CN108424874A - 一种细胞培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞培养基，包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80～90v/v％、丝胶蛋白溶液25～500mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.0～5mg/ml、人血白蛋白35～70mg/ml、植物血球凝集素20～80mg/ml、维生素C 20～100ug/ml、维生素E 20～80ug/ml、表皮生长因子0.5～10ng/ml、类胰岛素生长因子5～20ng/ml、L‑谷氨酰胺1～5mmol/ml，使用丝胶蛋白能促进细胞生长，壳聚糖季铵盐溶液用于细胞培养基，能够提高细胞增殖能力和杀瘤率，与丝胶蛋白配合使用，能够提高细胞的生长能力。芸豆凝集素具有凝集诸如血细胞、淋巴细胞、精子细胞等作用，在体外细胞培养中，植物凝集素可以使淋巴细胞增殖；在整体实验中，植物凝集素可以提高机体的免疫能力；在丝胶蛋白、壳聚糖季铵盐溶液、凝集素协同作用下，T淋巴细胞增殖倍数以及存活率、杀瘤率显著增加。

Description

一种细胞培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞培养基及其制备方法。

背景技术

细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。

1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测会造成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。

基于此，无血清培养基的研究就成为细胞培养领域的一项重要课题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了无血清细胞培养基及其制备方法。

为实现上述目的，所采取的技术方案：

一种细胞培养基，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80～90v/v％、丝胶蛋白溶液25～500mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.0～5mg/ml、人血白蛋白35～70mg/ml、植物血球凝集素20～80mg/ml、维生素C 20～100ug/ml、维生素E 20～80ug/ml、表皮生长因子0.5～10ng/ml、类胰岛素生长因子5～20ng/ml、L-谷氨酰胺1～5mmol/ml。

优选地，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80～90v/v％、丝胶蛋白溶液100～400mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.5～4mg/ml、人血白蛋白40～60mg/ml、植物血球凝集素50～60mg/ml、维生素C 50～80ug/ml、维生素E20～80ug/ml、表皮生长因子2～10ng/ml、类胰岛素生长因子10～15ng/ml、L-谷氨酰胺2～5mmol/ml。

申请人发现各组分的浓度在该范围内，其T淋巴细胞具有良好的增殖倍数以及存活率，其分别达到84％以上，以及存活率在96％以上，杀瘤率86％以上。

优选地，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基90v/v％、丝胶蛋白溶液200mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液3mg/ml、人血白蛋白40mg/ml、植物血球凝集素60mg/ml、维生素C 60ug/ml、维生素E 60ug/ml、表皮生长因子5ng/ml、类胰岛素生长因子10ng/ml、L-谷氨酰胺3mmol/ml。

申请人发现，各组分在此浓度下，其效果最佳。

优选地，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基85v/v％、丝胶蛋白溶液100mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.5mg/ml、人血白蛋白50mg/ml、植物血球凝集素50mg/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E 20ug/ml、表皮生长因子2ng/ml、类胰岛素生长因子15ng/ml、L-谷氨酰胺2mmol/ml。

优选地，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80v/v％、丝胶蛋白溶液400mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液4mg/ml、人血白蛋白60mg/ml、植物血球凝集素50mg/ml、维生素C 80ug/ml、维生素E 80ug/ml、表皮生长因子10ng/ml、类胰岛素生长因子15ng/ml、L-谷氨酰胺5mmol/ml。

优选地，所述丝胶蛋白溶液200mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液3mg/ml、植物血球凝集素60mg/ml。

一种如所述的细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)准确称取相应浓度的基础培养基干粉、壳聚糖季铵盐、维生素C、维生素E、人血白蛋白、植物血球凝集素溶于体积为800ml，温度为20～30℃的超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液A；

2)向溶液A中加入相应浓度的丝胶蛋白溶液、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、L-谷氨酰胺，搅拌均匀，加入温度为20～30℃的超纯水至体积为1L，得溶液B；

3)用其后加入1M HCl调pH值至7.2，得到溶液C；

4)将溶液用0.2um PVDF滤膜过滤除菌，即得。

本发明的有益效果：

本发明使用丝胶蛋白能促进细胞生长，丝胶替代血清，极大地降低了成本，提高了细胞培养体系的稳定性，避免了血清带来的污染；壳聚糖是目前自然界发现唯一的碱性多糖高分子材料，其具有抗菌、止血、止痛、可吸收渗液、防止组织粘连、促进肉芽组织增生而达到促进伤口愈合、防止疤痕的功效，而且其有良好的生物相容性，无毒无免疫原性，可生物降解，且降解产物无毒可吸收，是医用产品的常用原料，申请人发现，使用壳聚糖季铵盐溶液用于细胞培养基，能够提高细胞增殖能力和杀瘤率，与丝胶蛋白配合使用，能够提高细胞的生长能力。芸豆凝集素不仅具有凝集诸如血细胞、淋巴细胞、精子细胞等作用，而且参与了生物体内的一些重要生理和药理过程，因此是研究生物体内细胞癌变、受精、分化及分子识别等生命过程极其有用的工具，同时在临床医学检验上有着重要地位，而且是抗肿瘤药物(如干扰素、白细胞介素-2等)生产所需的促有丝分裂原。近年来还报道某些凝集素对艾滋病毒等也有抑制作用，并应用于试验性治疗。在体外细胞培养中，植物凝集素可以使淋巴细胞增殖；在整体实验中，植物凝集素可以提高机体的免疫能力；在丝胶蛋白、壳聚糖季铵盐溶液、芸豆凝集素协同作用下，T淋巴细胞增殖倍数以及存活率、杀瘤率显著增加，人血白蛋白可以维持细胞内外渗透压平衡。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明专利申请中涉及的制剂除特殊说明均可以从市面购买，特此说明。

本发明的无血清细胞培养基，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80～90v/v％、丝胶蛋白溶液25～500mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.0～5mg/ml、人血白蛋白35～70mg/ml、植物血球凝集素20～80mg/ml、维生素C 20～100ug/ml、维生素E 20～80ug/ml、表皮生长因子0.5～10ng/ml、类胰岛素生长因子5～20ng/ml、L-谷氨酰胺1～5mmol/ml。

丝胶蛋白溶液的制备：将纯度超过92％的丝胶蛋白溶解在水或者PBS缓冲液中，得浓度大于100mg/ml丝胶储存液。该储存液通过常规高温灭菌方法灭菌或者0.2μm过滤器过滤灭菌后使用。

所述的植物血球凝集素选用芸豆类植物血球凝集素。

该培养基的制备方法，包括以下步骤：

4)准确称取相应浓度的基础培养基干粉、壳聚糖季铵盐、维生素C、维生素E、人血白蛋白、植物血球凝集素溶于体积为800ml，温度为20～30℃的超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液A；

5)向溶液A中加入相应浓度的丝胶蛋白溶液、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、L-谷氨酰胺，搅拌均匀，加入温度为20～30℃的超纯水至体积为1L，得溶液B；

6)用其后加入1M HCl调pH值至7.2，得到溶液C；

4)将溶液用0.2um PVDF滤膜过滤除菌，即得。

实施例1

本实施例的无血清细胞培养基，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80v/v％、丝胶蛋白溶液50mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2mg/ml、人血白蛋白35mg/ml、植物血球凝集素30mg/ml、维生素C 20ug/ml、维生素E40ug/ml、表皮生长因子1.0ng/ml、类胰岛素生长因子5ng/ml、L-谷氨酰胺3mmol/ml。

本实施例的培养基的制备方法如上所述，在此不做描述。

实施例2

本发明的无血清细胞培养基，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基85v/v％、丝胶蛋白溶液25mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.5mg/ml、人血白蛋白50mg/ml、植物血球凝集素20mg/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E 50ug/ml、表皮生长因子0.5ng/ml、类胰岛素生长因子10ng/ml、L-谷氨酰胺1mmol/ml。

本实施例的培养基的制备方法同实施例1，在此不做描述。

实施例3

本发明的无血清细胞培养基，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基85v/v％、丝胶蛋白溶液100mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.5mg/ml、人血白蛋白50mg/ml、植物血球凝集素50mg/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E 20ug/ml、表皮生长因子2ng/ml、类胰岛素生长因子15ng/ml、L-谷氨酰胺2mmol/ml。

本实施例的培养基的制备方法同实施例1，在此不做描述。

实施例4

本发明的无血清细胞培养基，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基90v/v％、丝胶蛋白溶液200mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液3.0mg/ml、人血白蛋白40mg/ml、植物血球凝集素60mg/ml、维生素C 60ug/ml、维生素E 60ug/ml、表皮生长因子5ng/ml、类胰岛素生长因子10ng/ml、L-谷氨酰胺3mmol/ml。

本实施例的培养基的制备方法同实施例1，在此不做描述。

实施例5

本发明的无血清细胞培养基，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80v/v％、丝胶蛋白溶液400mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液4.0mg/ml、人血白蛋白60mg/ml、植物血球凝集素50mg/ml、维生素C 80ug/ml、维生素E 80ug/ml、表皮生长因子10ng/ml、类胰岛素生长因子15ng/ml、L-谷氨酰胺5mmol/ml。

本实施例的培养基的制备方法同实施例1，在此不做描述。

实施例6

本发明的无血清细胞培养基，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基85v/v％、丝胶蛋白溶液500mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液5mg/ml、人血白蛋白70mg/ml、植物血球凝集素80mg/ml、维生素C 100ug/ml、维生素E 60ug/ml、表皮生长因子8ng/ml、类胰岛素生长因20ng/ml、L-谷氨酰胺3mmol/ml。

本实施例的培养基的制备方法同实施例1，在此不做描述。

对比例1

本发明的无血清细胞培养基，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基90v/v％、丝胶蛋白溶液200mg/ml、壳聚糖溶液3.0mg/ml、人血白蛋白40mg/ml、植物血球凝集素60mg/ml、维生素C 60ug/ml、维生素E 60ug/ml、表皮生长因子5ng/ml、类胰岛素生长因子10ng/ml、L-谷氨酰胺3mmol/ml。

与实施例4的区别在于，使用壳聚糖代替了壳聚糖季铵盐。

对比例2

本对比例与实施例4不同之处在于，使用葡萄糖代替壳聚糖季铵盐溶液，其他成分与含量均相同；

对比例3

本对比例与实施例4不同之处在于，将植物血球凝集素去除。

对比例4

本对比例与实施例4不同之处在于，将丝胶蛋白溶液去除。

对比例5

本对比例与实施例4不同之处在于，丝胶蛋白溶液浓度为20mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液1.0mg/ml.

对比例6

本对比例与实施例4不同之处在于，植物血球凝集素浓度为100mg/ml。

对比例7

本对比例采用现有技术的血清细胞培养基。

效果例

1、培养基质量检测

测试对象；实施例1～6制备的培养基

1)无菌检测

使用平板法检测，取养血琼脂平板1块和沙保弱琼脂平板1块，平衡至室温，取上述实施例1～6制备的培养基经4000rpm离心15min后从样品管底部取走样品，每块平板100uL，用接种针划线，将平板放入37℃培养箱中，培养48h后观察结果为阴性，样品合格。

2)支原体检测

将上述测试培养基为样品进行沸水浴10min后，经12000离心3min后使用，采用25uL体系对待测样品、阳性对照、阴性对照进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察结果，检测结构为阴性，样品合格。

2、对T淋巴细胞增殖作用

使用T淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，加入含5％的FBS生理盐水300g离心十分钟，去除上清液，计数细胞，用相应的培养基配制成1*10⁶/ml细胞悬液，培养基使用前加入谷氨酰胺300mg,分为13组，按每孔加入2ml培养基接入6孔板，每组3个复孔，第一天加入1000IU/ml IFN-r，培养24h后加入50ng/ml CD3(OKT3)单抗300IU/mlIL-2，100IU/ml IL-1a，以后每3天计数，补加含300IU/ml IL-2培养液至1*10⁶/ml，培养15天，台盼蓝染色，计算细胞增殖倍数和存活率，得到表1所示。

从表1中可看出，使用本发明的制备的培养基，T淋巴细胞具有良好的增殖倍数以及存活率，其分别达到80％以上，以及存活率在94％以上，对比例1中使用壳聚糖代替了壳聚糖季铵盐，可看出其增殖倍数以及存活率均存在一定程度下降，表明壳聚糖季铵盐比普通壳聚糖在对细胞增殖以及存活方面有更优异的促进作用，对比例2采用葡萄糖代替壳聚糖季铵盐，可看出，实施例4的T淋巴细胞增殖倍数与存活率均远远高于对比例2，对比例3与对比例4为去除植物血球凝集素、丝胶蛋白溶液后的细胞培养基，其结果表明，实施例4的淋巴细胞增殖倍数与存活率均远远高于对比例3与对比例4，对比例5至6为部分成分的含量不在本发明之外，其效果有降低，表明只有在特定范围内，才能发挥最佳效果，对比例7采用传统的血清培养基，可看出，本发明的效果与血清培养基相当。

3、淋巴细胞杀瘤率确定

上述2中的分离培养至15天得免疫细胞为效应细胞，分别对实施例1～6以及对比例1～7中的细胞培养基洗涤一次，分别配成1*10⁶个/ml细胞悬液，以K562细胞为靶细胞，分别用实施例1～6以及对比例1～7中的细胞培养基洗涤一次，分别配制成密度为1*10⁵个/ml，按效、靶细胞比10:1接种到96孔板中，37℃、5％二氧化碳培养24h，使用CCK-8，试剂盒测试吸光度值，计算杀瘤率。

杀瘤率％＝1-(实验孔-效应细胞孔)/(靶细胞-空白孔)，结果如表2所示：

从表2中可看出，本发明的细胞培养基明显高于对比例，与对T淋巴细胞增殖倍数和存活率效果相似。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (7)

1.一种细胞培养基，其特征在于，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80～90v/v％、丝胶蛋白溶液25～500mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.0～5mg/ml、人血白蛋白35～70mg/ml、植物血球凝集素20～80mg/ml、维生素C 20～100ug/ml、维生素E 20～80ug/ml、表皮生长因子0.5～10ng/ml、类胰岛素生长因子5～20ng/ml、L-谷氨酰胺1～5mmol/ml。

2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80～90v/v％、丝胶蛋白溶液100～400mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.5～4mg/ml、人血白蛋白40～60mg/ml、植物血球凝集素50～60mg/ml、维生素C 50～80ug/ml、维生素E 20～80ug/ml、表皮生长因子2～10ng/ml、类胰岛素生长因子10～15ng/ml、L-谷氨酰胺2～5mmol/ml。

3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基90v/v％、丝胶蛋白溶液200mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液3mg/ml、人血白蛋白40mg/ml、植物血球凝集素60mg/ml、维生素C 60ug/ml、维生素E 60ug/ml、表皮生长因子5ng/ml、类胰岛素生长因子10ng/ml、L-谷氨酰胺3mmol/ml。

4.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基85v/v％、丝胶蛋白溶液100mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液2.5mg/ml、人血白蛋白50mg/ml、植物血球凝集素50mg/ml、维生素C 50ug/ml、维生素E 20ug/ml、表皮生长因子2ng/ml、类胰岛素生长因子15ng/ml、L-谷氨酰胺2mmol/ml。

5.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，主要包括以下含量的组分，DMEM/F12培养基80v/v％、丝胶蛋白溶液400mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液4mg/ml、人血白蛋白60mg/ml、植物血球凝集素50mg/ml、维生素C 80ug/ml、维生素E 80ug/ml、表皮生长因子10ng/ml、类胰岛素生长因子15ng/ml、L-谷氨酰胺5mmol/ml。

6.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于，所述丝胶蛋白溶液200mg/ml、壳聚糖季铵盐溶液3mg/ml、植物血球凝集素60mg/ml。

7.一种如权利要求1至6任一项所述的细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)准确称取相应浓度的基础培养基干粉、壳聚糖季铵盐、维生素C、维生素E、人血白蛋白、植物血球凝集素溶于体积为800ml，温度为20～30℃的超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液A；

2)向溶液A中加入相应浓度的丝胶蛋白溶液、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、L-谷氨酰胺，搅拌均匀，加入温度为20～30℃的超纯水至体积为1L，得溶液B；

3)用其后加入1M HCl调pH值至7.2，得到溶液C；

4)将溶液用0.2um PVDF滤膜过滤除菌，即得。