CN104990780A - 一种制作细胞块的专用离心管和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种制作细胞块的专用离心管和方法，专用离心管由两端开口的圆柱形离心管和两个离心管盖构成。离心管的两端表层管壁上设有外螺纹；离心管盖为平底盖，盖底部带有密封圈（垫），内侧壁上设有内螺纹，能够与离心管外螺纹拧紧咬合，形成密闭的圆柱形空间。制作细胞块时，将装有基质的离心管加热，待基质液化后，将细胞（团）悬液加到基质层上表面，颠倒混合以后离心或直接离心，使细胞通过基质（垫）富集到基质底层的一个平面上。基质凝固以后，拧下离心管两端的离心管盖，用活塞或气体加压原理推出含细胞层的基质端，切下制成细胞块。该方法能够简便、高效地将微量细胞标本制备成完整、规则、细胞分布面大而细胞密度高的细胞块。

Description

一种制作细胞块的专用离心管和方法

技术领域

本发明属于细胞病理学领域，具体涉及一种从细胞病理学和外科病理学标本中制作细胞块的专用离心管和制作方法。

背景技术

细胞病理学通过分析细胞或者小的细胞团诊断多种疾病和评估健康状况。

最常用的细胞病理学技术是细胞涂片（pap smear）。细胞涂片是将细胞或小的细胞团涂布于玻片上，用诊断试剂染色后，在显微镜下观察细胞形态从而对多种疾病做出诊断或者评估健康状况。细胞涂片方法有明显的局限性，主要表现在：细胞涂片不能复制，一旦细胞涂片用一种诊断试剂染色以后，难以同时再进行另外的染色和检测；难以进行免疫组化和分子病理等检测；血液、蛋白沉淀物、粘液干扰以及细胞堆积等因素使细胞的形态和结构不清楚；细胞在制片过程中因受力扭曲变形难于判读；不能长期保存等。

细胞蜡块（cell block）是将检测细胞经过脱水、石蜡包埋等程序后制作而成。细胞蜡块经切割制作成细胞切片，进一步染色后对细胞进行检测。与细胞涂片相比，细胞蜡块有许多优点：细胞不变形，结构清楚，易于观察判读；能够像活检组织切片那样清楚观察细胞的排列，因此，也被称作微活检；细胞块能够切出多张细胞或小细胞团的切片进行分析；易于进行特殊染色、免疫细胞化学染色以及分子病理检测等；能够长期保存，供进一步诊断和研究用。

有许多种方法制作细胞蜡块，传统的方法是用普通的离心管离心沉淀以后，倾倒去上清液，然后取出沉渣，再用常规病理技术方法制作成细胞蜡块。也有一些方法对传统方法进行改进。但这些现有的方法都有不同的缺陷，其中最明显的缺陷是：不适于在细胞或细胞团数量少的情况下制备细胞块，因此，临床上的有一部分标本因细胞数量少而无法制作成细胞蜡块，不能对患者做出明确诊断；另外，目的细胞（病变细胞）在细胞蜡块中的位置分散而不确定，切片时难以切割到病变细胞，或者细胞在切片上的分布面小，密度低；蜡块大小、形状不规则等。

发明内容

本发明提供了一种制作细胞块的专用离心管和制作方法。

一种制作细胞块的专用离心管，由离心管和两个离心管盖构成。离心管是两端开口，圆柱形中空管，离心管两端的外表层带有外螺纹。离心管盖是密封型盖，平底（细胞分布在一个平面上的结构基础），底部有密封圈（垫），内侧壁表层设有内螺纹，能够与离心管两端外螺纹拧紧咬合，防止液体渗出，形成密闭的圆柱形空间。设计成一组内外径不相同的离心管，离心管内径从1~15mm，外径一般在不超过20mm范围内变化；可以根据需要设计成不同长度，通常60~80mm比较合适。管壁厚度1~2mm。不同规格离心管能够满足不同细胞数量制作细胞块的需要，内径2~5mm的离心管特别适用于临床微量细胞标本或者分离、培养获得的微量细胞制作细胞块。管壁厚度可以根据需要增加，以达到增强保温效果的目的，能够使基质较长时间在室温中保持液态。大离心管和小离心管能够套叠在一起，在操作和离心时，大离心管作为小离心管的支架，能够使小离心管保持直立。离心管由玻璃或透明塑料制成，瓶盖由透明塑料制成，便于对离心后细胞所处位置和基质情况进行观察。

与该专用离心管配合使用的是细胞基质材料，许多种物质可以作为细胞基质，其中在分子生物学中常用的低熔点琼脂糖能够作为该方法有效的细胞基质。选用熔点高于石蜡的熔点、凝胶温度接近室温的低熔点琼脂糖。这样，在将细胞块制作成细胞蜡块的过程中，即在脱水、透明、浸蜡、包埋等过程中细胞块不会熔化；凝胶温度接近室温，熔化基质余热能够使基质在室温中长时间处于液态，离心才够有效将细胞富集到一个平面上。低熔点琼脂糖的熔点温度在60~70℃，凝胶温度在15~35°最为合适。过高的凝胶温度，则需要在离心过程中使用加热或保温措施，防止液态基质凝固成固态，使方法变得复杂。

用专用离心管和基质材料能够方便地制作细胞块。现在以低熔点琼脂糖作为细胞基质材料为例子加以说明。将低熔点琼脂糖用pH=7.4的磷酸盐缓冲液配制成1%的琼脂糖（常用的浓度为1%~3%），加热完全溶解后，取内径为5mm的离心管，直立在桌面或者离心管架上，拧下上端的离心管盖，将基质分装到离心管中，每管1mL，拧上离心管盖。装有基质的离心管可以在4°冰箱中长期保存备用。基质的使用量是根据细胞数量多少和选择的离心管规格确定，细胞数量多时应该适当增加细胞基质材料的使用量。

制作细胞块时，将带基质材料的离心管放入烤片机中，温度调至高于基质的熔点温度（如70℃）以上，加热20分钟以上，使固态的基质变成液态。室温较低时，应该增加熔化基质的温度（如80℃），以便在室温中基质有较长的时间不会凝固，能够从容操作和离心。

为了在切片时观察细胞所处位置，标记细胞也是重要的步骤。用一滴伊红将细胞或组织碎屑（来自外科标本）标记上颜色。拧下上端的离心管盖，将细胞悬液约0.5mL加入液态基质上表面上，拧上离心管盖，颠倒离心管混均；或者不混均，直接离心。立即用水平离心机1000-2000rpm离心2~5分钟，将细胞富集到基质最底层的一个平面上。另外的方法还包括，将细胞悬液加到离心管固态基质的上面，将离心管垂直放入烤片机中，70℃以上温度加热20分钟，使基质变成液态，离心使细胞通过胶垫（层）后，富集到胶的最底层的平面上。同时细胞能够与蛋白质沉淀物、粘液等分离。取出离心管，垂直放于4℃冰箱中15min以上，使基质重新凝固变成固态。

取出细胞块方法也是本项发明的关键步骤。待基质凝固以后，拧下离心管两端的离心管盖，如果离心管内径≤5mm时，用气体加压原理推出带有细胞层的基质端，使用实验室中的洗耳球能够方便地完成操作。离心管内径>5mm时用活塞原理推出带有细胞层的基质端。用刀片切下带有细胞层部分的固体基质，通常的厚度为2~3mm,即制作成高质量的细胞块。细胞块通过常规的病理技术方法制作成细胞蜡块，再制作细胞切片。也可以通过冰冻切片方法直接制作成细胞切片。

该制作细胞块的方法应用范围广泛，适用于所有临床细胞学标本、部分外科方法获得的少量组织碎屑（不能够用常规方法制作组织切片）、培养的细胞、实验中分离获得的极少量细胞等。

与现有技术方法相比，本发明有以下有益技术效果：

使用专用离心管和基质材料，能够高效地将少量细胞、组织碎屑富集到一个基质的一个平面上。对于其它方法因细胞数量少无法制作成细胞蜡块的样本，能够成功制作成细胞块。细胞分布有序，核质比高的细胞（细胞病理学中通常是病变细胞）分布在最下层，制作切片时首先被切割下来制作成细胞切片。用该方法制作的切片可观察的细胞分布面积大，细胞丰富，观察到病变细胞的概率增加，提高诊断阳性率。通过基质的分离作用，细胞能够与非细胞成分如蛋白沉淀、粘液等分离。

使用1-3mm内径的离心管，能够将临床或者实验过程中分离的极少数细胞制作成细胞块，通过连续切片方法，可以将单个细胞切割到不同切片上，对单个细胞进行分析和研究。

使用本使用新型，能搞方便完整地将细胞块从离心管中取出、切下，细胞块形状规则，细胞分布位置确定，有利于细胞病理学质量控制和标准化操作。

本发明方法简单、价格便宜，能够商业化推广应用。

附图说明

图1为本发明的离心管的结构示意图。

图2为本发明的离心管纵切面示意图。

图3为离心管套叠在一起后的纵切面示意图。

图4为将细胞悬液滴加到基质材料上的纵切面示意图。

图5为通过离心将细胞富集到一个平面上的纵切面示意图。

图6为带有细胞层的基质凝固后取出并切下细胞块的纵切面示意图。

具体实施方式

下面结合实例和附图来详细说明本发明，本发明并不仅限于此。

如图1所示，一种用于制备细胞块的专用离心管，由离心管①和离心管盖②、③构成。

离心管①两端开口，为圆柱形中空管，两端的外表层带有外螺纹（图中未标示出外螺纹）。离心管盖②和③为平底，盖底部带有密封圈（垫）（图中未标示出密封圈），内侧壁表层有内螺纹（图中未标示出内螺纹）的密闭型盖。平底是细胞能够分布在一个平面上的结构基础。离心管盖②、③能够与离心管①两端的外螺纹拧紧咬合，防止液体渗出，形成密闭的圆柱形空间。

如图2所示，将离心管盖拧紧到离心管两端上以后，形成一个密闭的圆柱形空间。

如图3所示，在使用离心管直径小于5mm时，为了能够使离心管②在离心和操作过程中保持直立，可以将直径小的离心管②放入直径大的离心管①中，套叠在一起，大离心管作为小离心管的离心支架。直立是离心管在操作和离心过程中需要保持的状态。

如图4所示，预先将基质②分装到离心管中，制作细胞块时，将带有基质②的离心管放到温度高于基质熔点温度的烤片机中，使基质②熔化变成液态。拧下上端的离心管盖，将细胞混悬液①加到基质②上方，拧上（紧）离心管盖，将细胞混悬液①和液态基质②颠倒混合后离心或者直接离心。另外的方法是直接将细胞混悬液①加到固态基质②上面，加热熔化基质以后，直接离心或混合以后离心富集细胞。有的细胞上的分子对热敏感，温度升高容易使分子破坏，无法检测，此时可以将基质加热熔化以后保持在37℃，同时将细胞悬液也加热到37℃后，再进行上述操作。

如图5所示，离心以后，细胞在离心力的作用下，被富集到基质②下层的平面上，形成纽扣样细胞层①。细胞少时，可能只是形成薄层的细胞膜①。

如图6所示，将图5的离心管直立放入4℃冰箱中15分钟，待基质材料凝固以后，拧下两端的离心管盖，使用洗耳球加压气体的原理将带有细胞层①的基质端推出离心管（图6中未标示出洗耳球加压气体的方法）。当离心管内径>5mm时，用活塞③原理推出带有细胞层①的基质端，如使用棉签即可完成操作。用刀片切下带有细胞层①的基质材料（厚度2-3mm）,即制成有固定形状，细胞分布在一个面上的细胞块。细胞块经过常规病理技术方法处理以后制成细胞蜡块。

Claims (6)

1.一种制作细胞块的专用离心管和方法，包括：                                                制作细胞块的专用离心管；制作细胞块所需的基质材料；分离富集细胞的方法；取出细胞块的方法。

2.如权利要求1所述的制作细胞块的专用离心管，其特征为由离心管和两个离心管盖构成，离心管为两端开口的圆柱形中空管，两端的外表层带有外螺纹；离心管盖为平底，内侧壁表层带有内螺纹，能够与离心管外螺纹拧紧咬合，形成圆柱形密闭空间。

3.如权利要求1所述的制作细胞块的专用离心管，其特征为内径和外径不相同的一组离心管，内径为1~15mm, 外径≤20mm，长度通常为60~80mm，规格小的离心管能够放入规格大的离心管中套叠在一起。

4.如权利要求1所述的基质材料，其特征为一类低熔点琼脂糖，熔点温度60~70℃，凝胶温度15~35℃。

5.如权利要求1所述分离富集细胞的方法，其特征为以液态基质材料作为分离介质，用离心力使细胞(团)通过基质有序富集在基质的一个平面上形成细胞层（膜）。

6.如权利要求1所述取出细胞块的方法，其特征为拧下离心管两端的离心管盖，用气体加压或者活塞加压原理推出含有细胞层的基质端。