阶段中用SP-TALP洗涤液对牛精液处理过程中加入谷胱甘肽和咖啡因时，是将含有牛精液的SP-TALP洗涤液、浓度为100mmol/L的谷胱甘肽浓储液和浓度为100mmol/L咖啡因浓储液按照体积比18：1：1的比例混合均匀，使含有牛精液的SP-TALP洗涤液中谷胱甘肽和咖啡因终浓度均为5mmol/L。
本发明进一步的技术方案：在受精前精液的获能处理阶段向含有精子的IVF-TALP受精液与PHE获能液混合液中加入谷胱甘肽和咖啡因时，是将含有精子的IVF-TALP受精液、PHE获能液、浓度为100mmol/L的谷胱甘肽浓储液和浓度为100mmol/L的咖啡因浓储液按照体积比14：13：1.5：1.5混合均匀，使混合后的获能液中谷胱甘肽和咖啡因终浓度均为5mmol/L。
本发明较优的技术方案：在体外受精阶段向受精滴中加入谷胱甘肽和咖啡因时，是先将40-45μL的IVF-TALP受精液制备成受精滴，将其放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中预孵2小时，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞后使得总体积为48μL，按照体积比8：1：1加入浓度为100mmol/L的谷胱甘肽浓储液和浓度为100mmol/L，使得60μL的受精滴中含有10mmol/L谷胱甘肽和咖啡因，之后将含有精子的IVF-TALP受精液和PHE获能液以17:13的比例混合后再与受精滴等体积混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的最终浓度均为5mmol/L。
本发明较优的技术方案：所述的SP-TALP洗涤液的配制方法如下：在每100ml的纯水中加入0.579g氯化钠，0.0230g氯化钾，0.2104g碳酸氢钠，0.0047g磷酸二氢钠，0.3612g乳酸钠，0.2975gHEPES[中文全称：4-羟乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸]，0.0294g氯化钙，0.0224g氯化镁，并混合均匀后调PH值至7.4，然后通过孔径为0.22μm的过滤器进行过滤后，再向过滤液中添加0.6316g V级的血清白蛋白、5.263mL浓度为2.2mg/mL的丙酮酸和210.53μL浓度为5mg/mL的庆大霉素进行混合，再将混合液通过孔径为0.22μm的过滤器进行过滤后形成SP-TALP洗涤液。
本发明较优的技术方案：所述的IVF-TALP受精液的配制方法如下：在每100ml的纯水中加入0.6665g氯化钠，0.0235g氯化钾，0.2104g碳酸氢钠，0.0047g磷酸二氢钠，0.1116g乳酸钠，0.0294g氯化钙，0.0102g氯化镁，并混合均匀后调PH值至7.4，然后通过孔径为0.22μm的过滤器进行过滤后，再向过滤液中添加0.6g血清白蛋白、1mL浓度为2.2mg/mL的丙酮酸、100μL浓度为5mg/mL的庆大霉素和500μL肝素并混合均匀，最后将混合液通过孔径为0.22μm的过滤器进行过滤制成IVF-TALP受精液。
本发明较优的技术方案：所述PHE获能液是由亚牛磺酸溶液、青霉素钠溶液和肾上腺素溶液按照体积比5：5：2混合均匀后，再用孔径为0.22μm的过滤器过滤，分装，在-20℃的环境下永久保存；其中，所述亚牛磺酸溶液是在每10ml生理盐水中溶解1.09mg亚牛磺酸制成；青霉素钠溶液是在每10ml生理盐水中溶解3mg青霉素钠制成；肾上腺素溶液是在每10ml生理盐水中溶解1.83mg肾上腺素制成。
本发明将5mmol/L谷胱甘肽和5mmol/L咖啡因联合应用，谷胱甘肽竞争性抑制了咖啡因与精子膜的结合，使得谷胱甘肽与咖啡因的配伍浓度较优，在体外处理精子和体外受精的过程中发挥协同作用。两者的联合应用，提高精子质量的同时也保证了精子获能，能有效提高牛精子体外受精后8-16细胞胚胎发育率和卵裂率，为谷胱甘肽与咖啡因在体外受精和体外胚胎生产中的应用提供了依据。
本发明将两种物种联合分别应用到牛冷冻精液受精过程中的三个阶段中，分别加到三个阶段中均可以大大提高精子的运动性，精子的运动性是影响受精率的关键，提高了精子的运动性，便可以提高精子的受精率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。对于本发明提供的技术方案分别提出给出三个实施例，每个实施例均以一支牛冷冻精液（采用常规的牛冷冻精液HBQ13201001，每支牛冷冻精液的体积为250μL），在进行具体实施例之前，先配制好以下物质备用：
配制浓度为100mmol/L谷胱甘肽和咖啡因浓储液：分别取92.4mg谷胱甘肽（GSH，由Sigma提供的）和58.3mg咖啡因(Caffeine，由Amresco公司提供的)，两者的纯度均大于98%，然后各自溶于3mL超纯水中，配成100mM的溶液，分别分装到1.5mL的EP管中，冷冻保存。
配制SP-TALP洗涤液：称取氯化钠0.579g，氯化钾0.0230g，碳酸氢钠0.2104g，磷酸二氢钠0.0047g，乳酸钠0.3612g，HEPES0.2975g，氯化钙0.0294g，氯化镁0.0224g，超纯水100mL，调PH值至7.4，并0.22μm过滤，过滤后向滤液中添加血清白蛋白(V级)0.6316g，丙酮酸5.263mL（浓度为2.2mg/mL)，庆大霉素210.53μL(浓度5mg/mL)，混合后再0.22μm过滤，然后放在4℃的环境下保存。
配制IVF-TALP受精液：称取氯化钠0.6665g，氯化钾0.0235g，碳酸氢钠0.2104g，磷酸二氢钠0.0047g，乳酸钠0.1116g，氯化钙0.0294g，氯化镁0.0102g，超纯水100mL，调PH值至7.4，使用孔径为0.22μm的过滤器进行过滤后，向过滤液中添加血清白蛋白（EFAF)0.6g，丙酮酸1mL（浓度为2.2mg/mL)，庆大霉素100μL(浓度为5mg/mL)，肝素500μL，配制成常规IVF-TALP受精液，过滤，4℃保存。
卵母细胞的准备的具体步骤：（1）从武汉市武昌区红旗村国强畜禽屠宰场采集母牛卵巢，母牛宰杀后割下卵巢放入37℃含有1%双抗的运输盐（称取9g NaCl溶于1L双蒸水中，10ml100×双抗制备而成，然后在4℃环境下永久保存）中，在1-3h内运回实验室，再用37℃运输盐清洗若干次，放入500ml烧杯中封口，37℃水浴保存；
（2）抽卵和检卵，抽卵时先用灭菌纱布吸干卵巢表面的水珠，再用带有18G针头的10ml注射器吸取约1ml提前温浴的检卵液，然后抽取直径为3-8mm的卵泡，尽量避免多次穿针，抽取完后，将注射器缓慢注入提前温浴的10ml离心管，静止5min后，用巴氏管吸取离心管底部的沉淀物，然后注入60mm的大皿中，再加入适量的检卵液稀释，摇匀，最后，在40×体视镜下优先挑选有多层卵丘细胞包围的卵母细胞复合体（COCs），裸卵和深黑色卵母细胞复合体弃去；检卵液（OCM）的配制：溶解TCM199粉末10L，称取3.5g NaHCO3到9L双蒸水中，加入100ml100×双抗，pH=7.2～7.4，定容至10L，0.22μm过滤，4℃永久保存。
（3）体外成熟培养，将上述卵母细胞复合体，用卵母细胞成熟液洗涤4-5次，然后移入提前在CO2培养箱平衡不少于2h的成熟微滴中，每100μL滴放入20-30枚，38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中成熟培养22h，成熟培养后观察，在正常情况下，卵母细胞周围的卵丘细胞贴壁扩展，周围可见成片的贴壁生长的单层颗粒体细胞。卵母细胞成熟液（OMM）的配制：量取88ml TCM199到100ml烧杯中，分别加入22mg丙酮酸钠，10ml FBS，1ml双抗，0.1mg17β-E2和适量的EGF，FSH，0.22μm过滤，4℃保存。
（4）成熟卵母细胞准备，先将卵母细胞复合体移入提前温浴的HEPES-TALP洗卵液中，用检卵针反复吹打直至卵母细胞周围仅有3-4层颗粒体细胞，在进行体外受精过程时再移入在CO2培养箱平衡不少于2h的受精滴中，每60μL滴中放入5-6个卵母细胞，并移入CO2培养箱中备用。
实施例一：所述一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，依次包括以下步骤：（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后收集至离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入之前配制好的SP-TALP洗涤液中混合均匀，然后将含有牛精液的SP-TALP洗涤液、浓度为100mmol/L的谷胱甘肽浓储液和浓度为100mmol/L咖啡因浓储液按照体积比18：1：1的比例混合均匀，使含有牛精液的SP-TALP洗涤液中谷胱甘肽和咖啡因终浓度均为5mmol/L，然后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min，，离心时间5-8min；
（2）将步骤（1）中温育处理后的混合液放入离心管中第二次离心并弃上清液，然后向二次离心后的留取的牛精液沉淀混合物中加入提前配制好的IVF-TALP受精液，调整精子的浓度为3×106个/mL～4×106个/mL，之后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中储存备用；其中第二次离心的离心速度为1500-1700r/min，离心时间为5-10min，二次离心弃上清后留取的牛精液沉淀混合物为100-120μL；
（3）将步骤（2）中准备的含有精子的IVF-TALP受精液与提前配制好的PHE获能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的混合获能液，放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（4）取50μL提前配制好的IVF-TALP受精液，制备成受精滴，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞使受精滴的体积为60μL，放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱备用；
（5）将步骤（4）中制备的受精滴与步骤（3）中获能处理后的含有牛精液的混合获能液按照体积比1:1的比例混合后放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中培养18-20h，并观察记录其精子的运动性和受精率。
实施例二：所述一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，依次包括以下步骤：（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后放入离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入提前准备好的SP-TALP洗涤液中混合均匀后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min，离心时间5-8min；
（2）同实施例一；
（3）将步骤（2）中准备是将含有精子的IVF-TALP受精液、PHE获能液、浓度为100mmol/L的谷胱甘肽浓储液和浓度为100mmol/L的咖啡因浓储液按照体积比14：13：1.5：1.5混合均匀，使混合后的获能液中谷胱甘肽和咖啡因终浓度均为5mmol/L，放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（4）、（5）均同实施例一；
实施例三：所述一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，依次包括以下步骤：（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后放入离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入提前准备好的SP-TALP洗涤液中混合均匀后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min，离心时间5-8min；
步骤（2）、步骤（3）均同实施例一；
（4）取40-45μL的IVF-TALP受精液制备成受精滴，将其放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中预孵2小时，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞后使得总体积为48μL，按照体积比8：1：1加入浓度为100mmol/L的谷胱甘肽浓储液和浓度为100mmol/L，使得60μL的受精滴中含有10mmol/L谷胱甘肽和咖啡因，放入38.5℃，5%的CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（5）将步骤（4）中制备的受精滴与步骤（3）中获能处理后的含有牛精液的获能混合液等体积混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的终浓度为5mmol/L，然后放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中培养18-20h，并观察记录其精子的运动性和受精率。
观测得到以上三个实施例中精子直线运动、精子活率、曲线运动速度、侧摆幅度和鞭打频率均有不同程度的高，体外受精的结果显示8-16细胞胚胎发育率比不添加物质的提高了9.91个百分点，卵裂率提高了12.26个百分点。
针对上述三个实施例，本发明还做了三个对比试验。
对比试验一：本实验设定四组对比试验，每组对比试验均以一支常规冷冻精液HBQ13201001来完成整个受精过程：
第一组（对照组）：按照实施例一中的步骤不添加任何物质完成体外受精；
第二组（谷胱甘肽+咖啡因）：按照实施例一的步骤完成体外受精；
第三组（谷胱甘肽）：按照实施例一的步骤，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步骤中单独添加纯度大于98%谷胱甘肽，谷胱甘肽与实施例一中添加的浓度一样；
第四组（咖啡因）：按照实施例一的步骤，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步骤中单独添加纯度大于98%咖啡因，咖啡因与实施例一中添加的浓度一样；
对比试验二：也设定四组对比试验，每组对比试验均以一支常规冷冻精液HBQ13201001来完成整个受精过程：
第一组（对照组）：与对比试验一的对照组相同；
第二组（谷胱甘肽+咖啡因）：按照实施例二的步骤完成体外受精；
第三组（谷胱甘肽）：按照实施例二的步骤，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步骤中单独添加纯度大于98%谷胱甘肽，谷胱甘肽与实施例二中添加的浓度一样；
第四组（咖啡因）：按照实施例二的步骤，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步骤中单独添加纯度大于98%咖啡因，咖啡因与实施例二中添加的浓度一样；
对比试验三：也设定四组对比试验，每组对比试验均以一支常规冷冻精液HBQ13201001来完成整个受精过程：
第一组（对照组）：与对比试验一的对照组相同；
第二组（谷胱甘肽+咖啡因）：按照实施例三的步骤完成体外受精；
第三组（谷胱甘肽）：按照实施例三的步骤，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步骤中单独添加纯度大于98%谷胱甘肽，谷胱甘肽与实施例三中添加的浓度一样；
第四组（咖啡因）：按照实施例三的步骤，在添加谷胱甘肽和咖啡因的步骤中单独添加纯度大于98%咖啡因，咖啡因与实施例三中添加的浓度一样。
并将三个对比试验的每组试验中体外受精后的合子用输卵管合成液mSOF（由SOF基础液加入1%双抗和3mg/mLBSA(EFAF)，0.22μm的过滤器过滤后得到，并在4℃保存。）洗涤3-5次，然后转入与处理组对应的在CO2培养箱中平衡不少于2h的胚胎发育微滴中培养。受精当天记为Day0，受精后Day2统计卵裂率和胚胎发育滴中加入5%FBS，Day6-Day9统计囊胚胎率。
在以上试验过程中，通过仪器对实施例一和两个对比试验进行数据分析，检测出以下参数：直线运动精子活率(%)、A级精子百分率(%)、B级精子百分率(%)、C级精子百分率(%)、D级精子百分率(%)、曲线运动速度(VCL,μm/s)、直线运动速度(VSL,μm/s)、平均路径速度(VAP,μm/s)、直线性LIN(VSL/VCL,%)、摆动性WOB(VAP/VCL,%)、前向性STR(VSL/VAP,%)、平均移动角度(MAD,。)、侧摆幅度(ALH,μm)、鞭打频率(BCF,Hz)。
对比试验一中的四组对比试验中精子的活率见表1：
表1谷胱甘肽、咖啡因及其组合添加在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中的精子活率
从上表可以看出5h内各试验组精子活率整体上显示呈下降趋势，显著变化的时间点发生在2h之后。由于咖啡因可以引发精子获能和超活化现象，精子的尾部呈现强有力的“鞭打样”的不对称运动。因此，对2h的精子运动参数进行了进一步的分析，见表2：
表2谷胱甘肽、咖啡因及其组合添加在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中精子运动参数（2h)
表2显示，谷胱甘肽与咖啡因组合应用(2h)之后精子直线活率、曲线运动速度和侧摆幅度显著高于咖啡因组和谷胱甘肽组（P＜0.05）。同时，谷胱甘肽与咖啡因组的其他参数如精子活率、平均路径速度、直线运动速度等也均高于其它各组，而且该组精子的线性参数与其它各组无显著差异（P＞0.05）。
对比试验二中四组试验的精子活率影响见表3，其中2h时各组试验的精子运动参数见表4，表3中除了咖啡因组在5小时内精子活率显著下降外（p<0.05），其他各组在各时间点的精子活率无显著变化。
表3谷胱甘肽、咖啡因及其组合添加在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE获能液的混合液中精子活率比较：
表4谷胱甘肽、咖啡因及其组合添加在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE获能液的混合液中运动参数比较（2h）
表4中显示，在谷胱甘肽与咖啡因组合应用组(2h)的直线运动精子活率、曲线运动速度、侧摆幅度、鞭打频率、平均移动角度和B级精子百分比均显著高于对照组（p<0.05）；直线运动精子活率、平均路径速度、曲线运动速度、侧摆幅度、鞭打频率和平均移动角度显著高于谷胱甘肽组（p<0.05）；直线运动精子活率、平均路径速度、曲线运动速度、直线运动速度、侧摆幅度和平均移动角度显著高于咖啡因组（p<0.05）。同时，该组的精子的线性参数也低于其它各组，尽管无显著性差异（P＞0.05）。
由于对比试验一和对比试验二加入谷胱甘肽和咖啡因都是在体外受精阶段前，所以试验研究的数据是以精子运动参数为准。
对比试验三中四组试验中谷胱甘肽和咖啡因是在受精阶段加入，通过观察胚胎发育过程，记录的外受精胚胎发育各个阶段的数据，见表5。
表5谷胱甘肽、咖啡因及其组合对牛体外受精的影响
从表5中可以看出，各试验组之间8-16细胞胚胎发育率、卵裂率和囊胚率均无显著性差异（P＞0.05）。但是，谷胱甘肽与咖啡因联合应用提高了8-16细胞胚胎发育率和卵裂率。
对于对比试验一与对比试验二的试验研究数据进行对比统计，统计如表6。
表6谷胱甘肽、咖啡因及其组合添加在对比试验一和对比试验二中的精子运动参数比较
将谷胱甘肽、咖啡因以及两者联合应用含有牛精液的SP-TALP洗涤液中和含有牛精液的IVF-TALP受精液与PHE获能液的混合液中的精子运动参数（2h)进行了比较，如表5中的结果显示，咖啡因组含有牛精液的IVF-TALP受精液与PHE获能液的混合液中的精子活率、直线运动精子活率、平均路径速度、曲线运动速度、直线运动速度以及摆动性均显著低于含有牛精液的SP-TALP洗涤液(p<0.05)，谷胱甘肽组在含有牛精液的IVF-TALP受精液与PHE获能液的混合液中的曲线运动速度显著低于含有牛精液的SP-TALP洗涤液(p<0.05)，对照组在含有牛精液的IVF-TALP受精液与PHE获能液的混合液中的直线运动精子活率、平均路径速度、直线运动速度和A级精子百分数显著低于含有牛精液的SP-TALP洗涤液(p<0.05)。但是，谷胱甘肽与咖啡因联合应用组后，尽管在含有牛精液的IVF-TALP受精液与PHE获能液的混合液中的精子运动直线性和C级精子百分数显著低于含有牛精液的SP-TALP洗涤液(p<0.05)，但是曲线运动速度显著升高(p<0.05)。
本发明所有试验中检测样品时，调整显微镜视野，使精子头部变黑，以便CASA系统分析时，能有效进行图像分割，提高精子运动参数的可检测性和检测精确性。如有必要可进行手动图像分割和剔除背景杂质。如果杂质太多，将严重影响CASA系统的检测准确性，建议重新取样。CASA系统参数设置默认为WHO国际标准。所有数据整理后用SigmaStat3.5进行分析，若单因素方差分析（One-Way ANOVA）结果显示组间差异显著，则进行Holm Sidak多重比较。胚胎早期发育数据用LSD进行差异性检验。P＜0.05为差异显著，统计结果以Mean±SEM表示。
通过以上实施例和对比试验组，在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中添加5mmol/L谷胱甘肽和5mmol/L咖啡因，精子活率、直线运动精子活率、曲线运动速度、侧摆幅度和鞭打频率均高于对照组；在含有牛精液的IVF-TALP受精液与PHE获能液的混合液中添加这两种物质的组合，直线运动精子活率、曲线运动速度、侧摆幅度、鞭打频率、平均移动角度和B级精子百分比均显著高于对照组（p<0.05)；在受精的过程中添加这两种物质的组合，8-16细胞胚胎发育率比对照组提高了9.91个百分点，卵裂率提高了12.26个百分点。同时对比试验结果也显示，在SP-TALP培养基和IVF-TALP培养基中同时添加5mmol/L谷胱甘肽和5mmol/L咖啡因，精子活率、运动速度以及侧摆幅度和鞭打频率均不同程度高于单独添加5mmol/L谷胱甘肽或者5mmol/L咖啡因，在受精滴中添加该组合，8-16细胞胚胎发育率和卵裂率也高于单独添加5mmol/L谷胱甘肽或者5mmol/L咖啡因。
Claims (10)
1.一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，依次包括牛冷冻精液的前期处理、受精前精液的获能处理和与加入卵母细胞的受精滴进行体外受精三个阶段，其特征在于：在牛冷冻精液的前期处理阶段中用SP-TALP洗涤液对牛精液处理时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在受精前精液的获能处理阶段中使用PHE获能液对牛精液进行获能处理时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在体外受精阶段中制备含有卵母细胞的受精滴时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因；其中，在牛冷冻精液的前期处理阶段，每支牛冷冻精液加入谷胱甘肽和咖啡因的量为：两者在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中浓度均为5mmol/L；在受精前精液的获能处理阶段，每支牛冷冻精液加入谷胱甘肽和咖啡因的量为：两者在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE获能液的混合液中浓度均为5mmol/L，在体外受精阶段，每支牛冷冻精液加入谷胱甘肽和咖啡因的量为：两者在含有卵母细胞的受精滴与牛精液混合液中的终浓度均为5mmol/L。
2.根据权利要求1所述的一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于在牛冷冻精液的前期处理阶段加入谷胱甘肽和咖啡因时，其体外受精的具体步骤如下：
（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后收集至离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入SP-TALP洗涤液混合均匀，并向牛精液和SP-TALP洗涤液的混合液中添加纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，致使谷胱甘肽和咖啡因在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中的浓度均为5mmol/L，然后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min，离心时间5-8min；
（2）将步骤（1）中温育处理后的混合液放入离心管中第二次离心并弃上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液调整精子的浓度为3×106个/mL～4×106个/mL，之后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中储存备用；其中第二次离心的离心速度为1500-1700r/min，离心时间为5-10min，二次离心弃上清后留取的牛精液沉淀混合物为100-120μL；
（3）将步骤（2）中准备的含有精子的IVF-TALP受精液与PHE获能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的混合获能液，放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（4）取40-50μL的IVF-TALP受精液，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞，制备成60μL含有牛卵母细胞的受精滴，并放入温度为38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽培养箱备用；
（5）将步骤（4）中制备的含有牛卵母细胞的受精滴与步骤（3）中获能处理后的含有牛精液的混合获能液按照体积比1:1的比例混合后放入38.5℃，5%的CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中培养18-20h。
3.根据权利要求1所述的一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于在受精前精液的获能处理阶段加入谷胱甘肽和咖啡因时，其体外受精的具体步骤如下：
（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后收集至离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入SP-TALP洗涤液中混合均匀后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min2000r/min，离心时间5-8min；
（2）将步骤（1）中温育处理后的混合液放入离心管中第二次离心并弃上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液调整精子的浓 度为3×106个/mL～4×106个/mL，之后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中储存备用；其中第二次离心的离心速度为1500-1700r/min，离心时间为5-10min，二次离心弃上清后留取的牛精液沉淀混合物为100-120μL；
（3）将步骤（2）中准备的含有精子的IVF-TALP受精液与PHE获能液按照17:13的比例混合形成含有牛精液的混合获能液，向混合获能液内添加纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，致使谷胱甘肽和咖啡因在含有牛精液的获能混合液中的终浓度为5mmol/L，之后将其放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（4）取40-50μL的IVF-TALP受精液，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞，制备成60μL含有牛卵母细胞的受精滴，再放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（5）将步骤（4）中制备的含有牛卵母细胞的受精滴与步骤（3）中获能处理后的含有牛精液的混合获能液等体积混合后放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中培养18-20h。
4.根据权利要求1所述的一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于在体外受精阶段加入谷胱甘肽和咖啡因时，其体外受精的具体步骤如下：
（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后放入离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入SP-TALP洗涤液中混合均匀后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min，离心时间5-8min；
（2）将步骤（1）中温育处理后的混合液放入离心管中第二次离心并弃上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液调整精子的浓 度为3×106个/mL～4×106个/mL，之后放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中储存备用；其中第二次离心的离心速度为1500-1700r/min，离心时间为5-10min，二次离心弃上清后留取的牛精液沉淀混合物为100-120μL；
（3）将步骤（2）中准备的含有精子的IVF-TALP受精液与PHE获能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的获能混合液，放入37℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（4）取40-45μL的IVF-TALP受精液制备成受精滴，放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中预孵2小时，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞，然后添加10mmol/L的纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，制备成体积为60μL的受精滴，并放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中备用；
（5）将步骤（4）中制备的受精滴与步骤（3）中获能处理后的含有牛精液的获能混合液等体积混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的终浓度为5mmol/L，然后放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中培养18-20h。
5.根据权利要求2所述的一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于：在牛冷冻精液的前期处理阶段中用SP-TALP洗涤液对牛精液处理过程中加入谷胱甘肽和咖啡因时，是将含有牛精液的SP-TALP洗涤液、浓度为100mmol/L的谷胱甘肽浓储液和浓度为100mmol/L咖啡因浓储液按照体积比18：1：1的比例混合均匀，使含有牛精液的SP-TALP洗涤液中谷胱甘肽和咖啡因终浓度均为5mmol/L。
6.根据权利要求3所述的提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于：在受精前精液的获能处理阶段向含有精子的IVF-TALP受精液与PHE获能液混合液中加入谷胱甘肽和咖啡因时，是将含有精子的 IVF-TALP受精液、PHE获能液、浓度为100mmol/L的谷胱甘肽浓储液和浓度为100mmol/L的咖啡因浓储液按照体积比14：13：1.5：1.5混合均匀，使混合后的获能液中谷胱甘肽和咖啡因终浓度均为5mmol/L。
7.根据权利要求4所述的提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于：在体外受精阶段向受精滴中加入谷胱甘肽和咖啡因时，取40-45μL的IVF-TALP受精液制备成受精滴，将其放入38.5℃，5%CO2和100%饱和蒸汽的培养箱中预孵2小时，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞后使得总体积为48μL，按照体积比8：1：1加入浓度为100mmol/L的谷胱甘肽浓储液和浓度为100mmol/L，使得60μL的受精滴中含有10mmol/L谷胱甘肽和咖啡因，之后将含有精子的IVF-TALP受精液和PHE获能液以17:13的比例混合后再与受精滴等体积混合，致使谷胱甘肽和咖啡因的最终浓度均为5mmol/L。
8.根据权利要求1或2或3或4所述的提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于：其特征在于所述的SP-TALP洗涤液的配制方法如下：在每100ml的纯水中加入0.579g氯化钠，0.0230g氯化钾，0.2104g碳酸氢钠，0.0047g磷酸二氢钠，0.3612g乳酸钠，0.2975gHEPES，0.0294g氯化钙，0.0224g氯化镁，并混合均匀后调PH值至7.4，然后通过孔径为0.22μm的过滤器进行过滤后，再向过滤液中添加0.6316g V级的血清白蛋白、5.263mL浓度为2.2mg/mL的丙酮酸和210.53μL浓度为5mg/mL的庆大霉素进行混合，再将混合液通过孔径为0.22μm的过滤器进行过滤后形成SP-TALP洗涤液。
9.根据权利要求1或2或3或4所述的提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于所述的IVF-TALP受精液的配制方法如下：在每100ml的纯水中加入0.6665g氯化钠，0.0235g氯化钾，0.2104g碳酸氢钠， 0.0047g磷酸二氢钠，0.1116g乳酸钠，0.0294g氯化钙，0.0102g氯化镁，并混合均匀后调PH值至7.4，然后通过孔径为0.22μm的过滤器进行过滤后，再向过滤液中添加0.6g血清白蛋白、1mL浓度为2.2mg/mL的丙酮酸、100μL浓度为5mg/mL的庆大霉素和500μL肝素并混合均匀，最后将混合液通过孔径为0.22μm的过滤器进行过滤制成IVF-TALP受精液。
10.根据权利要求1或2或3或4所述的提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于所述PHE获能液是由亚牛磺酸溶液、青霉素钠溶液和肾上腺素溶液按照体积比5：5：2混合均匀后，再用孔径为0.22μm的过滤器过滤，分装，在-20℃的环境下永久保存；其中，所述亚牛磺酸溶液是在每10ml生理盐水中溶解1.09mg亚牛磺酸制成；青霉素钠溶液是在每10ml生理盐水中溶解3mg青霉素钠制成；肾上腺素溶液是在每10ml生理盐水中溶解1.83mg肾上腺素制成。
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