CN102250836A - 猪精子二层percoll密度梯度离心分离法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的猪精液二层percoll密度梯度离心法，适用于正常的精液标本及精子密度低或精子活力低的精液标本，是一种简单、便捷的精子处理方法。该方法能除去精液中的白细胞、细菌、碎片及抗精子抗体；改善精液液化不良和精子体外获能等，使之能有效地与卵子受精，以提高妊娠率，获得的精子中有运动能力且形态正常的百分率为95％左右。本发明的方法适用于猪鲜精及稀释后精液中活力精子的筛选，为猪精子获能机制及体外受精的研究提供高质量的精子。

Description

猪精子二层percoll密度梯度离心分离法

技术领域

本发明涉及一种从猪精液中分离高活力精子的方法，具体涉及猪精子二层percoll密度梯度离心分离法。

背景技术

受精(fertilization)是卵子和精子融合为合子的过程，是有性生殖的基本特征。随着胚胎工程和辅助生殖技术的发展，体外受精技术得到越来越多的应用。完成体外受精首先需要体外获取高活力精子，精子分离法主要是将活动的精子与不活动的精子分开，目前应用的有精子上游法、白蛋白柱分离法、玻璃纤维滤过技术、Percoll密度梯度分离法等。由于猪冷冻精液技术不成熟，目前主要从新鲜的猪精子稀释液中获取精子^[1]。猪的精子分离法主要采取精子上游法。目前存在的问题有：上游的精子易抱团影响精子受精能力^[2]；获取的精子活力低下^[3]；精浆中存在抗精子抗体影响精子活力和精子获能^[4]；获取精子的同时白细胞、细菌、碎片和一些精子保护液残留高影响精子活力；双头、双尾等劣质精子难以去除等。(参考文献：[1]Fahy G M..Effect ofrapid warming of boar semen on sperm morphology and physiology[J]Cryobiology，1986，23：1～13。[2]江峰，王益鑫，盛新福，等.精液体外处理方法的选择.中国男科学杂志，2000，14(2)：134。[3]赵邦荣.通过L_4膜过滤后精液质量和精子受精能力的改善：与上游法结果的比较.国外医学(计划生育分册)，1993，12(1)。[4]张海峰，李建忠，张春影.精浆抗精子抗体阳性不育患者顶体酶、一氧化氮合酶及超氧化物歧化酶活力变化的研究.中华男科学杂志，2006，12(4)：349-351。)

发明内容

为了解决已有技术存在的问题，本发明提供猪精液二层percoll密度梯度离心法。其原理是：市售的Percoll(Percoll是硅石胶态悬浮液的商品名)是经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone，PVP)处理的硅胶颗粒悬浊液，对活细胞无毒性无刺激，根据不同浓度的percoll具有不同的密度，在离心状态下，可将精液中的精液成分按密度不同进行分离。运用45％和90％两种不同浓度percoll分离精子稀释液，经离心后分出两层界面中均有精子，第二层界面中精子的活力高且杂质少。

本发明提供的猪精液二层percoll密度梯度离心法，步骤和条件如下：

I、Percoll的配制：市售Percoll为体积浓度100％，需要与1.5M精子洗涤液混合后达到生理性渗透压，然后用精子洗涤液稀释到所需浓度。

(1)比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll溶液的配制：取市售45mL Percoll，加入5mL精子洗涤液，混匀后，弃掉3.75mL，补入3.75mL的水，混匀后用0.22微米滤膜过滤备用；

(2)比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percolll溶液的配制：用等体积的体积浓度为90％percoll与精子洗涤液混匀，0.22微米滤膜过滤备用；

II、制备二层percoll密度梯度稀释液：取一只15mL的尖底离心管，先向其中加入2mL比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percoll溶液，再用加样枪插入试管底部缓慢注入2mL比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll溶液，两层之间形成一明显界面，注意避免剧烈震动破坏该界面；

III、如图1所示，将3mL精子稀释液沿管壁缓慢加入到步骤II制备二层percoll密度梯度液上，比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percoll与比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll和精子稀释液的体积配比为1∶1；1.5，其中，精子稀释液层在上面，比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percoll液层在中间，比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll液层在下面；

IV、如图2所示，400g×10min离心，离心后可看到试管内出现两个明显白色分界面层，其中，第一界面层在上面，第二界面层在下面；用加样枪将第二界面层的液体吸出，移到另一支含有5mL精子洗涤液的试管中混匀，300g×10min离心；

V、弃去上清，再向其中加入5mL的精子洗涤液，混匀后300g×10min离心，弃上清，用培养液重悬精子，调节精子至所需浓度。

有益效果：本发明提供的猪精液二层percoll密度梯度离心法，适用于正常的精液标本及精子密度低或精子活力低的精液标本，是一种简单、便捷的精子处理方法。该方法能除去精液中的白细胞、细菌、碎片及抗精子抗体；改善精液液化不良和精子体外获能等，使之能有效地与卵子受精，以提高妊娠率，获得的精子中有运动能力且形态正常的百分率为95％左右。

本发明的方法适用于猪鲜精及稀释后精液中活力精子的筛选，为猪精子获能机制及体外受精的研究提供高质量的精子。

附图说明

图1为制备的二层percoll密度梯度稀释液。

图2为加入精子后的二层percoll密度梯度稀释液。

图3为洗涤后的精子。

具体实施方式

实施例1本发明提供的猪精液二层percoll密度梯度离心法，步骤和条件如下：

I、Percoll的配制：市售Percoll为体积浓度100％，需要与1.5M精子洗涤液混合后达到生理性渗透压，然后用精子洗涤液稀释到所需浓度。

(1)比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll溶液的配制：取市售45mL Percoll，加入5mL精子洗涤液，混匀后，弃掉3.75mL，补入3.75mL的水，混匀后用0.22微米滤膜过滤备用；

(2)比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percolll溶液的配制：用等体积的体积浓度为90％percoll与精子洗涤液混匀，0.22微米滤膜过滤备用；

II、制备二层percoll密度梯度稀释液：取一只15mL的尖底离心管，先向其中加入2mL比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percoll溶液，再用加样枪插入试管底部缓慢注入2mL比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll溶液，两层之间形成一明显界面，注意避免剧烈震动破坏该界面；

III、如图1所示，将3mL精子稀释液沿管壁缓慢加入到步骤II制备二层percoll密度梯度液上，比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percoll与比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll和精子稀释液的体积配比为1∶1；1.5，其中，精子稀释液层在上面，比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percoll液层在中间，比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll液层在下面；

IV、如图2所示，400g×10min离心，离心后可看到试管内出现两个明显白色分界面层，其中，第一界面层在上面，第二界面层在下面；用加样枪将第二界面层的液体吸出，移到另一支含有5mL精子洗涤液的试管中混匀，300g×10min离心；

V、弃去上清，再向其中加入5mL的精子洗涤液，混匀后300g×10min离心，弃上清，用培养液重悬精子，调节精子至所需浓度。

Claims (1)

1.猪精液二层percoll密度梯度离心法，步骤和条件如下：

I、(1)比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll溶液的配制：取市售45mL Percoll，加入5mL精子洗涤液，混匀后，弃掉3.75mL，补入3.75mL的水，混匀后用0.22微米滤膜过滤备用；

(2)比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percolll溶液的配制：用等体积的体积浓度为90％percoll与精子洗涤液混匀，0.22微米滤膜过滤备用；

II、制备二层percoll密度梯度稀释液：取一只15mL的尖底离心管，先向其中加入2mL比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percoll溶液，再用加样枪插入试管底部缓慢注入2mL比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll溶液，两层之间形成一明显界面，注意避免剧烈震动破坏该界面；

III、将3mL精子稀释液沿管壁缓慢加入到步骤II制备二层percoll密度梯度液上，比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percoll与比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll和精子稀释液的体积配比为1∶1∶1.5，其中，精子稀释液层在上面，比重为1.066g/mL、体积浓度为45％的percoll液层在中间，比重为1.113g/mL、体积浓度为90％的percoll液层在下面；

IV、400g×10min离心，离心后可看到试管内出现两个明显白色分界面层，其中，第一界面层在上面，第二界面层在下面；用加样枪将第二界面层的液体吸出，移到另一支含有5mL精子洗涤液的试管中混匀，300g×10min离心；

V、弃去上清，再向其中加入5mL的精子洗涤液，混匀后300g×10min离心，弃上清，用培养液重悬精子，调节精子至所需浓度。

Images