CN104988120B - 一种pH值稳定的淋巴细胞培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种pH值稳定的培养基。该培养基由1640基础培养基、100mg/L植物血球凝集素(PHA)、体积百分比为20％的小牛血清和5‑50mM甘油磷酸钠/4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)双缓冲系统组成。所述甘油磷酸钠/HEPES双缓冲系统由磷酸缓冲液、甘油磷酸钠、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)组成，所述磷酸缓冲液含Na2HPO4和KH2PO4。本发明还提供上述培养基的制备方法和在淋巴细胞培养中的应用。本发明的培养基的pH值不受环境中气体成分的影响，又能够稳定淋巴细胞培养时的pH值；利于培养基的长期保存。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种pH值稳定的淋巴细胞培养基及其制备方法和应用。
背景技术
遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。遗传病涉及的学科很多，包括妇产科学－不孕不育、优生优育、内分泌紊乱；血液病学－慢性粒细胞性白血病，急性粒细胞性白血病，骨髓增生异常综合征，急性淋巴细胞性白血病等；儿科学－出生缺陷；肿瘤学；内科学－放射病、染色体断裂综合征等，具有先天性、终生性和家族性、病种多、发病率高等特点。临床常见的高血压、糖尿病、哮喘、癌症、忧郁症、老年痴呆等与遗传有关。
目前，对于遗传病的诊断主要采用的还是细胞遗传学的方法，即染色体核型分析。染色体核型分析是根据染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体的有无等特征，并借助染色体分带技术对某一生物的染色体进行分析，比较，排序，编号，是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、型态与功能之间的关系所不可缺少的重要手段。染色体核型分析也是临床上广泛开展的对遗传病进行诊断的一种基本方法，经核型分析后，可以根据染色体结构和数目的变异来判断生物的病因，比如是由于缺少了什么样的基因才导致的这种疾病。因此染色体核型分析在遗传病的诊断和筛查上具有重要意义。
染色体核型分析的原理和基本过程：利用PHA(植物血凝素)刺激成熟的淋巴细胞再次分裂；利用秋水仙素在细胞分裂中期破坏纺锤丝，抑制细胞分裂，形成染色体的形态；通过胰酶消化或缓冲液作用，将染色体显带，通过带纹和数目的分析判断染色体数目和结构的情况。从以上原理可以看出，染色体核型分析技术的关键是培养出合格的淋巴细胞。
传统淋巴细胞培养基由基础培养基(RP1640培养基)、抗菌素、小牛血清(或者胎牛血清)、淋巴细胞刺激因子、碳酸氢钠缓冲系统等组成。但是碳酸氢钠缓冲系统容易受环境中二氧化碳的影响，随着保存时间的延长，pH值升高，不利于培养基的保存。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术问题，提供一种pH值稳定的培养基；该培养基的pH值不受环境中气体成分的影响，又能够稳定淋巴细胞培养时的pH值；便于培养基长时间保存。
本发明的目的通过以下方案达到：
本发明的淋巴细胞培养基由1640基础培养基、植物血球凝集素(PHA)、小牛血清和甘油磷酸钠/4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)双缓冲系统组成；所述PHA的浓度为100mg/L，所述甘油磷酸钠/HEPES双缓冲系统的浓度为5-50mM，所述小牛血清的体积百分比为20％。
优选的，所述甘油磷酸钠/HEPES双缓冲系统由磷酸缓冲液、甘油磷酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)组成，所述磷酸缓冲液含Na2HPO4和KH2PO4。
优选的，所述甘油磷酸钠的浓度为3g/L，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的浓度为3g/L，所述Na2HPO4的浓度为2g/L，所述KH2PO4的浓度为1g/L。表1为本发明优选的淋巴细胞培养基各组分及浓度列表。
表1
本发明还提供了一种制备上述培养基的方法，按如下操作进行：取如上述培养基的组分，加入超纯水中，使各组分充分溶解；加入超纯水定容,过滤除菌。
本发明还提供了上述培养基在淋巴细胞培养中的应用。
本发明的pH值稳定的淋巴细胞培养基，利用甘油磷酸钠/PBS缓冲系统，对细胞后续培养没有影响，且能够稳定细胞pH值；此缓冲系统不受环境中二氧化碳以及其余气体成分的影响，利于培养基的长期保存。
具体实施方式
实施例1：不同配方的培养基培养效果比较
1、配制加入血清的基础培养基：10.5g 1640基础培养基，0.1gPHA，200ml小牛血清，用超纯水定容至1L。
2、配制培养基1：取1份基础培养基，添加2g/LNaHCO3。
3、配制培养基2：取1份基础培养基，添加2g/LNa2HPO4，1g/LKH2PO4。
4、配制培养基3：取1份培养基2，添加9g/L甘油磷酸钠。
5、配制培养基4：取1份培养基2，添加6g/L HEPES。
6、配制培养基5：取基础培养基2，添加3g/L甘油磷酸钠、3g/L HEPES。
7、以上培养基用盐酸/氢氧化钠溶液或者冲入二氧化碳调节pH至7.2。
8、0.22μm滤膜过滤除菌。
9、外周血淋巴细胞培养、染色体制片：
(1)采血：在采血者的肘部用碘棉签消毒皮肤两遍，取1ml一次性灭菌注射器，从肘部静脉采血1ml。
(2)培养：在酒精灯上将针头直接从橡皮塞(已用碘消毒)上插入，将血液缓缓滴入装有5ml 1640培养基的瓶内，每瓶0.5ml，轻轻摇动，置于37℃温箱中培养68-72小时。
(3)秋水仙素处理：终止培养前4小时，在一瓶培养瓶内加入25ul/ml秋水仙素0.05ml，轻轻摇匀，继续培养4小时。2小时后在另一培养瓶内加入80ul/ml秋水仙素0.05ml，轻轻摇匀，继续培养2小时。这样使细胞分裂停止在中期。
(4)离心：在室温下将培养物移入10ml刻度离心管内，1500转/分离心10分钟，吸去上清液，留底层离心沉淀物。
(5)低渗处理：加入8ml预温(37℃)的0.075MKCl低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，放回37℃温箱中低渗30分钟。这样可以使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。
(6)预固定：低渗30分钟后将培养物取出，加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸为3：1)1ml，吹打均匀。
(7)再离心：1500转/分离心10分钟，吸去上层液，保留沉淀物。
(8)固定：沿离心管管壁加入固定液7ml，用吸管将底部沉淀物打匀，室温固定30分钟。
(9)再离心：1500转/分离心10分钟，弃去上清液。
(10)再固定离心：加入固定液7ml，打匀，1500转/分离心10分钟，弃去上清液。
(11)重复步骤10一次。
(12)五次固定：加入固定液0.5-1ml，打匀制成细胞悬液。
(13)制片：用滴管吸细胞悬液，滴在已用4-6℃冰水浸泡的洁净载玻片上，促使细胞平铺于载玻片上。然后立即放入80℃恒温干燥箱中烤片15分钟。
(14)染色：Giemsa染色。
10、血液样品采集，种血72小时后，进行染色体制片，结果见表2，表2为各配方培养基对外周血淋巴细胞培养效果比较。
表2
备注：
淋转率(转化淋巴细胞百分数)＝转化细胞百分数/总淋巴细胞数量×100％；
分裂指数＝分裂细胞数/(淋巴细胞总数-分裂细胞数)×100％；
CV(变异系数)表示淋巴细胞培养效果的离散程度。
实验结果，上述4种培养基细胞生长旺盛；其中培养基2培养效果相对其余三个培养基效果差些，转化率低些，分裂指数较低。培养基3、培养基4、培养基1培养效果相当；培养基5培养效果较其余三个效果好。该结果表明：甘油磷酸钠、HEPES双缓冲系统要比甘油磷酸钠、HEPES单独使用效果更好，双缓冲系统对溶液的Ph值稳定性能更好，利于淋巴细胞生长。
实施例2：pH变化测定
将上述培养基1、培养基2、培养基3、培养基4放置37℃，常温放置，4℃放置，测试pH值的变化。表3为各种各配方培养基pH稳定性能比较。
表3
从表中结果表明：非碳酸氢钠缓冲系统比碳酸氢钠缓冲系统pH值变化小，其中甘油磷酸钠/HEPES双缓冲系统pH值最稳定，在4℃条件下，可保存4月，pH值不变。
实施例3：本发明的优选淋巴细胞培养基的配制
1、材料：HEPES、Na2HPO4、KH2PO4由上海生工工程生物提供；
小牛血清，由杭州四季青提供；
甘油磷酸钠，由Sigma公司提供；
1640干粉、由GIBCO公司提供。
2、设备：pH计，搅拌器。
3、配制1L淋巴细胞培养基方法：
按照质量称取各组分：PRMI-1640干粉10.45g培养基，0.1gPHA，2gNa2HPO4，1gKH2PO4，3g甘油磷酸钠，3gHEPES，加入500ml超纯水，200ml小牛血清；盐酸/氢氧化钠溶液或者冲入二氧化碳调节pH至7.2；最后用超纯水定容至1L，并用0.22μm滤膜过滤除菌。
实施例4：淋巴细胞培养基与市场上淋巴细胞培养基的培养效果比较
选取在广州市场上传统含有牛血清的淋巴细胞培养基最常见的两个品牌，自编号为DH和YSJ。取血液样品，分别向上述两个品牌以及本发明的产品中滴入同一个人的血液0.5ml，细胞培养、染色体制片。结果见表4，表4为淋巴细胞无血清培养基与市场上淋巴细胞培养基的培养效果比较结果。
表4
备注：
淋转率(转化淋巴细胞百分数)＝转化细胞百分数/总淋巴细胞数量×100％；
分裂指数＝分裂细胞数/(淋巴细胞总数-分裂细胞数)×100％；
CV(变异系数)表示淋巴细胞培养效果的离散程度。
结果：市场上淋巴细胞培养基效果相比，细胞生长和增殖效果相当，分裂指数差不多。本发明的淋巴细胞培养基，淋巴细胞生长旺盛，增殖效果好；与市场上产品相比，本发明的淋巴细胞培养基效果较好。
Claims (3)
1.一种pH值稳定的淋巴细胞培养基，所述淋巴细胞培养基由1640基础培养基、植物血球凝集素、小牛血清和其他组分所组成，所述小牛血清的体积百分比为20％，其特征在于，所述其他组分为甘油磷酸钠/4-羟乙基哌嗪乙磺酸双缓冲系统；
所述植物血球凝集素的浓度为100mg/L；
所述甘油磷酸钠/4-羟乙基哌嗪乙磺酸双缓冲系统的浓度为5-50mM；
所述甘油磷酸钠/4-羟乙基哌嗪乙磺酸双缓冲系统由磷酸缓冲液、甘油磷酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸组成，所述磷酸缓冲液含Na2HPO4和KH2PO4；所述甘油磷酸钠的浓度为3g/L，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为3g/L，所述Na2HPO4的浓度为2g/L，所述KH2PO4的浓度为1g/L。
2.一种制备权利要求1所述培养基的方法，其特征在于，按如下操作进行：取如权利要求1所述培养基的组分，加入超纯水中，使各组分充分溶解；加入超纯水定容，除菌。
3.权利要求1所述培养基在淋巴细胞培养中的应用。
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