CN108300753B - 一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法 - Google Patents
一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108300753B CN108300753B CN201810001267.0A CN201810001267A CN108300753B CN 108300753 B CN108300753 B CN 108300753B CN 201810001267 A CN201810001267 A CN 201810001267A CN 108300753 B CN108300753 B CN 108300753B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sperm
- semen
- proportion
- pipette
- weak
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，包括精液处理、精液浓缩和精子活力的测定三个步骤。本发明可以对于将行体外受精的精子的受精能力进行一个快速有效的预判，能够在短时间内对于精子，特别是弱畸精子，提前预测精子的受精能力，防止受精失败。
Description
技术领域
本发明涉及一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，具体为一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，属于体外受精应用领域。
背景技术
在受精过程中，精子发生顶体反应，穿过卵子透明带，刺激卵子发生卵黄膜反应，并排出第二极体，从而完成受精。精子功能缺陷会导致精子与透明带结合和穿透障碍。精子活力和形态是影响体外受精率的重要因素。一些研究发现，精液常规分析精子活力低下，形态异常时，体外受精发生受精障碍的可能性更大。进一步的研究表明，精子活力，数量和形态的异常对于体外受精结局和后期胚胎发育都有一定的影响。弱畸精子症对于体外受精受精率有显著影响。原发不育的弱畸精子症患者有较高的体外受精受精障碍风险和较低的临床妊娠率。这可能是由于这些参数异常的精液中，诸如DNA碎片高，顶体酶活性异常的精子比例较高，从而导致受精障碍的风险更高。不仅如此，精液常规分析参数正常的男性患者中，也会由于精子与透明带结合异常或者精子顶体功能缺陷导致体外受精低受精或不受精。在常规体外受精中，有10％-25％的周期会发生受精率低于30％。为提高体外受精受精率，增加体外受精可利用胚胎数，保证患者的妊娠率，对于精力活力低，形态异常的患者行体外受精，我们一定要多加考虑，选择合理的受精方式。
自1992年世界首例卵胞浆内单精子注射技术技术诞生的试管婴儿诞生以来，全世界已有超过百万的婴儿通过卵胞浆内单精子注射技术技术诞生。在英国，寻求试管婴儿技术的夫妇中有半数选择了该技术，在北美和欧洲一些国家，这一比例甚至达到了80％到90％。需要注意的是，卵胞浆内单精子注射技术虽然大大提高了受精效率，但也不是万能的。研究证实，卵胞浆内单精子注射技术虽然能提高卵子的受精率，但对受精正常的患者，并不能提高妊娠率。卵胞浆内单精子注射技术技术和自然妊娠相比较减少了自然选择的筛选，引入了不可预测的因素，可能会增加后代异常的发生率。自卵胞浆内单精子注射技术技术诞生之日起，关于此技术安全性的争议就从未停止。越来越多的研究关注卵胞浆内单精子注射技术后代的健康状况。该技术必经诞生只有二十多年，其远期安全性仍然有待评估。为了患者的整体利益，卫生部[2003]176号文件关于人类辅助生殖技术规范中，对于如何选择体外受精和卵胞浆内单精子注射技术受精方式，以及卵胞浆内单精子注射技术占总周期数的比例是有严格规定的。国内的规范生殖中心必须严格把握卵胞浆内单精子注射技术的指征，控制卵胞浆内单精子注射技术比例。
精子入卵后，卵子完成第二次减数分裂，排出第二极体。短时受精是根据第二极体的排出情况预测受精结局。体外受精受精后3h，第二极体开始排出。4h时观察第二极体排出情况。若6h时第二极体比例小于30％，则认为卵子受精困难，需要对第一极体卵子进行卵胞浆内单精子注射技术补救，以防止卵子和精子低受精和不受精的发生。尽管一些研究报道表明，短时受精以及早期卵胞浆内单精子注射技术补救的临床结局与常规体外受精相比没有明显差异。但是实际上，第二极体的排出和雌雄原核的形成是两个相互关联而又相对独立的生物学事件。根据第二极体的排出预测受精有一定的局限性。此外，脱颗粒观察这种早期干预对于卵子的应激，由于极体碎裂导致第二极体排出判断的不明确，卵胞浆内单精子注射技术补救判断不合理导致人为的多精受精，这些因素给生殖中心应用短时受精技术带来了很大考验。
PVP是一种人工合成的聚合物，具有优良的生理惰性，不参与人体新陈代谢，又具有优良的生物相容性。在卵胞浆内单精子注射技术中，常用做精子制动，一方面使精子运动减慢，另一方面起到润滑的作用，使精子不粘附在注射管壁，利于注射时精子的释放。我们在进行早卵胞浆内单精子注射技术补救时经常发现，这些由于精子因素需要补救的周期中，在培养基中活力正常的精子加入7％的PVP中活力下降迅速并大量发生凝集现象。而我们通常认为，精子发生凝集是活力下降进而受精能力下降的表现。我们的预实验发现，能够正常体外受精的精子加入PVP中，精子活力下降并不是很迅速，凝集发生较少。这提示我们，将处理后的精子加入PVP中，利用观察活力和凝集的改变，或许能否够快速检测精子的受精能力。我们的研究对这一实验过程进行详细的量化，使其能够快速高效的运用到实际体外受精操作中。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，包括如下步骤：
A、精液处理
1)收集新鲜精液，并将精液放置于37℃培养箱中液化30min；
2)用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液的lower液，再用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液中的upper液，贴壁加到精子密度梯度分离液的lower液上方,将液化完全的新鲜精液加入精子密度梯度分离液upper液的上方，采用非连续密度梯度离心法离心，300g离心20min，离心结束后弃去上清液,保留沉淀；
3)用1ml的移液枪吸取4ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液加入第2)步得到的沉淀里，用移液枪吹打混匀，采用非连续密度梯度离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液，保留沉淀；
4)用1ml的移液枪吸取0.3ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液贴壁加入第3)步中得到的沉淀上方，并放置于37℃、二氧化碳浓度设定为5.5％的培养箱中上游30min，然后用1ml的移液枪吸出250μl的上清液放入5ml小试管中；
B、精液浓缩
1)首先用10μl的移液枪吸取5μl步骤A第4)步中的精液于精子计数板上进行计数，统计精子的密度ρ，统计后得出的精子的密度ρ低于40×106个/ml，则需要对精液样本进行浓缩，精液浓缩具体步骤如下；
2)用100μl的移液枪吸取50μl步骤A第4)步中上游完成的精液放入0.5ml离心管中，采用混合离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液；
3)向步骤B第2)步得到的沉淀中加入10～25μl的含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液，授精输卵管培养液的添加量V根据精子的密度ρ计算，具体计算方法如下：
V＝ρ×50μl/(40x106个/ml)；
C、精子活力的测定
1)用10μl的移液枪吸取5μl步骤B中浓缩后的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
2)分别用10μl的移液枪吸取2.5μl步骤A第4)步中的精液和7.5μlPVP 7％solution放置于0.5ml离心管中，充分吹打，将混合溶液充分混匀并放置于37℃、二氧化碳浓度为5.5％的培养箱中静置10min；
3)用10μl的移液枪吸取5μl步骤2)中的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
4)将步骤1)中统计出的前向运动精子的比例与步骤3)中统计出的前向运动精子的比例进行对比即可；
D、预测弱畸精子症的体外受精能力
1)根据步骤A中第1)～第4)步的操作和步骤C中第1)步的操作，分别检测正常精子组和弱畸精子组前向运动精子的比例，将前向运动精子的比例小于90％的实验对象剔除；
2)根据步骤C中第2)、3)步的操作，分别检测正常精子组和弱畸精子组中加入PVP7％solution后前向运动精子的比例，正常精子组定义为T1组，弱畸精子组中加入PVP 7％solution后前向运动精子的比例大于或等于50％的定义为T2组，弱畸精子组中加入PVP7％solution后前向运动精子的比例小于50％的定义为T3组；结果显示，向弱畸精子中加入PVP 7％solution后，前向运动精子的比例小于50％的对象体外受精率极低，因此，可以通过向弱畸精子中加入PVP 7％solution来预测弱畸精子症的体外受精能力。
优选地，所述非连续密度梯度离心机的型号为Eppendorf 5702，所述混合离心机的型号为eppendorf minispin plus，所述非连续密度梯度离心机和所述混合离心机均采购自德国的艾本德公司。
优选地，所述含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液型号为Quinn’s 1020，采购自美国的SAGE药厂。
优选地，所述培养箱型号为SANYO MCO-5AC，采购自日本的三洋二氧化碳培养箱。
优选地，所述精子计数板为以色列的markler板。
优选地，所述步骤B第3)步中浓缩后的精子密度大于或等于40x106个/ml。
本发明的有益效果是：运用快速法判定体外受精受精后，我们对于所有精子进行PVP中活力的评判，结合随后的受精参数，来评价该方法的准确性。同时我们统计了临床增加的可利用胚胎数。我们的实验室数据表明，其预测准确度很高。应用之后给患者带来很大的体利益，包括增加可利用胚胎数和节约体外受精花费。本研究的意义在于，对于将行体外受精的精子的受精能力进行一个快速有效的预判。能够在短时间内对于精子，特别是弱畸精子，提前预测精子的受精能力，防止受精失败。由于这种方法操作简便快捷，在加精前快速操作，弥补了短时受精和卵胞浆内单精子注射技术补救的不足。此外，本研究可以实习体外受精和卵胞浆内单精子注射技术同时进行，如果受精快速检测出现异常，那么我们会多留卵子进行注射，这样可以避免体外受精操作中不受精带来的卵子浪费，提高卵子利用率，增加可利用胚胎数。那么对于快速检测实验正常的精子，目前我们的研究是不再同时做体外受精和卵胞浆内单精子注射技术，而将全部卵子改成常规体外受精。这样可以明显降低卵胞浆内单精子注射技术比率，更严格的把握了卵胞浆内单精子注射技术指征。还可以节约患者的治疗费用和实验室的劳动成本。值得指出的是，本实验只对精子受精障碍进行准确有效的预判，对于卵子质量差引起的受精异常并没有预判作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
用于做体外受精的上游精子，前向运动精子的比例大于或等于90％，密度在10×106～100×106个/ml，精子密度低于40×106个/ml，需要对精液样本进行浓缩，便于后期快速预测时精子参数读数更为准确。精液检查按照世界卫生组织(WHO)制定的《人类精液检查与处理实验室手册第五版》相关标准，精子活力异常，即前向运动精子比<32％被定义为弱精子症；精子形态异常，即正常形态精子百分率<4％被定义为畸形精子症。
收集实验对象的精液，使用精子分析仪对精液进行初步的活力和形态化验，精子分析仪的型号为WLJY-9000，采购自中国的伟力彩色精子质量分析仪，收集对象年龄小于或等于37岁，根据精液初步化验结果，将实验对象分成正常精子组和弱畸精子组，分别对正常精子组和弱畸精子组的精液进行如下处理：
实施例1
一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，包括如下步骤：
A、精液处理
1)收集新鲜精液，并将精液放置于37℃培养箱中液化30min；
2)用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液的lower液，再用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液中的upper液，贴壁加到精子密度梯度分离液的lower液上方,将液化完全的新鲜精液加入精子密度梯度分离液upper液的上方，采用非连续密度梯度离心法离心，300g离心20min，离心结束后弃去上清液,保留沉淀；
3)用1ml的移液枪吸取4ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液加入第2)步得到的沉淀里，用移液枪吹打混匀，采用非连续密度梯度离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液，保留沉淀；
4)用1ml的移液枪吸取0.3ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液贴壁加入第3)步中得到的沉淀上方，贴壁缓慢加入，避免冲起沉淀，并放置于37℃、二氧化碳浓度设定为5.5％的培养箱中上游30min，然后用1ml的移液枪吸出250μl的上清液放入5ml小试管中；
B、精液浓缩
1)用10μl的移液枪吸取5μl步骤A第4)步中的精液于精子计数板上进行计数，统计精子的密度ρ＝60×106个/ml，由于精子的密度ρ大于40×106个/ml，省略精液浓缩步骤；
C、精子活力的测定
1)用10μl的移液枪吸取5μl步骤B中浓缩后的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
2)分别用10μl的移液枪吸取2.5μl步骤A第4)步中的精液和7.5μlPVP 7％solution放置于0.5ml离心管中，充分吹打，将混合溶液充分混匀并放置于37℃、二氧化碳浓度为5.5％的培养箱中静置10min；
3)用10μl的移液枪吸取5μl步骤2)中的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
4)将步骤1)中统计出的前向运动精子的比例与步骤3)中统计出的前向运动精子的比例进行对比即可。
实施例2
一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，包括如下步骤：
A、精液处理
1)收集新鲜精液，并将精液放置于37℃培养箱中液化30min；
2)用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液的lower液，再用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液中的upper液，贴壁加到精子密度梯度分离液的lower液上方,将液化完全的新鲜精液加入精子密度梯度分离液upper液的上方，采用非连续密度梯度离心法离心，300g离心20min，离心结束后弃去上清液,保留沉淀；
3)用1ml的移液枪吸取4ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液加入第2)步得到的沉淀里，用移液枪吹打混匀，采用非连续密度梯度离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液，保留沉淀；
4)用1ml的移液枪吸取0.3ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液贴壁加入第3)步中得到的沉淀上方，贴壁缓慢加入，避免冲起沉淀，并放置于37℃、二氧化碳浓度设定为5.5％的培养箱中上游30min，然后用1ml的移液枪吸出250μl的上清液放入5ml小试管中；
B、精液浓缩
1)用10μl的移液枪吸取5μl步骤A第4)步中的精液于精子计数板上进行计数，统计精子的密度ρ；
2)用100μl的移液枪吸取50μl步骤A第4)步中上游完成的精液放入0.5ml离心管中，采用混合离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液；
3)向步骤B第2)步得到的沉淀中加入10～25μl的含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液，授精输卵管培养液的添加量V根据精子的密度ρ计算，具体计算方法如下：
V＝(20×106个/ml)×50μl/(40x106个/ml)＝25μl
即向沉淀中加入25μl含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液，将精液密度调整到40x106个/ml；
C、精子活力的测定
1)用10μl的移液枪吸取5μl步骤B中浓缩后的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
2)分别用10μl的移液枪吸取2.5μl步骤A第4)步中的精液和7.5μlPVP 7％solution放置于0.5ml离心管中，充分吹打，将混合溶液充分混匀并放置于37℃、二氧化碳浓度为5.5％的培养箱中静置10min；
3)用10μl的移液枪吸取5μl步骤2)中的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
4)将步骤1)中统计出的前向运动精子的比例与步骤3)中统计出的前向运动精子的比例进行对比即可。
实施例3
一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，包括如下步骤：
A、精液处理
1)收集新鲜精液，并将精液放置于37℃培养箱中液化30min；
2)用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液的lower液，再用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液中的upper液，贴壁加到精子密度梯度分离液的lower液上方,将液化完全的新鲜精液加入精子密度梯度分离液upper液的上方，采用非连续密度梯度离心法离心，300g离心20min，离心结束后弃去上清液,保留沉淀；
3)用1ml的移液枪吸取4ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液加入第2)步得到的沉淀里，用移液枪吹打混匀，采用非连续密度梯度离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液，保留沉淀；
4)用1ml的移液枪吸取0.3ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液贴壁加入第3)步中得到的沉淀上方，贴壁缓慢加入，避免冲起沉淀，并放置于37℃、二氧化碳浓度设定为5.5％的培养箱中上游30min，然后用1ml的移液枪吸出250μl的上清液放入5ml小试管中；
B、精液浓缩
1)用10μl的移液枪吸取5μl步骤A第4)步中的精液于精子计数板上进行计数，统计精子的密度ρ；
2)用100μl的移液枪吸取50μl步骤A第4)步中上游完成的精液放入0.5ml离心管中，采用混合离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液；
3)向步骤B第2)步得到的沉淀中加入10～25μl的含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液，授精输卵管培养液的添加量V根据精子的密度ρ计算，具体计算方法如下：
V＝(10×106个/ml)×50μl/(40x106个/ml)＝12.5μl
即向沉淀中加入12.5μl含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液，将精液密度调整到40x106个/ml；
C、精子活力的测定
1)用10μl的移液枪吸取5μl步骤B中浓缩后的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
2)分别用10μl的移液枪吸取2.5μl步骤A第4)步中的精液和7.5μlPVP7％solution放置于0.5ml离心管中，充分吹打，将混合溶液充分混匀并放置于37℃、二氧化碳浓度为5.5％的培养箱中静置10min；
3)用10μl的移液枪吸取5μl步骤2)中的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
4)将步骤1)中统计出的前向运动精子的比例与步骤3)中统计出的前向运动精子的比例进行对比即可。
所述非连续密度梯度离心机的型号为Eppendorf 5702，所述混合离心机的型号为eppendorf minispin plus，所述非连续密度梯度离心机和所述混合离心机均采购自德国的艾本德公司。
所述含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液型号为Quinn’s 1020，采购自美国的SAGE药厂。
所述培养箱型号为SANYO MCO-5AC，采购自日本的三洋二氧化碳培养箱。
所述精子计数板为以色列的markler板。
根据步骤A中第1)～第4)步的操作和步骤C中第1)步的操作，分别检测正常精子组和弱畸精子组前向运动精子的比例，将前向运动精子的比例小于90％的实验对象剔除。
根据步骤C中第2)、3)步的操作，分别检测正常精子组和弱畸精子组中加入PVP7％solution后前向运动精子的比例，正常精子组定义为T1组，弱畸精子组中加入PVP 7％solution后前向运动精子的比例大于或等于50％的定义为T2组，弱畸精子组中加入PVP7％solution后前向运动精子的比例小于50％的定义为T3组，得出以下结果，具体数据详见表1。
表1加入PVP7％solution后前向运动精子比例对体外受精受精率的影响表
| T1 | T2 | T3 | |
| 实验对象数(对) | 50 | 21 | 24 |
| 处理前前向运动精子比例(％) | 98.82<sup>a</sup> | 95.48<sup>ab</sup> | 93.83<sup>b</sup> |
| 处理后前向运动精子比例(％) | 80.96<sup>a</sup> | 75.38<sup>b</sup> | 38.88<sup>c</sup> |
| 体外受精受精率(％) | 62.07(383/617)<sup>a</sup> | 59.54(103/173)<sup>a</sup> | 9.09(19/209)<sup>b</sup> |
从表1中我们可以看出，T1组中实验对象为50对，获卵数为617个；T2组中实验对象为21对，获卵数为173个；T3组中实验对象为24对，获卵数为209个。加入PVP 7％solution前，T1组平均前向运动精子的比例为98.82％，T2组平均前向运动精子的比例为95.48％，T3平均组前向运动精子的比例为93.83％；加入PVP 7％solution后，T1组平均前向运动精子的比例为80.96％，T2组平均前向运动精子的比例为75.38％，T3组平均前向运动精子的比例为38.88％。
分别将T1组、T2组和T3组中的精液进行体外受精实验，得出以下结果：
T1组中受精的卵子为383个，平均体外受精受精率为62.07％；T2组中受精的卵子为103个，平均体外受精受精率为59.54％；T3组中受精的卵子为19个，平均体外受精受精率为9.09％。
从以上结果我们可以分析出以下结论：
加入PVP7％solution后前向运动精子的比例下滑，体外受精受精率随前向运动精子比例的下滑而降低。
与T1、T2组相比，T3组精子加入PVP7％solution后前向运动精子的比例显著下降(P<0.01)；同时T3组的体外受精受精率显著低于T1、T2组(P<0.01)。
综上所述，向弱畸精子中加入PVP 7％solution后，前向运动精子的比例小于50％的对象体外受精率极低，因此，可以通过向弱畸精子中加入PVP 7％solution来预测弱畸精子症的体外受精能力。
临床研究表明，每个行周期行体外受精的平均花费为30000元，平均获卵数为10枚，平均可利用胚胎数为6枚，每枚可利用胚胎的花费为5000元。
目前已开展应用此方法有5例，即为向弱畸精子中加入PVP 7％solution后前向运动精子的比例小于50％的患者，对这5位患者多留卵子进行卵胞浆内单精子注射，其中3位患者增加2枚胚胎，另外2位患者增加3枚胚胎，一共增加12枚胚胎。
胚胎数的增加，不仅可以为每位患者增加移植机会的，同时可以降低体外受精费用。以每枚可利用胚胎的花费为5000元计算，每位患者可以减少10000～15000元。
每年平均临床就诊患者200对，按照每枚可利用胚胎的花费为5000元，每例增加2-3枚可利用胚胎，那么相当于为患者节约了(2-3)枚x200 x5000元/枚＝2000000～3000000元。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、精液处理
1)收集新鲜精液，并将精液放置于37℃培养箱中液化30min；
2)用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液的lower液，再用1ml的移液枪吸取1ml精子密度梯度分离液中的upper液，贴壁加到精子密度梯度分离液的lower液上方,将液化完全的新鲜精液加入精子密度梯度分离液upper液的上方，采用非连续密度梯度离心法离心，300g离心20min，离心结束后弃去上清液,保留沉淀；
3)用1ml的移液枪吸取4ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液加入第2)步得到的沉淀里，用移液枪吹打混匀，采用非连续密度梯度离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液，保留沉淀；
4)用1ml的移液枪吸取0.3ml含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液贴壁加入第3)步中得到的沉淀上方，并放置于37℃、二氧化碳浓度设定为5.5％的培养箱中上游30min，然后用1ml的移液枪吸出250μl的上清液放入5ml小试管中；
B、精液浓缩
1)首先用10μl的移液枪吸取5μl步骤A第4)步中的精液于精子计数板上进行计数，统计精子的密度ρ，统计后得出的精子的密度ρ低于40×106个/ml，则需要对精液样本进行浓缩，精液浓缩具体步骤如下；
2)用100μl的移液枪吸取50μl步骤A第4)步中上游完成的精液放入0.5ml离心管中，采用混合离心法进行离心，500g离心5min，离心结束后弃去上清液；
3)向步骤B第2)步得到的沉淀中加入10～25μl的含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液，授精输卵管培养液的添加量V根据精子的密度ρ计算，具体计算方法如下：
V＝ρ×50μl/(40x106个/ml)；
C、精子活力的测定
1)用10μl的移液枪吸取5μl步骤B中浓缩后的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
2)分别用10μl的移液枪吸取2.5μl步骤A第4)步中的精液和7.5μlPVP 7％solution放置于0.5ml离心管中，充分吹打，将混合溶液充分混匀并放置于37℃、二氧化碳浓度为5.5％的培养箱中静置10min；
3)用10μl的移液枪吸取5μl步骤2)中的精液于精子计数板上进行计数，统计前向运动精子的比例；
4)将步骤1)中统计出的前向运动精子的比例与步骤3)中统计出的前向运动精子的比例进行对比即可；
D、预测弱畸精子症的体外受精能力
1)根据步骤A中第1)～第4)步的操作和步骤C中第1)步的操作，分别检测正常精子组和弱畸精子组前向运动精子的比例，将前向运动精子的比例小于90％的实验对象剔除；
2)根据步骤C中第2)、3)步的操作，分别检测正常精子组和弱畸精子组中加入PVP 7％solution后前向运动精子的比例，正常精子组定义为T1组，弱畸精子组中加入PVP 7％solution后前向运动精子的比例大于或等于50％的定义为T2组，弱畸精子组中加入PVP7％solution后前向运动精子的比例小于50％的定义为T3组；结果显示，向弱畸精子中加入PVP 7％solution后，前向运动精子的比例小于50％的对象体外受精率极低，因此，可以通过向弱畸精子中加入PVP 7％solution来预测弱畸精子症的体外受精能力。
2.根据权利要求1所述的一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于：所述非连续密度梯度离心机的型号为Eppendorf 5702，所述混合离心机的型号为eppendorfminispin plus，所述非连续密度梯度离心机和所述混合离心机均采购自德国的艾本德公司。
3.根据权利要求1所述的一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于：所述含10％血清蛋白替代品的授精输卵管培养液型号为Quinn’s 1020，采购自美国的SAGE药厂。
4.根据权利要求1所述的一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于：所述培养箱型号为SANYO MCO-5AC，采购自日本的三洋二氧化碳培养箱。
5.根据权利要求1所述的一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于：所述精子计数板为以色列的markler板。
6.根据权利要求1所述的一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法，其特征在于：所述步骤B第3)步中浓缩后的精子密度大于或等于40x106个/ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810001267.0A CN108300753B (zh) | 2018-01-02 | 2018-01-02 | 一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810001267.0A CN108300753B (zh) | 2018-01-02 | 2018-01-02 | 一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108300753A CN108300753A (zh) | 2018-07-20 |
| CN108300753B true CN108300753B (zh) | 2021-10-12 |
Family
ID=62868123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810001267.0A Active CN108300753B (zh) | 2018-01-02 | 2018-01-02 | 一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108300753B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103445882A (zh) * | 2013-08-28 | 2013-12-18 | 武汉市畜牧兽医科学研究所 | 提高牛冷冻精液精子运动性和体外受精率的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150031019A1 (en) * | 2013-03-14 | 2015-01-29 | Cellcura As | Computer Assisted Sperm Profile Analysis and Recognition |
-
2018
- 2018-01-02 CN CN201810001267.0A patent/CN108300753B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103445882A (zh) * | 2013-08-28 | 2013-12-18 | 武汉市畜牧兽医科学研究所 | 提高牛冷冻精液精子运动性和体外受精率的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| An alternative to PVP for slowing sperm prior to ICSI;B.Balaban et al;《Human Reproduction》;20031231;第18卷(第9期);第1887-1889页 * |
| Comparison of two ready-to-use systems designed for sperm–hyaluronic acid binding selection before intracytoplasmic sperm injection: PICSI vs. Sperm Slow: a prospective, randomized trial;Lodovico Parmegiani et al;《Fertility and Sterility》;20120930;第98卷(第3期);第632-637页 * |
| Improving ICSI: A review from the spermatozoon perspective;Mara Simopoulou et al;《SYSTEMS BIOLOGY IN REPRODUCTIVE MEDICINE》;20161231;第62卷(第6期);第359-371页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108300753A (zh) | 2018-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schulman et al. | Scientific aspects of preconception gender selection | |
| Morton et al. | In vitro and in vivo survival of bisected sheep embryos derived from frozen-thawed unsorted, and frozen-thawed sex-sorted and refrozen-thawed ram spermatozoa | |
| Li et al. | Application of a microfluidic sperm sorter to in vitro production of dairy cattle sex-sorted embryos | |
| Acar et al. | Effect of the stage of estrous cycle on follicular population, oocyte yield and quality, and biochemical composition of serum and follicular fluid in Anatolian water buffalo | |
| CN102250836A (zh) | 猪精子二层percoll密度梯度离心分离法 | |
| Zheng et al. | ICSI treatment of severe male infertility can achieve prospective embryo quality compared with IVF of fertile donor sperm on sibling oocytes | |
| Ivanova et al. | Effect of cryopreservation on zona-binding capacity of canine spermatozoa in vitro | |
| Jiang et al. | Frozen blastocysts: Assessing the importance of day 5/day 6 blastocysts or blastocyst quality | |
| CN108300753B (zh) | 一种预测弱畸精子症体外受精能力的方法 | |
| CN110554204B (zh) | 一种用3个血清生化指标诊断/预警围产期脂肪肝奶牛的方法 | |
| Horta et al. | Male factor infertility outcomes using magnetic activated cell sorting in intra citoplasmatic sperm injection cycles | |
| Nogueira et al. | Factors affecting the in vitro production of bovine embryos in a commercial program | |
| Dehghanpour et al. | Free centrifuge sorting method for high‐count sperm preparation improves biological characteristics of human spermatozoa and clinical outcome: A sibling oocytes study | |
| McNally et al. | P-108 Does DNA Fragmentation. level significantly impact clinical outcomes in patients undertaking Assisted Reproduction with using donor oocytes? | |
| Hadi et al. | Separation of Y-chromosome bearing ram’s sperms using an albumin gradient technique and identification of embryos by PCR | |
| RU2593740C1 (ru) | Способ регулирования степени зиготности беременности в программах экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов | |
| Barros et al. | P–038 Clinical outcomes of 77 testicular sperm extraction treatment cycles in non-mosaic Klinefelter syndrome patients | |
| Khalid et al. | Effect of magnetically selected sperm on fertilization and embryo development: an animal model study | |
| Makieva et al. | The impact of zygote vitrification timing on pregnancy rate in frozen-thawed IVF/ICSI cycles | |
| CN113564105A (zh) | 一种精子洗涤上游方法 | |
| CN103654998A (zh) | 一种利用性控精液进行经产奶牛冷配的方法 | |
| HUANG et al. | Related factors of in vitro fertilization and embryo transfer patients with complete fertilization failure | |
| Mohammed et al. | Morphological Characteristics of Ovarian Tissues and Follicular Fluid Metabolites of Female Lambs and Ewes in Subtropics | |
| Shi et al. | P-046 Effect of different sperm chromatin dispersion type on IVF/ICSI outcome and offspring profile | |
| Yang et al. | Comparison of two different schemes of once-weekly ovum pick up in dairy heifers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |