CN104651224A - 一种双管真空薄膜精子分离法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双管真空薄膜精子分离法及装置，主要涉及细胞生物学领域。包括离心内管和离心管，所述离心内管的下部为尖端开口的锥体结构，所述离心内管的内部设置过滤装置，所述离心内管顶部的管口处设置内管密封盖。使用本装置对精液进行分离操作时，采用经典密度梯度精子分离法进行密度梯度溶液的准备，并将精子洗液及精子依次滴加在过滤装置上，经过低速离心处理后，取出离心内管使其与离心管分离，离心管的剩余物质即为部分α％密度梯度溶液以及底部的精子团。本发明的有益效果在于：无论精液是否液化，都能够通过简易操作，将精浆与精子彻底分离。避免了精液的预处理过程中对精子的伤害，成功率、回收率和精子质量俱佳。

Description

一种双管真空薄膜精子分离法及装置

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体是一种双管真空薄膜精子分离法及装置。

背景技术

精子分离处理技术是辅助生殖技术中必不可少的关键技术，实施辅助生殖技术时常用的精子分离技术主要包括密度梯度离心技术和上游分离法。这些技术均有各自的局限。密度梯度离心技术的精子回收率较高，但由于处理完成后，需用吸管移走上层杂质和低密度溶液，再用吸管通过高密度溶液液面吸取离心管底部精子，这样，上层杂质会部分粘附在离心管壁并顺流到高密度溶液的液面，进而粘附在吸管上混入底部分离出的活动精子中，因此这种操作会将部分已经分离的上层死精子及精浆杂质混入底部筛选精子，因而虽然回收率高，但回收精子活动率较上游法低，特别是由于此局限性，在一些需要将精浆和精子彻底分离的特殊情况(如某些精浆感染病毒或细菌)下就无法通过此方法将精浆中存在的有害物质彻底清除；上游法虽然可以避免精浆杂质污染精子的情况，但回收率普遍较低。故现有技术尚无法提供一种兼顾回收率及精子质量的分离方法。

另外，常规的精液处理分离技术需要精液必须在完全液化的状态下完成，而很多不育患者的精液不液化，对于不液化精液的处理方法一般为在精液内添加培养液或蛋白酶，然后进行吹打，待精液液化后再进行精子的分离。以上操作均会对精子造成损伤。在畜牧业猪人工授精精液处理过程中，常规使用纱布和滤纸自然过滤精液以去除精液中的胶状物质。实践中我们发现将人的不液化精液在经过滤纸并离心可得到液化精液，而精液依靠其自然过滤难以通过滤纸，回收率较低，影响精液的分离处理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双管真空薄膜精子分离法及装置，它无论精液是否液化，都能够通过简易操作，将精浆与精子彻底分离。在精液的预处理过程中不用对精液进行添加酶类和吹打的预处理，避免了对精子的伤害，在精子的分离过程中也无需借用其他设备仪器，避免了除杂不彻底的问题，成功率、回收率和精子质量俱佳。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种精子分离装置，包括离心内管和离心管，所述离心内管置于离心管内，所述离心内管的下部为尖端开口的锥体结构，所述离心内管的内部设置过滤装置，所述过滤装置位于离心内管的管内中部，并包括有滤纸支架、滤纸和滤纸压环，所述滤纸支架为网孔结构，所述滤纸为若干层且设置于滤纸支架上，所述滤纸为孔径30～50微米的中速定性滤纸，所述滤压环设置在滤纸上，所述离心内管顶部的管口处设置内管密封盖。

所述离心内管的顶端与内管密封盖的连接处均设置相对应的螺纹，所述内管密封盖内设置密封胶垫。

所述离心内管的外侧裹套有胶皮垫圈。

所述离心管的规格是10-15ml的离心管。

利用权利要求1～4任一项所述一种精子分离装置实施的一种双管真空薄膜精子分离法，包括以下步骤：

(a)用精子洗液将密度梯度溶液稀释配成α％和β％两种密度梯度溶液，所述α的数值大于β的数值，将等量的α％和β％两种密度梯度溶液分层置于离心管底部，并使所述α％密度梯度溶液位于β％密度梯度溶液的下方且两者之间界面清晰；

(b)将所述离心内管插入由步骤(a)备好的离心管底部，确保不破坏密度梯度溶液界面的清晰，并使所述离心内管与离心管的相对位置固定；

(c)将精子洗液滴入离心内管使过滤装置湿润；

(d)将精液滴加在离心内管的过滤装置上；

(e)闭合内管密封盖将离心内管的管口密封；

(f)将离心管及离心内管进行低速离心处理后，取出离心内管使其与离心管分离，离心管的剩余物质即为部分α％密度梯度溶液以及底部的精子团；

(g)离心管(2)剩余物质经精子洗液混匀低速离心洗涤后即为分离的活动精子。

所述α％的数值为90％，所述β％的数值为45％。

所述步骤(a)中，α％和β％两种密度梯度溶液的用量均为0.8-1.5ml，所述步骤(c)中精子洗液的用量为0.1-0.3ml。

所述步骤(f)中的低速离心操作为，将离心管及离心内管进行2500rpm离心10-15min。

所述步骤(g)中的精子洗液用量为3-6ml，低速离心操作为，将离心管进行2500rpm离心5-10min。

将步骤(a)中的精子洗液和密度梯度溶液在进行操作前放置于37℃条件下，步骤(d)中的精液取出后在37℃温度下放置10min再进行滴加操作。

对比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、通过所述离心内管内的过滤装置，结合进行一定转速的离心操作，使滴于过滤装置上的精液，无论液化与否，均能够通过过滤装置，达到液化效果，从而无需向精液中添加培养液或蛋白酶，亦无需对精液进行吹打操作，避免了对精子的损伤，使精子收率大大提高，有利于进行后续的精液分离处理。

2、通过将所述离心内管插入装有两种密度梯度溶液的离心管底部，使离心内管底端的开口被密度梯度溶液密封，结合所述内管密封盖，使所述离心内管的管内形成密闭的空间。由于低速离心处理使得所述过滤装置上的精子洗液及精液滤过过滤装置融入底部的密度梯度溶液，从而使离心内管内产生一定的负压，并且通过离心沉降分层使得精液中的杂质、有害物质等溶于离心内管内的β％密度梯度溶液，当离心处理结束，将所述离心内管自离心管内取出时，所述离心内管内的负压能够将离心内管里的β％密度梯度溶液和部分α％密度梯度溶液一同吸出，离心内管里的部分α％密度梯度溶液以及底部的精子团则落到离心管底部。这样一来精液中的杂质和有害物质也被一并去除，从而达到分离精子的目的。本方法和装置不但保留了传统密度梯度离心法的高回收率，并且保证了回收精子的质量。与传统的密度梯度离心法不同的是，由于其组分的分离依靠离心内管自身的负压，故避免了使用吸管抽吸分离精子的过程中将上层杂质带入已分离精子的缺陷，使精浆物质彻底与精子分离。

3、所述离心内管顶端的内管密封盖，能够保证离心内管的密封，为产生负压提供前提条件；所述离心内管内设置的过滤装置，结合低速离心操作，可使精液的过滤液化和离心内管的负压生成同步完成，即能够使精液充分液化，保证了下一步分离操作的进行，又能为下一步的分离操作提供负压吸力，且过程紧凑高效，避免了人工过滤的染菌问题，提高成功率；所述离心内管下部为椎体设计，使分离出的精子团能够集中于离心内管底部中心；所述离心内管底端的开口设计，使分理出的精子团在离心内管与离心管分离时能够通过开口留在离心管底部。通过以上设计和效果，能够辅助完成将精液的液化和精子的分离，提高成功率、回收率和回收质量。

4、所述离心内管的顶端与内管密封盖的螺纹，能够使二者的连接更加紧固，所述密封胶垫的设置，进一步保证离心内管的密封性。

5、所述胶皮垫圈紧密缠绕在离心内管的外壁上且高低可调，当离心内管插入离心管并到达离心管底部后，通过调整所述胶皮垫圈在离心内管上的位置，使胶皮垫圈担托于离心管管壁顶端，从而使离心内管与离心管的相对位置固定，还能对离心管起一定的密封作用。

6、所述α％的数值为90％，所述β％的数值为45％，使两个密度梯度溶液的密度相差显著，有助于精子的分离。

7、两种0.8-1.5ml的密度梯度溶液，0.1-0.3ml的精子洗液，配合使用10-15ml的离心管进行实验操作，分离效果较好。

8、对所述离心管、离心内管进行2500rpm离心10-15min，即可使所处理的精液液化充分，并使精液组分分层沉降，使精子团沉淀到离心内管底端的尖部。

9、用3-6ml精子洗液与离心管剩余物质混匀后进行2500rpm离心5-10min，可将多余α％的密度梯度溶液去除，剩余所需分离的活动精子，可用于人工授精或其他研究。

10、将刚取出的精液在37℃温度下放置10min，有利于精液的液化并保持精子活力；将所需试剂在37℃条件下放置，有利于精子活性的保持。

附图说明

附图1是本发明离心内管使用状态下的结构示意图。

附图2是本发明过滤装置各组件的示意图。

附图中所示标号：

1、离心内管；2、离心管；3、过滤装置；4、滤纸支架；5、滤纸；6、滤纸压环；7、内管密封盖；8、螺纹；9、密封胶垫；10、胶皮垫圈。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：本发明所述一种精子分离装置，主体结构包括离心内管1和离心管2。所述离心管2采用规格为15ml的离心管2，所述离心内管1置于离心管2内。所述离心内管1的中上部为圆筒状结构，且其管壁厚度0.5mm、外径13mm、长度95mm。使其能够与15ml规格的离心管2相配合。所述离心内管1的下部为尖端开口的圆锥体结构，使分离出的精子团能够集中于离心内管1底部中心，且分离出的精子团在离心内管1与离心管2分离时能够通过开口留在离心管2底部。且下部圆锥体的底部直径13mm、尖部直径3mm，锥高15mm。所述离心内管1的内部设置过滤装置3，结合低速离心操作，可使精液的过滤液化和离心内管1的负压生成同步完成，即能够使精液充分液化，保证了下一步分离操作的进行，又能为下一步的分离操作提供负压吸力，且过程紧凑高效，避免了人工过滤的染菌问题，提高成功率；所述离心内管1管内据管口50mm/8ml刻度处设置一圈凸起形成凸台，用以将过滤装置3托起固定，使过滤装置3位于离心内管1的中部。所述过滤装置3包括有滤纸支架4、滤纸5和滤纸压环6。所述滤纸支架4为形状与离心内管1的管内横截面相对应的网孔结构，易于精子的通过，且由环形网架和网丝构成。所述环形网架的外圆直径与离心内管1的内径相同，所述环形网架紧密贴附离心内管1内壁，并由离心内管1内壁的凸台托起固定，所述环形网架的环粗为1mm。所述网丝纵横各位三条且与环形网架的内侧环面固定连接，所述网丝的为直径0.5mm的圆柱状网丝。所述滤纸支架4上设置两层滤纸5，所述滤纸5为孔径30～50微米的中速定性滤纸5。所述滤纸5上设置滤纸压环6。所述滤纸压环6为外圆直径12.5mm，且环粗为2mm的圆环，能够将所述滤纸5压牢固定于滤纸支架4上。所述离心内管管体的顶部设置内管密封盖7。能够保证离心内管1的密封，使其在低速离心操作后能够产生负压。所述离心内管1的顶端与内管密封盖7的连接处均设置相对应的螺纹8，能够使二者的连接更加紧固，所述内管密封盖7内设置密封胶垫9，进一步保证离心内管1的密封性。所述离心内管1的外侧套接有胶皮垫圈10，所述胶皮垫圈10紧密贴附于离心内管1的外壁上且能够调整与离心内管1的相对高度。当离心内管1插入离心管2并靠近离心管2底部后，通过调整所述胶皮垫圈10在离心内管1上的位置，使胶皮垫圈10担托于离心管2管壁顶端，从而使离心内管1与离心管2的相对位置固定。所述离心内管1、滤纸支架4、滤纸压环6均由医用聚丙烯制成。医用聚丙烯具有比重小、造价低、耐高温、易加工、透明度高、表面光滑、卫生等优点。

利用上述一种精子分离装置实施的一种双管真空薄膜精子分离法，具体操作步骤如下：

(1)实验采用Vitrolife瑞典公司的产品：SpermGrad精子梯度分离液(用于精子梯度分离，是碳酸氢盐和HEPES缓冲系统，硅烷包被的胶质二氧化硅颗粒，)和SpermRinse精子洗液(是HEPES缓冲培养液，包含用于保证精子活力的糖类和抗生素。用于洗精、上游、稀释SpermGrad，)，处理精子前将精子洗液SpermRinse和密度梯度溶液SpermGrad放置37℃。用精子洗液将密度梯度溶液稀释配成90％和45％两种密度梯度溶液，用5ml巴士德吸管吸取45％密度梯度溶液2.0毫升置于15毫升(内径1.5厘米)离心管2底部，再吸取90％密度梯度溶液2.0毫升，小心将吸管插入15ml离心管2底部，缓慢将90％密度梯度溶液加到离心管2底部，45％密度梯度溶液会浮在上层，保证两者之间的界面清晰。(此步骤为经典密度梯度分离精子方法中密度梯度溶液准备过程)。

(2)将离心内管1缓慢插入上述盛有密度梯度离心溶液的15ml离心管2中至底部5mm处，为精子的落出提供一定空间，故离心内管1底端的开口被密度梯度溶液密封，此操作需缓慢轻柔，保证不破坏密度梯度溶液的界面。调整离心内管1外侧的胶皮垫圈10，使其撑在离心外管上。

(3)滴加0.2ml精子洗液至离心内管1使离心内管1内的滤纸5湿润。

(4)将刚取出的精液在37℃温度下放置10分钟，液化精液或不液化精液均可采用此方法分离处理。将精液缓缓滴加在离心内管1的过滤装置3的滤膜上，注意不要接触到滤纸5以免戳破。

(5)旋紧离心内管1上的密封盖保证离心内管1管内的密封。

(6)将插有离心内管1的离心管2进行2500rpm离心10min。离心处理使精液无论液化与否均可通过过滤装置3实现液化，并融于离心内管1底部的密度梯度溶液，从而使离心内管1内产生一定的负压，并且由于离心沉降分层使得精液中的杂质、有害物质等溶于离心内管1内的45％密度梯度溶液。轻轻取出离心内管1，将所述离心内管1自离心管2内取出时，所述离心内管1内的负压能够将离心内管1里的45％密度梯度溶液和部分90％密度梯度溶液一同吸出，离心内管1里的部分90％密度梯度溶液以及底部的精子团则落到离心管2底部。这样一来精液中的杂质和有害物质也被一并去除，所有的除活动精子外的上层所有细胞、颗粒均分离出去，从而达到分离精子的目的。与传统的密度离心法不同的是不会因吸管抽吸分离精子的过程带入部分的上层杂质进入已分离的精子内，使精浆物质彻底与精子分离。

(7)将所述离心管2内的剩余物质使用6ml精子洗液混匀后，进行2500rpm离心10min，可将多余90％的密度梯度溶液去除，剩余所需分离的活动精子，可用于人工授精或其他研究。

所有步骤使用器材、精子洗液、密度梯度溶液均为无菌一次性使用耗材、试剂。

通过应用本发明装置离心内管1进行如上操作，可以将精液的液化和精子的分离同步进行，无论精液液化与否，均可直接进行试验操作，而无需进行添加培养液、蛋白酶及进行吹打等对精子有所损害的操作环节，使精子的收率大大提高。且离心内管1自身产生负压吸取代替了传统离心处理后的手动吸取，在保留传统密度梯度离心法的高回收率的同时，使精浆物质彻底与精子分离，保证了分理处的精子的质量。

实施例2：本发明所述一种精子分离装置，主体结构包括离心内管1和离心管2。所述离心管2采用规格为10ml的离心管2，所述离心内管1置于离心管2内。所述离心内管1的中上部为直径上大下小的圆筒状结构，且其外径13mm、上端内径12mm、下端内径11mm、长度100mm。使其能够与10ml规格的离心管2相配合。所述离心内管1的下部为尖端开口的圆锥体结构，使分离出的精子团能够集中于离心内管1底部中心，且分理出的精子团在离心内管1与离心管2分离时能够通过开口留在离心管2底部，且下部圆锥体的底部直径13mm、尖部直径3mm，锥高15mm。所述离心内管1的内部设置过滤装置3，结合低速离心操作，可使精液的过滤液化和离心内管1的负压生成同步完成，即能够使精液充分液化，保证了下一步分离操作的进行，又能为下一步的分离操作提供负压吸力，且过程紧凑高效，避免了人工过滤的染菌问题，提高成功率；所述过滤装置3包括有滤纸支架4、滤纸5和滤纸压环6。所述滤纸支架4为形状与离心内管1的管内横截面相对应的网孔结构，易于精子的通过，且由环形网架和网丝构成。所述环形网架的外圆半径为11.5mm，正好卡固与离心内管1管内的中央，所述环形网架的环粗为0.8mm。所述网丝纵横各位2条且与环形网架的内侧环面固定连接，所述网丝的为直径0.2mm的圆柱状网丝。所述滤纸支架4上设置若三层滤纸5，所述滤纸5为孔径30～50微米的中速定性滤纸5。所述滤纸5上设置滤纸压环6。所述滤纸压环6为外圆直径11.5mm，且环粗为2mm的圆环，所述滤纸支架4、滤纸5和滤纸压环6依次粘接。所述离心内管管体的顶部设置内管密封盖7。能够保证离心内管1的密封，使其在低速离心操作后能够产生负压。所述离心内管1的顶端与内管密封盖7的连接处均设置相对应的螺纹8，能够使二者的连接更加紧固，所述内管密封盖7内设置密封胶垫9，进一步保证离心内管1的密封性。所述离心内管1的外侧套接有胶皮垫圈10，所述胶皮垫圈10紧密贴附于离心内管1的外壁上且能够调整与离心内管1的相对高度。当离心内管1插入离心管2并靠近离心管2底部后，通过调整所述胶皮垫圈10在离心内管1上的位置，使胶皮垫圈10担托于离心管2管壁顶端，从而使离心内管1与离心管2的相对位置固定。所述离心内管1、滤纸支架4、滤纸压环6均由医用聚丙烯制成。医用聚丙烯具有比重小、造价低、耐高温、易加工、透明度高、表面光滑、卫生等优点。

利用上述一种精子分离装置实施的一种双管真空薄膜精子分离法，具体操作步骤如下：

(1)实验采用Vitrolife瑞典公司的产品：SpermGrad精子梯度分离液(用于精子梯度分离，是碳酸氢盐和HEPES缓冲系统，硅烷包被的胶质二氧化硅颗粒，)和SpermRinse精子洗液(是HEPES缓冲培养液，包含用于保证精子活力的糖类和抗生素。用于洗精、上游、稀释SpermGrad，)，处理精子前将精子洗液SpermRinse和密度梯度溶液SpermGrad放置37℃。用精子洗液将密度梯度溶液稀释配成92％和46％两种密度梯度溶液，用5ml巴士德吸管吸取46％密度梯度溶液1.5毫升置于10ml离心管2底部，再吸取92％密度梯度溶液1.5毫升，小心将吸管插入10ml离心管2底部，缓慢将92％密度梯度溶液加到离心管2底部，46％密度梯度溶液会浮在上层，保证两者之间的界面清晰。(此步骤为经典密度梯度分离精子方法中密度梯度溶液准备过程)。

(2)将离心内管1缓慢插入上述盛有密度梯度离心溶液的10ml离心管2中至距底部3mm处，使离心内管1的底端与离心管2底部内壁有微小距离，此操作需缓慢轻柔，保证不破坏密度梯度溶液的界面。调整离心内管1外侧的胶皮垫圈10，使其撑在离心外管上。

(3)滴加0.3ml精子洗液至离心内管1使离心内管1内的滤纸5湿润。

(4)将刚取出的精液在37℃温度下放置15分钟，液化精液或不液化精液均可采用此方法分离处理。将精液缓缓滴加在离心内管1的过滤装置3的滤膜上，注意不要接触到滤纸5以免戳破。

(5)旋紧离心内管1上的密封盖保证离心内管1管内的密封。

(6)将插有离心内管1的离心管2进行2500rpm离心15min。离心处理使精液无论液化与否均可通过过滤装置3实现液化，并融于离心内管1底部的密度梯度溶液，从而使离心内管1内产生一定的负压，并且由于离心沉降分层使得精液中的杂质、有害物质等溶于离心内管1内的46％密度梯度溶液。轻轻取出离心内管1，将所述离心内管1自离心管2内取出时，所述离心内管1内的负压能够将离心内管1里的46％密度梯度溶液和部分92％密度梯度溶液一同吸出，离心内管1里的部分92％密度梯度溶液以及底部的精子团则落到离心管2底部。这样一来精液中的杂质和有害物质也被一并去除，所有的除活动精子外的上层所有细胞、颗粒均分离出去，从而达到分离精子的目的。与传统的密度离心法不同的是不会因吸管抽吸分离精子的过程带入部分的上层杂质进入已分离的精子内，使精浆物质彻底与精子分离。

(7)将所述离心管2内的剩余物质使用4ml精子洗液混匀后，进行2500rpm离心6min，可将多余92％的密度梯度溶液去除，剩余所需分离的活动精子，可用于人工授精或其他研究。

所有步骤使用器材、精子洗液、密度梯度溶液均为无菌一次性使用耗材、试剂。

通过应用本发明装置离心内管1进行如上操作，可以将精液的液化和精子的分离同步进行，无论精液液化与否，均可直接进行试验操作，而无需进行添加培养液、蛋白酶及进行吹打等对精子有所损害的操作环节，使精子的收率大大提高。且离心内管1自身产生负压吸取代替了传统离心处理后的手动吸取，在保留传统密度梯度离心法的高回收率的同时，使精浆物质彻底与精子分离，保证了分理处的精子的质量。

Claims (10)

1.一种精子分离装置，其特征在于：包括离心内管(1)和离心管(2)，所述离心内管(1)置于离心管(2)内，所述离心内管(1)的下部为尖端开口的锥体结构，所述离心内管(1)的内部设置过滤装置(3)，所述过滤装置(3)位于离心内管(1)的管内中部，并包括有滤纸支架(4)、滤纸(5)和滤纸压环(6)，所述滤纸支架(4)为网孔结构，所述滤纸(5)为若干层且设置于滤纸支架(4)上，所述滤纸(5)为孔径30～50微米的中速定性滤纸，所述滤压环(6)设置在滤纸(5)上，所述离心内管顶部的管口处设置内管密封盖(7)。

2.根据权利要求1所述精子分离装置，其特征在于：所述离心内管(1)的顶端与内管密封盖(7)的连接处均设置相对应的螺纹(8)，所述内管密封盖(7)内设置密封胶垫(9)。

3.根据权利要求1所述精子分离装置，其特征在于：所述离心内管(1)的外侧裹套有胶皮垫圈(10)。

4.根据权利要求1所述精子分离装置，其特征在于：所述离心管(2)的规格是10-15ml的离心管(2)。

5.利用权利要求1～4中任一项所述一种精子分离装置实施的一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于：包括以下步骤：

(a)用精子洗液将密度梯度溶液稀释配成α％和β％两种密度梯度溶液，所述α的数值大于β的数值，将等量的α％和β％两种密度梯度溶液分层置于离心管(2)底部，并使所述α％密度梯度溶液位于β％密度梯度溶液的下方且两者之间界面清晰；

(b)将所述离心内管(1)插入由步骤(a)备好的离心管(2)底部，确保不破坏密度梯度溶液界面的清晰，并使所述离心内管(1)与离心管(2)的相对位置固定；

(c)将精子洗液滴入离心内管(1)使过滤装置(3)湿润；

(d)将精液滴加在离心内管(1)的过滤装置(3)上；

(e)闭合内管密封盖(7)将离心内管(1)的管口密封；

(f)将离心管(2)及离心内管(1)进行低速离心处理后，取出离心内管(1)使其与离心管(2)分离，离心管(2)的剩余物质即为部分α％密度梯度溶液以及底部的精子团；

(g)离心管(2)剩余物质经精子洗液混匀低速离心洗涤后即为分离的活动精子。

6.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于：所述α％的数值为90％，所述β％的数值为45％。

7.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于：所述步骤(a)中，α％和β％两种密度梯度溶液的用量均为0.8-1.5ml，所述步骤(c)中精子洗液的用量为0.1-0.3ml。

8.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于：所述步骤(f)中的低速离心操作为，将离心管(2)及离心内管(1)进行2500rpm离心10-15min。

9.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于：所述步骤(g)中的精子洗液用量为3-6ml，低速离心操作为将离心管进行2500rpm离心5-10min。

10.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于：将步骤(a)中的精子洗液和密度梯度溶液在进行操作前放置于37℃条件下，步骤(d)中的精液取出后在37℃温度下放置10min再进行滴加操作。