KR20170089924A - 줄기세포 재료 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 여러 측면은 새로운 중간엽줄기세포주(hb-MSC), hb-중간엽줄기세포주에 따라 조건이 형성된 배양 배지, 다양한 hb-MSC 조성물에 관한 것이다. hb-MSC 조성물에는 다수의 hb-MSC, hb-MSC 적응용배지 또는 이 2개 물질의 혼합물이 있을 수 있다. hb-MSC 조성물에는 적합한 담체가 포함되어 있을 수도 있다. 또한, hb-MSC 세포, 이 세포의 적응용배지 및 조성물 등에 대한 사용 방법을 설명했다.

Description

줄기세포 재료 및 그 제조방법{STEM CELL MATERIAL AND METHOD OF MANUFACTURING}
본 발명의 시행 예와 일치하는 조성 및 방법은 일반적으로 적어도 세포생물학 분야, 분자생물학 분야 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 시행 예는 줄기세포, 줄기세포 조건 배양 배지, 줄기세포 조건 배양 배지를 얻는 방법, 줄기세포 및 줄기세포 조건 배양 배지 적용과 관련이 있다.
중간엽줄기세포, 즉 MSC는 중간엽세포 유형(예: 지방세포, 연골세포, 골세포)으로 분화될 잠재력이 있는 다능성 기질세포이다. MSC는 다능성을 유지하면서도 자체 재생 능력이 뛰어나다. 골수 MSC는 현재 다양한 치료를 위한 임상시험에서 적용되고 있다. 배양물에서 MSC를 분리, 정제 및 복제하기 위한 절차는 해당 기술분야에 잘 알려져 있다.
MSC는 단층(즉 2차원) 또는 3차원 시스템에서 비드(bead)를 이용하여 배양할 수 있다. 이러한 표준 방법을 이용하면 MSC의 생리적 환경과 매우 유사한 조건에서 MSC를 성장시킬 수 있다. MSC 행동은 생체 내 환경과 생체 외 환경에 따라 다를 수 있다는 것이 입증되었다. 다양한 중간엽줄기세포주들 간의 차이는 일반적으로 분리 기술 및 생체 외 배양 조건의 차이 때문이었다. 예를 들면 성장 조건의 변화는 세포 표면 표지자 발현에 영향을 주고, 생체 외 세포 행동에 영향을 미칠 수 있다. 세포의 표면에서의 특정 표지자의 발현은 다양한 세포주들 사이를 구별하고 세포주의 계통을 확인하는 데 사용할 수 있다.
모든 세포(MSC 포함)는 배양하는 동안 생물학적 산물을 생성한다. 예를 들면 MCS는 배양하는 동안 200개가 넘는 고유 단백질을 생성한다고 알려져 있다. 배양하는 동안 MSC에 의해 생성되는 특정 생물학적 산물은 다양한 MSC의 특징을 나타내고 MSC를 구별하는 데 사용할 수 있다. 그러나 똑같은 소스에서 생성된 MSC를 사용하는 경우에도 분리 기술과 생체 외 배양 조건의 차이는 분비된 생물학적 산물 생성에 영향 및 변화를 준다. 물론 이상적인 세포 성장 조건에서 벗어나는 경우 배양물의 노화 및 손실을 초래할 수 있다고도 알려져 있다.
본 발명의 한 측면에 따라 하나 이상의 특성을 갖는 위스타르 랫트(Wistar rat)의 골수에서 유래된 고유한 중간엽줄기세포주를 제공했다. 예를 들면 0.7 × 106 세포를 75cm2 플라스크에 접종하고 최소 96시간 동안 배양하면 중간엽줄기세포주는 다음을 생성할 수 있다. (a) 배지를 교환하고 24시간 이내에 최소 4.5mM의 젖산염을 생성하거나, (b) 배지를 교환하고 24시간 이내에 최소 150pg/ml의 GRO/KC를 생성하거나, (c) 배지를 교환하고 24시간 이후에 250pg/ml 미만의 OPG를 생성하거나, (d) 배지를 교환하고 24시간 이후에 80pg/ml 미만의 TGF-β3을 생성한다. 다른 측면에 따라 0.7 × 106의 세포를 75cm2 플라스크에 접종하고 최소 150시간 동안 배양하면 다음과 같다. (e) 배양 배지의 pH는 배지를 교환하고 24시간 이내에 7.0 미만으로 감소하거나, (f) 배양 배지의 pH는 배양 배지를 교환하고 24시간 이내에 세포가 존재하지 않는 배양 배지의 pH에 비해 최소 0.4 단위 이상 감소한다. 배양 배지는 5% CO2로 보충된 RPMI-1640 배양 배지일 수 있다. 또한, 똑같은 줄기세포주는 7.05 미만의 pH에서 최소 하나의 모집단에서 두 배가 될 수 있다. 줄기세포주에서는 CD29와 CD44 표지자가 양성으로 발현하고 CD11b와 CD45 표지자가 음성으로 발현한다는 특징을 나타낼 수도 있다.
본 발명과 구별되는 측면은 특정 조건화 기간에 다수의 고유 줄기세포를 배양 배지에 유지함으로써 조제할 수 있는 적응용배지와 관련이 있다. 한 측면에서 배양 배지는 5% CO2로 보충된 RPMI-1640이다. CO2의 대기 농도 또는 저산소 상태 등과 같은 다양한 조건하의 배양 배지에 세포들을 유지할 수 있다. 본 발명의 여러 측면에 따라 조건화 기간은 다를 수 있다. 예를 들어, 조건화기간은 최소 12시간일 수 있거나 적응용배지에 최소 150pg/mL의 GRO/KC를 포함하는 데 충분한 기간이 될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서 적응용배지에는 (a) 최소 500pg/mL의 GRO/KC, (b) 최소 4000pg/mL의 VEGF, (c) 250pg/mL 미만의 OPG 또는 (d) 80pg/mL 미만의 TGF-β3 중 한 가지 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 고유 줄기세포주 또는 고유 세포에 의해 조건이 형성된 배양 배지를 포함하는 조성물과 관련이 있다. 또한, 이 조성물에는 적합한 담체가 포함되어 있을 수 있다. 담체로는 액체, 크림, 에어로졸, 로션, 연고, 수화젤 등이 있을 수 있으며, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 몇 가지 측면에서 이 조성물은 줄기세포의 일부 또는 모두를 제거하도록 처리할 수 있다. 또 다른 측면에서 이 조성물은 250pg/mL 미만의 OPG 또는 80pg/mL 미만의 TGF-β3이 함유된 조건 배지를 포함할 수 있다.
본 발명의 여러 측면에 따라 고유 줄기세포주, 적응용배지 또는 조성물을 주입, 이식 또는 국소 도포로 피험자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에 따라 세포, 적응용배지 또는 조성물을 봉합선, 붕대, 편직 메쉬, 이식물, 스텐트, 이식편, 습식 와이프(wet wipe) 또는 치주 패드에 도포하거나 다른 도포용 장치에 도포할 수 있다. 세포, 적응용배지 또는 조성물은 예를 들면 화상 치료, 피부 관리, 혈관형성, 맥관형성, 장기 또는 조직 치유, 화장품, 조직 염증, 세균감염, 상처 치료제, 당뇨병, 제약 제품 및 안과 제품, 흉터 감소, 모발 성장 자극, 면역 요법 활용 및 면역 교정(Immunocorrection) 요법, 피부, 골수 또는 장기 이식, 장기나 조직 치료 또는 기타 인간이나 동물 질병 치료를 비롯하여 다양하게 사용된다.
아래에 첨부된 도면을 참조하여 상세한 시행 예를 설명하므로 본 발명의 상기 측면 및/또는 기타 측면이 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 표지자 유형 및 표지자의 상대 백분율을 비롯하여 hb-MSC의 표면 세포 표지자에 대한 유동세포계측법 분석 도해를 나타낸다.
도 2는 계대 번호 9(p9)에 있는 hb-MSC의 김사 염색된 염색체 도해를 나타낸다.
도 3은 hb-MSC와 대조세포의 PCR 분석에 대한 전기영동도 도해를 나타낸다.
도 4는 RPMI-1640 배양 배지와 hb-MSC 조성물로 치료받은 지 9일 후의 마우스 상처 비교 도해를 나타낸다.
도 5는 RPMI-1640 배양 배지 및 hb-MSC 조성물로 치료한 마우스 상처에 대한 상처 봉합의 상대 속도를 나타낸다.
도 6은 시간 경과에 따른 RPMI-1640 배지, rb-MSC 적응용배지, hb-MSC 적응용배지의 pH 변화 도해를 나타낸다.
도 7은 hb-MSC 및 rb-MSC에 대한 세포 배양 동안 젖산염 농도(mM) 변화 도해를 나타낸다.
아래에서는 본 발명의 다양한 시행 예를 첨부된 도면을 참조하여 설명할 것이다. 본 발명의 여러 측면은 본 문서에 서술한 시행 예에 제한되지 않고 다양한 형태로 구현될 수 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된 표제 또는 소제목은 단지 편의를 위해서만 제시된 것으로 어떤 방식으로도 청구 범위 또는 의미를 제한하지 않는다는 것을 알고 있어야 한다. 마지막으로, 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에 분명하게 명시되어 있지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것을 알고 있어야 한다.
본 발명의 한 시행 예는 새로운 중간엽줄기세포주(이하, "hb-중간엽줄기세포주"라 칭함)와 관련이 있다. hb-중간엽줄기세포주 검체는 러시아 국립 공업용 미생물 수집센터(VKPM)에 수탁 번호 H-154로 맡겨져 있다. 이 세포주는 MSCR05P09라는 명칭으로 맡겨져 있다. hb-중간엽줄기세포주의 세포 표면 표지자 발현은 중간엽줄기세포의 세포 표면 표지자 발현과 일치한다.
본 발명의 다른 시행 예는 hb-MSC에 의해 조건 형성된 배지 및 이와 동일한 배지를 획득하기 위한 방법에 관한 것이다. 적응용배지에는 다수의 생물학적 기능을 수행할 수 있는 무수한 생물학적 산물, 저분자, 엑소좀이 함유되어 있다.
추가 시행 예는 hb-MSC 조성물과 관련이 있다. hb-MSC 조성물에는 다음과 같은 항목이 포함되어 있을 수 있다. (1) hb-MSC, hb-MSC의 배양물에 의해 조건 형성된 배지 또는 이 두개의 혼합물 및 (2) 적합한 담체. hb-MSCs, hb-MSC에 의해 조건 형성된 배지 및 hb-MSC 조성물은 어떤 상태에서도 사용할 수 있으며 해당 기술분야에 알려져 있는 방법을 이용하여 전달되며 다양한 적용 분야에 사용된다.
세포는 배양 배지를 이용하여 생체 외에서 계대배양시켰다. 적합한 배지에는 RPMI-1640, 둘베코수정이글배지(DMEM), Ham의 F12 배지, Iscove의 배지, McCoy의 배지 또는 기타 세포 성장을 위해 충분한 영양소가 함유되어 있는 배지를 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 이러한 배지는 상용 공급원으로부터 조제되거나 입수할 수 있다.
중간엽세포에서 선호되는 성장 환경을 제거하면 일반적으로 세포 증식이 감소되거나 정지되고 플라스틱 부착이 소실되거나 세포 형태가 변하는 결과를 초래한다. 세포 성장과 관련된 한 가지 중요한 변수는 세포 증식 기간 동안의 해당 환경의 pH이다. 일반적으로 줄기세포는 배양물의 상태가 생리적 pH에서 벗어나면 성장하지 않는다(또는 증식 속도가 감소된다). 이와 같은 이유로 배양 배지는 일반적으로 세포 배양 동안 완충제 역할을 한다. 모든 세포는 성장과 생존을 위해 소량의 CO2를 생성하면서도 CO2를 필요로 한다. 일부 배양 배지의 예에서 용해된 CO2는 배지의 pH를 완충하기 위해 CO2/중탄산염 반응을 이용하는 중탄산이온과 평형 상태에 있다. CO2는 배지로 자유롭게 용해되어 물과 반응하여 탄산을 형성한다. 세포가 대사 작용을 하여 더 많은 CO2를 생성하면 배지의 pH가 감소한다. 배지를 중탄산나트륨(NaHCO3)으로 보충하고 대기의 CO2 수준을 배지보다 높게 조절하여 최적의 pH 범위 7.2~7.4를 유지할 수 있다. 배지의 완충 용량은 NaHCO3의 양에 따라 결정된다. 일반적으로 1.2~2.2g/L의 NaHCO3에 설정된 완충 용량으로 최적의 pH를 달성하려면 5%의 보충 CO2를 지시한다. 또 다른 예로 3.7g/L의 NaHCO3에 설정된 완충 용량으로 최적의 pH를 달성하려면 10%의 보충 CO2를 지시한다. 보충 CO2의 양이 배지의 완충 용량보다 적으면 배지의 pH는 적합한 수준에서 유지되지 않을 수 있으며 이로 인해 노화가 발생할 수 있다.
또한, 세포 배양 배지에는 원하는 세포 배양을 뒷받침하거나 유지하기 위해 필요한 경우 비타민, 성장 인자, 호르몬, 단백질, 설탕 및/또는 산화 방지제 등과 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 소태아혈청(FBS)과 같은 혈청을 추가할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들면 10% 보충 FBS를 배지에 추가하거나 동물 혈청과 같은 양의 혈장을 추가할 수 있다. 또는, 보충 혈청 및/또는 보충 혈장이 없는 배양에서 세포를 유지시키거나 증식시킬 수 있다. 세포에 의해 조건이 형성된 배지는 배양 배지 대신에 사용되거나 배양 배지에 추가하여 사용될 수 있다.
hb-중간엽줄기세포주는 위스타르 랫트의 골수에서 분리시킬 수 있다. 일반적으로 hb-중간엽줄기세포주 분리에는 최소한 다음 방법을 포함한다. (1) 1차 랫트 골수 세포에서 계대 1 세포 획득, (2) p1 랫트 중간엽줄기세포를 적합한 플라스크에 접종, (3) 첫 번째 배양 단계(여기에서 세포는 첫 번째 배양 기간 동안 첫 번째로 사전 결정된 CO2 농도에서 배양됨), (4) 두 번째 배양 단계(여기에서 세포는 두 번째 배양 기간 동안 두 번째로 사전 결정된 CO2 농도에서 배양됨), (5) hb-MSC 수집.
1차 랫트 골수 줄기세포는 잘 알려진 방법에 따라 위스타르 랫트 경골 또는 대퇴골의 골수에서 채취할 수 있다. 세포 채취 후에 세포 펠렛을 다시 현탁시켜서 플라스틱 조직 배양 플라스크에 접종한 다음 5%의 CO2가 함유된 습한 대기 상태에서 37℃의 배양 배지(예: 10%의 FBS로 보충한 RPMI-1640)에서 배양시킬 수 있다. 대략 70% 밀집도까지 성장한 부착 세포는 계대 번호 1(p1)이라고 칭한다.
한 시행 예에서 첫 번째로 사전 결정된 CO2 농도는 일반적으로 배지 제조업체에서 결정한 대로 배지의 완충 용량에 지시된 CO2 농도와 일치하도록 설정할 수 있다. 예를 들면 첫 번째로 사전 결정된 CO2 농도는 RPMI-1640 배지가 배양에 사용될 때 5%로 설정될 수 있다. 똑같은 시행 예에서 두번째로 사전 결정된 CO2 농도는 일반적으로 배지 제조업체에서 결정한 대로 배지의 완충 용량에 지시된 CO2 농도에서 최소 50% 이상 감소될 수 있다. RPMI-1640 배지의 경우 지시된 CO2 농도는 5%이다. 따라서 방법에 대한 한 가지 시행 예에 따라 두 번째로 사전 결정된 CO2 농도는 2.5% 미만으로 설정해야 한다. 다른 시행 예에서 두 번째로 사전 결정된 농도는 CO2의 대기 농도(즉 대략 0.03% CO2)로 설정할 수 있다. 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 배양물에서 두 번째로 사전 결정된 CO2 농도가 증가하는 경우 hb-중간엽줄기세포주를 분리시키기 위해 두 번째 배양 기간을 증가시켜야 할 수 있음을 이해하게 될 것이다(예: 1번 이상의 추가 계대가 필요할 수 있음).
한 시행 예에서 첫 번째 배양 기간은 0번에서 4번의 세포 계대 사이일 수 있다. 첫 번째 배양 기간이 0번 계대인 경우 첫 번째 배양 단계는 완전하게 건너뛴다는 것을 이해해야 한다. 다른 시행 예에서 첫 번째 배양 기간은 배양 시 하나의 모집단이 두 배가 되는 데 필요한 시간(예: 대략 20-48시간)에서 대략 700시간까지의 기간이다. 한 시행 예에서 두 번째 배양 기간은 1번에서 8번의 세포 계대 사이일 수 있다. 추가 시행 예에서 두 번째 배양 기간은 배양 시 하나의 모집단이 두 배가 되는 데 필요한 시간(예: 대략 20-48시간)에서 대략 700시간까지의 기간이다. 예를 들면 세포는 10% FBS가 함유된 RPMI-1640에서 0.03% CO2의 대기에서 4번의 계대를 겪을 수 있다. 해당 기술분야의 통상의 지식이 있는 사람은 CO2 농도가 필요에 따라 양쪽 중 하나의 배양 단계 중 조정될 수 있음을 이해할 것이다.
"계대"는 희석하거나 희석하지 않은 상태에서 하나의 배양 플라스크에서 신선한 배양 배지가 들어있는 다른 배양 플라스크로 세포를 재분배하는 것으로서 이해해야 한다. 예를 들면 단일 세포 계대에는 다음을 포함할 수 있다. (1) 배양 플라스크의 표면에 세포 접종(예: 대략 2.0 × 106의 세포를 175cm2 표면적에 접종), (2) 배양 배지(예: RPMI-1640) 추가, (3) 규정된 대기의 CO2 설정, (4) 배양 플라스크를 적합한 온도(예: 37℃)로 설정된 인큐베이터에 배치, (5) 사전 결정된 기간("사전 결정된 배양 기간") 동안 세포를 배양 플라스크에 유지, (6) 세포 성장에 필요한 경우 신선한 배양 배지 공급, (7) 세포를 떼어내어 다시 접종.
각 계대의 경우 사전 결정된 배양 기간이 대략 30~700시간인 경우 세포는 배양 배지에 유지된다. 한 시행 예에서 사전 결정된 배양 기간은 96시간 미만이다. 다른 시행 예에서 사전 결정된 배양 기간은 대략 96시간에서 168시간 사이이다. 추가 시행 예에서 사전 결정된 배양 기간은 168시간을 초과한다. 또는, 사전 결정된 배양 기간이 세포 밀집도에 근거할 수 있다. 하나의 시행 예에서 사전 결정된 배양 기간은 세포가 대략 50%의 밀집도에 도달하기 위해 필요한 시간이다. 다른 시행 예에서 세포는 대략 50%와 70% 사이의 밀집도에 도달한 후에 계대배양된다. 추가 시행 예에서 세포는 대략 70%의 밀집도에 도달한 후에 계대배양된다.
hb-중간엽줄기세포주는 어떤 차원(D)에서든 관계없이 세포를 배양하여 분리시킬 수 있다. 예를 들면 세포는 비드(0D), 단층(2D) 또는 3D 골격을 이용하여 배양할 수 있다. 또한, hb-중간엽줄기세포주는 다양한 시스템을 이용하여 분리시킬 수 있다. hb-중간엽줄기세포주는 개방형 컨테이너 시스템 또는 폐쇄형 컨테이너 시스템 또는 이러한 두 가지 시스템을 결합시켜 놓은 시스템을 이용하여 분리시킬 수 있다. 한 시행 예에서 hb-중간엽줄기세포주는 폐쇄형 컨테이너 시스템을 이용하여 분리시킬 수 있다. 폐쇄형 컨테이너 시스템에서 세포 배양 플라스크는 보충 CO2에 대한 접근을 방지할 수 있는 불투과 캡으로 닫혀있다. 다른 시행 예에서 hb-중간엽줄기세포주는 CO2 농도를 제어할 수 있는 세포 배양실 내부의 개방형 플라스크를 이용하여 분리시킬 수 있다. 또 다른 시행 예에서 hb-중간엽줄기세포주는 CO2 농도를 제어할 수 있는 세포 배양실 내부에서 가스투과성 막으로 닫혀있는 플라스크에서 분리시킬 수 있다.
해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 위에서 설명한 다양한 세포 배양 방법은 단지 예로만 제시된 것이며 청구 범위를 제한하는 데 사용될 수 없음을 이해할 것이다. 또한, 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 배양하는 동안 세포의 행동을 설명하기 위해 절차, 배양 기간, 육성 기간, 배지, 혈청 또는 CO2 농도 그리고 다양한 변수에 변화를 주어야 할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 또 다른 시행 예는 고유 hb-중간엽줄기세포주에 관한 것이다. 세포 표면 표지자 발현은 이 세포주의 중간엽 속성을 확인하는 데 사용할 수 있다. 세포 표면 표지자는 적합한 방법(예: 유동세포계측법 포함)을 이용하여 파악할 수 있다. 예 4에서 설명하고 도 1에 제시된 대로 hb-MSC를 확보하는 방법으로는 hb-MSC의 표면 표지자가 변경되지 않으므로 hb-MSC에 랫트 골수 중간엽줄기세포의 표면 표지자와 일치하는 표면 표지자가 나타나는 결과를 얻을 수 있다.
도 2는 계대 번호 9(p9)에 있는 hb-MSC의 김사 염색된 염색체를 도해하고, 도 3은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석 결과를 도해한다. COX-1과 VN1R1 유전자는 각각 랫트 미토콘드리아와 핵 DNA에 대한 표지자로 사용되었다. 계대 번호 9에서 핵형은 정상 두배수체(즉, 2n=42)이다. 하기 예 1에 설명된 대로 세포주에 대한 PCR 분석을 통하여 이들은 랫트 세포라는 것이 확인되었다. 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 핵형 분석에 의해 세포의 유전적 안정성이 확인되는 경우 세포가 어떤 횟수의 계대에도 유지될 수 있음을 이해할 것이다.
hb-중간엽줄기세포주는 랫트에서 획득한 다른 줄기세포주와는 상당히 차이가 나는데, 이는 다양한 특성화 확인 방법을 이용하여 설명할 수 있다. 일반적인 랫트 중간엽줄기세포와 고유 hb-중간엽줄기세포주 간의 차이를 보여주기 위해 표준 조건하에 획득한 랫트 중간엽줄기세포를 배양했다. 이러한 비교 목적을 위해 준비한 대표적인 랫트 중간엽세포주에는 rb-중간엽줄기세포주라는 명칭을 부여했다. rb-중간엽줄기세포주를 획득하기 위해 예 2에 설명된 대로 해당 기술분야에 알려져 있는 표준 조건에 따라 p1 랫트 중간엽세포를 계대배양했다.
예 7(및 도 6)은 hb-중간엽줄기세포주와 rb-중간엽줄기세포주의 pH 사이의 차이를 보여주며, 이는 2개 세포주 간의 차이를 구별하는 데 사용할 수 있다. 또 다른 비교에서, hb-중간엽줄기세포주는 배양물의 젖산염 농도에 따라 rb-중간엽줄기세포주에서 hb-중간엽줄기세포주를 구별할 수 있다. rb-중간엽줄기세포주에서 hb-중간엽줄기세포주를 구별하는 또 다른 방법은 예 8에 설명된(그리고 표 3에 제시된) 각각의 세포주에 의해 조건이 형성된 배지에서 확인된 다양한 인자를 비교하는 것이다. 물론 hb-중간엽줄기세포주의 특성은 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람에게 알려져 있는 다른 방법으로 확인할 수도 있다.
또한, 본 발명의 시행 예는 hb-MSC에서 분화된 세포 또는 세포주에 관한 것이다. 이러한 세포주에는 지방세포, 연골세포, 골세포 또는 기타 세포가 있을 수 있다. 지방세포, 연골세포, 골세포를 분화하는 방법은 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 줄기세포 유전자 조작 방법도 잘 알려져 있다. 또한, 유전자 조작 hb-MSC에서 만들어진 줄기세포주 및 유전자 조작 hb-MSC에서 분화시킨 세포주가 본 연구 범위 내에 포함된다.
해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 hb-MSC를 특성화하는 다양한 방법이 단지 설명 목적으로 제시되었음을 이해할 것이다. hb-MSC의 시행 예는 밝혀진 다양한 특성화 방법 각각의 만족시킬 필요는 없으며 일부 시행 예는 본 문서에 공개된 한 두 개의 특성화 방법만을 만족시킬 수 있다.
본 연구의 한 시행 예는 hb-MSC의 조건에 의해 조건이 형성된 배양 배지(이후로는 hb-MSC 적응용배지라 칭함)에 관한 것이다. 하나의 시행 예에서 적응용배지는 다음에 의해 만들어질 수 있다. (1) 다수의 hb-MSC를 적합한 플라스크에 접종, (2) 배양 배지 제공, (3) 조건 기간 동안 hb-MSC를 배양물에 유지, (4) 적응용배지 수집. 조건 기간은 몇 시간이거나 몇 일이거나 심지어 몇 주가 될 수 있다. 이 기간 동안 배양 배지는 생물학적 산물에 의해 농축된다. 적합해 졌을 때(예: 성장 인자 즉 단백질 및 소낭 등과 같은 생물학적 산물이 배지에서 희망하는 수준에 도달할 수 있도록 배지의 조건을 형성한 후), 적응용배지를 수집할 수 있다. 예를 들면 적응용배지는 hb-MSC를 3, 6, 24, 30, 48, 48, 54, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312 또는 366시간 동안 배양하거나 기타 일정한 기간 동안 배양한 후에 수집할 수 있다. hb-MSC를 배양하여 확보한 적응용배지는 무균 상태 또는 필요하다면 살균 상태에서 처리할 수 있다. 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 배양에 사용되는 플라스크에 세포를 부착하기 전에 적응용배지를 수집하면 해당 적용에 따라 원치 않을 수 있는 성장 배지와 함께 세포가 제거되는 결과를 초래할 수 있음을 이해할 것이다.
한 시행 예에서 hb-MSC는 적응용배지 제거 후에 hb-MSC에 배양 배지를 추가하여 추가 배지의 조건을 형성하는 데 재사용할 수 있다. 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 세포 재사용 횟수는 세포의 밀집도뿐만 아니라 배지의 조건을 형성하는 데 사용하기 위한 시간에 따라 다르다는 것을 이해할 것이다. 각기 다른 기간(예: 3, 6, 24, 30, 48, 48, 54, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312, 366시간 또는 기타 일정한 시간)에 걸쳐 수집한 hb-MSC 적응용배지, 단일 계대 내에서 hb-MSC를 재사용하여 수집한 적응용배지 또는 hb-MSC의 각기 다른 계대에서 수집한 배지는 단일 hb-MSC 적응용배지를 형성하기 위해 결합시킬 수 있음을 알고 있어야 한다.
세포에 의해 조건 형성된 배지에는 배양 동안 분비되거나 배설되거나 방출되거나 생성된 다양한 생물학적 산물이 포함되어 있을 수 있다. 예를 들면 적응용배지에는 성장 인자, 항염증 인자, 신호전달 인자, 호르몬, 조절 인자, 효소 등과 같은 생물학적 산물, 엑소좀 등과 소낭 또는 기타 성분이 포함되어 있을 수 있다. 세포 배양 방법 및 배지 pH는 세포에 의해 방출된 생물학적 산물의 종류 및 양에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 초기에 접종된 세포의 농도는 적응용배지에 존재하는 생물학적 산물의 양에 영향을 미칠 수 있음을 이해해야 한다. 아울러, 보충 혈청을 추가하면 혈청 내에 특정한 양의 다양한 생물학적 산물이 함유되어 있기 때문에 조건이 형성되기 전에 배지 내 인자들의 시작 농도에 영향을 미친다는 것을 이해해야 한다. hb-MSC에 의해 조건이 형성된 배지 내의 이들 인자 농도를 측정한 결과 이 배지는 rb-MSC에 따라 조건이 형성된 배지와는 상당히 다르다는 것이 입증되었다. 세포에 의해 생성된 인자의 농도를 측정하는 데에는 시판되고 있는 분석물을 사용할 수 있다(예: EMD Millipore 또는 Eve Technologies에서 구입 가능한 분석물). 정확한 측정은 분석에 사용된 항체 쌍에 따라 달라지며 이에 따라 검출된 인자들의 농도는 사용된 분석 또는 측정 기술에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예 8에서는 지정된 기간에 rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주의 계수 농도 비교를 설명했다.
한 시행 예에서는 일반적으로 배지 제조업체에서 결정한 대로 배지의 완충 용량에 지시된 CO2 농도에서 hb-MSC를 유지하여 적응용배지를 형성할 수 있다. RPMI-1640 배지의 경우 지시된 CO2 농도는 5%이다. 다른 시행 예에서는 일반적으로 배지 제조업체에서 결정한 대로 배지의 완충 용량에 지시된 CO2 농도에서 최소한 50% 이상 감소된 CO2 농도에서 hb-MSC를 유지하여 적응용배지를 형성할 수 있다. 또 다른 시행 예에서는 hb-MSC를 CO2의 대기 농도(즉 0.03% CO2)에서 유지하여 적응용배지를 형성할 수 있다.
한 시행 예에서는 hb-MSC를 O2의 대기 농도(즉 17%)에서 유지하여 적응용배지를 형성할 수 있다. 다른 시행 예에서는 hb-MSC를 10% 미만으로 감소시킨 O2의 농도로 유지하여 적응용배지를 형성할 수 있다. 또 다른 시행 예에서는 hb-MSC를 2% 미만으로 감소시킨 CO2의 농도로 유지하여 적응용배지를 형성할 수 있다. 예를 들면 생체 내 골수 환경을 흉내 내기 위해 낮춰진 O2 농도(저산소 상태)를 사용할 수 있다.
일부 시행 예에서는 적응용배지를 농축된 형태로 사용할 수 있다. 예를 들면 적응용배지는 해당 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 1과 100 사이의 계수만큼 농축시킬 수 있다. 필요한 적합한 농도는 적응용배지의 적용에 따라 달라질 것이다.
한 시행 예에서는 특정 생물학적 산물을 추가/제거 및/또는 농축/희석하기 위해 수집된 순수 적응용배지를 추가로 처리했다. 산물 분리 및 정제를 위해 사용되는 방법은 최적의 생물학적 활동이 유지될 수 있도록 선택해야 한다. 예를 들면 성장 인자, 조절 인자, 펩티드 호르몬, 항체, 엑소좀 또는 기타 원하는 생물학적 화합물을 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같은 방법에는 겔 크로마토그래피, 이온 교환, 금속 키일레이트 친화 크로마토그래피, 고압액체크로마토그래피(HPLC), 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 원심분리 등이 있다. 다른 시행 예에서는 적응용배지에 존재하는 엑소좀이나 기타 소낭은 적응용배지에서 농축하거나 제거할 수 있다.
또 다른 시행 예에서 적응용배지를 동결건조시킬 수 있다. 동결 건조 적응용배지는 생리식염수, 인산완충식염수, 세포 배양 배지, 조건 세포 배양 배지, 물 또는 이들 성분의 혼합물을 포함하는 적합한 희석액을 사용하여 재구성할 수 있다. 이 적응용배지는 원래 적응용배지와 동일한 농도에서 재구성할 수 있다. 별도의 시행 예에서 동결건조 적응용배지는 농도 계수가 1~100인 원래 적응용배지에 비해 더욱 농축된 형태로 재구성할 수 있다.
hb-중간엽줄기세포주는 다양한 배양 배지 조건을 형성하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 일부 시행 예에서 배양 배지는 추가 태아 혈청 및/또는 혈장으로 보충할 수 있다. 한 시행 예에서 배지는 20% FBS가 존재하는 상태에서 조건을 형성한다. 다른 시행 예에서 배지는 10% FBS가 존재하는 상태에서 조건을 형성한다. 또 다른 시행 예에서 배지는 7% FBS가 존재하는 상태에서 조건을 형성한다. 또 다른 시행 예에서 배지는 3% FBS가 존재하는 상태에서 조건을 형성한다. 한 대체 시행 예에서 배지는 FBS가 존재하지 않는 상태에서 조건을 형성한다. 다른 시행 예에서는 세포가 특정 밀집도에 도달한 후에 낮춰진 무혈청 또는 무혈장 배지는 저혈청 또는 무혈청 적응용배지를 형성하기 위한 교체품으로 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 시행 예는 hb-MSC 조성물에 관한 것이다. hb-MSC 조성물에는 hb-MSC, hb-MSC 적응용배지 또는 이 두 가지 물질의 혼합물이 있을 수 있다. 또한, hb-MSC 조성물에는 적합한 담체가 함유되어 있을 수 있다. hb-MSC 조성물 내 hb-MSC 적응용배지의 총량은 부피에 따라 0.00001%에서 99.99%까지 다양할 수 있다.
hb-MSC 조성물의 시행 예로는 hb-MSC 또는 배지의 활용/목적을 기반으로 하여 선택된 또 다른 세포와 혼합된 hb-MSC 적응용배지가 있을 수 있다. 예를 들면 hb-MSC 조성물에 추가할 수 있는 세포로는 자가세포, 동종세포 또는 이종세포 등이 있을 수 있다.
다른 시행 예에서는 hb-MSC 조성물로는 다른 적응용배지와 혼합된 hb-MSC 또는 hb-MSC 적응용배지 또는 원하는 비율의 적응용배지 혼합물이 있을 수 있다. 또한, hb-MSC 조성물로는 자가세포, 동종세포 또는 이종세포에 의해 조건이 형성된 배지와 혼합된 hb-MSC 또는 hb-MSC 적응용배지가 있을 수 있다. 또 다른 시행 예에서 hb-MSC 적응용배지는 인간 중간엽줄기세포에 의해 조건 형성된 배지와 혼합할 수 있다.
hb-MSC 조성물은 박테리아, 바이러스, 마이코플라스마 또는 균류에 의해 오염되지 않도록 보호해야 한다. 한 시행 예에서 이를 수행하기 위해 세포 배양 및 처리 동안 무균 처리 조건이 동반될 수 있다. 다른 시행 예에서 hb-MSC 조성물에는 일정 수준의 항균 활동을 제공하기 위한 약제용 보존제가 함유되어 있다. 일부 시행 예에서는 보존제는 용액 오염에 의해 발생되는 2차 박테리아, 진균 또는 아메바 감염을 제한할 수 있다. 또 다른 시행 예에서는 보존제를 추가하면 생물 분해를 예방하고 효능을 유지시킴으로써 hb-MSC 또는 hb-MSC 적응용배지의 유통 기간을 연장시킨다. 비제한적인 예에는 보존제에 세제, 산화제, 킬레이트제 또는 대사 억제제(5원자가 안티몬, 4차 암모늄 및 유기 수은 포함) 등이 포함될 수 있다. 보존제의 예로는 티메로솔, 크레졸, 포르말린, 벤잘코늄클로라이드 또는 벤질 알코올 등이 있다.
추가 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 항염증제, 항균제, 진통제, 항진균제, 살균제, 소독제, 비타민, 자외선 차단제, 항생제, 유리기 방지제, 금속이온봉쇄제, 염기화제 또는 산성화제, 향료, 계면 활성제, 충진제, 천연 제품 또는 천연 제품의 추출물 등으로 보충할 수 있다. 보충물질로는 유기물질 저분자, 유기 금속 화합물, 중합체, 무기염류, 성장 인자, 케모카인, DNA, RNA 또는 효소 등이 있을 수 있다. 추가 시행 예에서 배지는 설탕, 단백질, 인슐린, 신호전달 단백질, 또는 추가 소형 분자(착색제, 향료 또는 감미료 포함)로 보충할 수 있다. 또한, 보충제에는 등장성 또는 화학적 안정성을 향상시키는 물질과 같은 첨가제가 경미하게 함유되어 있을 수 있다.
해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 hb-MSC 조성물에 적합한 담체의 예에 액체, 크림, 에어로졸, 로션, 연고 또는 하이드로겔 등이 있을 수 있음을 이해할 것이다. 이들 담체는 수성 부형제(배양 배지 포함), 비수성 부형제, 오일, 표준 지방 물질, 종래의 겔화제, 완충제, 농후제, 현탁제, 유화제, 보습제, 피부 연화제, 친수성 또는 친유성 활성제 등을 추가하는 것에 근거할 수 있다. 이들 다양한 성분의 양은 hb-MSC 조성물 사용 및 원하는 효과에 따라 달라질 것이다. 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 "적합한 담체"로 2개 이상의 담체 및/또는 기타 성분의 혼합물이 있을 수 있음을 이해할 것이다.
본 문서에 공개된 hb-MSC 조성물은 연구, 진단, 치료 또는 상용 목적 등을 포함하여 다양한 목적에 사용할 수 있다. hb-MSC 조성물은 예를 들면 화상 치료, 피부 관리, 혈관형성, 맥관형성, 장기 또는 조직 치유, 화장품, 조직 염증, 세균감염, 상처 치료제, 당뇨병, 제약 제품 및 안과 제품, 흉터 감소, 모발 성장 자극, 면역 요법 활용 및 면역 교정(Immunocorrection) 요법, 피부, 골수 또는 장기 이식, 장기나 조직 치료 또는 기타 인간이나 동물 질병 치료 등과 같이 다양한 질환을 치료하는 데 사용할 수 있다.
본 문서에 사용된 바와 같이 "치료"에는 질병, 장애나 질환 또는 이들 상태에 대한 지표나 증상이 시간 경과에 따른 치료, 교정, 개선, 중증도 완화 또는 감소 등이 포함된다. hb-MSC 또는 hb-MSC 적응용배지는 hb-MSC 조성물과 동일한 또는 비슷한 목적을 위해 사용할 수 있음을 이해해야 한다.
또한, hb-MSC 조성물은 피부 과학적인 용도나 화장품 용도로, 식품이나 보충제 또는 동물 사료 보충제, 세포 배양 및 제약 응용 분야에 사용할 수 있다. hb-MSC 조성물은 급성 손상에 대응하여 예방 치료 또는 만성 손상 치료를 위해 사용할 수 있다. 한 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 인간 질병 또는 질환 치료를 위해 사용할 수 있다. 다른 시행 예에서 이러한 치료에는 동물에 활용하는 것이 포함될 수 있다.
한 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 화상 치료뿐만 아니라 피부 부상, 골절, 위궤양이나 당뇨성 궤양, 췌장 손상, 간 손상, 신장 손상, 비장 손상, 혈관 손상 및 기타 내부 및 외부 손상을 치료하는 데 있어서 유익하게 사용할 수 있다. 예를 들면 hb-MSC 조성물은 예 5에 설명되고 도 4 및 5에 제시된 대로 부상 치유를 촉진하거나 가속하기 위한 국소 도포에 사용할 수 있다. 다른 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 별도의 수술적 적출 또는 배액이 필요할 수 있는 부상을 치료하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면 hb-MSC 조성물은 상처 난 조직의 관류를 상승시킬 수 있다.
hb-MSC 조성물은 구김살, 미간 주름, 흉터 치료에 사용되거나 태양 자외선에 의해 유발된 유해한 영향 및 정상적인 노화와 같은 여타의 피부 상태 치료를 포함하여 미용적 피부 치료에 사용될 수 있다.
hb-MSC 조성물은 해당 기술분야에 알려진 방법으로 전달할 수 있다. 예를 들면 이러한 전달에 대한 일부 시행 예는 부위마다 다를 수 있다. 즉 국소, 경구, 코, 정맥내, 피하, 피부내, 경피, 근육내 또는 복강내 투여에 의해 전달할 수 있다. 추가 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 조절형 서방성 부형약에 사용할 수 있도록 조제할 수 있다.
지정된 경우에 있어서 hb-MSC 조성물의 실재 선호되는 양, 투여 방식, 투여 간격은 활용되고 있는 구체적인 조성물, 조제된 특별 조성물, 적용 모드, 특별 손상 및 치료받고 있는 피험자에 따라 달라진다는 것이 인정될 것이다. 각각의 구체적인 사례별 투여량은 예를 들면 적합한 종래의 약리학적 프로토콜 사용 등과 같이 종래의 고려사항을 사용하여 결정할 수 있다. 의약성분의 용량을 결정하는 해당 기술분야에 숙련된 의사 및 조제사는 적합한 용량을 결정할 수 있을 것이다.
hb-MSC 조성물은 어떤 상태에서도 사용이 가능할 수 있다. 예를 들면 hb-MSC 조성물은 정제, 캡슐, 스킨 패치, 흡입기, 점안액, 점비약, 귀약, 액상 세척제, 좌제, 로션, 크림, 연고제, 주사제, 겔, 하이드로겔, 박막, 분말, 세럼, 연고, 파운데이션, 페이셜 마스크, 입술 보호 제품, 자외선 차단제, 헤어케어 제품(예: 샴푸, 딥 컨디셔너를 포함한 컨디셔너, 헤어 케어 트리트먼트), 스킨 클렌저, 각질 제거제, 컴팩트 제제 등의 형태 또는 기타 해당 기술분야 종사자에게 알려진 적합한 형태를 취할 수 있다.
일부 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 봉합선, 의료 장비 또는 이식 장치를 코팅하는 데 사용할 수 있다. 또 다른 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 봉합선, 붕대, 식물, 스텐트, 이식편과 결합하거나 치주에 적용할 수 있다. 또한, hb-MSC 조성물은 습식 와이프에 사용할 수 있다. hb-MSC 조성물은 상처 치유를 가속화하기 위해 상처 충진제로 추가하거나 기존의 상처 충진 조성물에 추가할 수도 있다. 또 다른 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 아이섀도, 팬케이크 메이크업, 컴팩트 또는 기타 화장품에 추가할 수 있다.
추가 시행 예에서 hb-MSC 조성물의 액상 제제는 예를 들면 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취하거나 사용 전의 적합한 담체와 구성될 수 있도록 건조 제품으로써 제시될 수 있다.
또 다른 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 정해진 시간 동안 냉동되어 있을 수 있다. 아니면 hb-MSC 조성물은 정해진 시간 동안 동결건조되었거나 냉동되어 있을 수 있다. 또는, hb-MSC 조성물은 위에서 설명한 대로 재구성하거나 정해진 시간 동안 냉동되어 있을 수 있다. 또는, hb-MSC 조성물은 실온(예: 대략 28℃)와 0℃ 사이의 온도에서 보관하거나 보존할 수 있다. 사용되는 온도 범위는 한정시키려는 의도는 아니며 해당 기술분야 종사자는 적용 대상의 속성에 따라서 활용되는 대안적인 온도 범위를 구상할 수 있다.
또 다른 시행 예에서 hb-MSC 조성물은 사용 전에 실온 상태가 되도록 할 수 있다. 아니면 hb-MSC 조성물은 실온 이하의 온도에서 적용할 수 있다. 또는, hb-MSC 조성물은 온도가 생물학적 재료를 변성시킬 정도로 높지 않는 한 실온 이상의 온도에서 활용할 수 있다.
{여러 가지 예}
다음 여러 가지 예는 본 발명의 특정 시행 예를 입증하기 위해 포함하였다. 다음 예에 공개된 기술은 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 본 발명의 특정 시행 예를 실행하기 위한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 해당 기술분야의 숙련 기술자는 이해해야 한다. 그러나 해당 기술분야의 숙련 기술자는 본 공개 내용에 비추어 본 발명의 진정한 의미와 범위를 벗어나지 않으면서 다음 예에 많은 변화가 있을 수 있다는 것을 이해해야 한다.
예 1 - hb - MSC 세포에 대한 동물종 규명
세포가 진정으로 랫트의 세포라는 것을 확인하기 위해 PCR 분석을 사용했다. PCR 분석의 경우 COX-1 및 VN1R1 유전자는 각각 미토콘드리아와 핵 DNA에 사용되었다. COX-1 유전자는 multiplex-PCR를 이용하여 증폭시켰으며 반면에 VN1R1 유전자는 표준 PCR를 이용하여 증폭시켰다. 38세 인간 남성, 32세 인간 여성, 위스타르 랫트의 혈액 검체를 대조군으로 사용했다. DNA는 제조업체의 지침에 따라서 시판되고 있는 키트(PREP-GS-GENETICS, DNA Technology, Russia)를 이용하여 세포 배양물에서 분리시켰다. 모든 프라이머는 시판되고 있으며 Evrogen, LLC에서 매입할 수 있다.
PCR 분석에 사용되는 특정 프라이머는 다음과 같다.
COX1 -인간: f`-TAGACATCGTACTACACGACACG 및 r`-TCCAGGTTTATGGAGGGTTC.
COX1 - 랫트 : f`- CGGCCACCCAGAAGTGTACATC 및 r`- GGCTCGGGTGTCTACATCTAGG.
VN1R1 -인간: f`- TGGTCTGGGCCAGTGGCTCC 및 r`- GAGTGTTTTCCTTGTCCTGCAGGCA .
VN1R1 - 랫트 : f`- AGAAGAGTTACTGGCCCAAGGGACA 및 r`- GGGGCTGAACGCTGGGAAGC.
PCR 산물에 대한 전기영동은 2% 아가로스 겔에서 SubCellGT 전기영동 시스템(Bio-Rad)을 활용하여 수행했다. 아가로스 겔은 ECX-F15.C(Vilber Lourmat) 투과조명기를 이용하여 시각화시켰다. 전기영동도는 도 3에 제시되어 있다. 구체적으로 도 3, Lanes 1-5에는 COX1 유전자 염기쌍을 보여준다. Lane 1은 대조 인간군 DNA에 대한 결과를 보여주며 반면에 Lane 2는 대조군 랫트 DNA의 결과를 보여준다. Lane 3 및 4는 hb-MSC 검체에 대한 결과를 보여준다. Lane 5는 음성 대조군을 보여준다. Lane 7-10은 VN1R1 유전자 염기쌍을 보여준다. Lane 10은 대조군 인간과 대조군 랫트 DNA의 혼합을 보여준다. Lane 9 및 7은 hb-MSC 검체에 대한 결과를 보여준다. Lane 8은 음성 대조군이다. “M”은 DNA 절편 표지자 lane을 의미한다. 전기영동법을 통해 hb-MSC는 랫트에게서 분리되었으며 인간 세포의 물질에 의해 오염되지 않았다는 것이 확인되었다.
예 2 - rb - MSC 배양
분리시킨 hb-중간엽줄기세포주와 대표적인 랫트 중간엽줄기세포(rb-MSC) 간의 차이를 입증하기 위해 표준 조건 하에서 획득한 랫트 중간엽줄기세포를 배양하여 평가했다.
rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주 모두는 위스타르 랫트 경골 또는 대퇴골의 골수에서 수집한 일차 세포에서 분리시켰다. 모든 세포가 GMP 조건 하에서 배양되었다. 하나의 시행 예에서 일차 세포 획득 절차는 다음과 같았다. 동물을 마취시킨 다음 안락사시켰다. 무균 상태에서 각 랫트의 경골 또는 대퇴골 모두를 절개했다. 골수는 15%의 소태아혈청(FBS)으로 보충한 MEM-Earle 배지로 플러싱하여 밀려나오게 했다. 골수 기둥 현탁액은 피펫을 이용하여 확산시키고 연속적으로 70-μm 메쉬 나일론 필터를 통하여 여과시킨 다음 200G에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상청액은 폐기하고 세포 펠렛을 배지에 다시 현탁시켰다. 한 마리 랫트의 세포를 플라스틱 플라스크에 접종하고 5%의 CO2가 함유된 습한 대기에서 37℃에서 배양시켰다. 제3일에 혈액 세포 및 기타 비부착세포를 제거한 다음 더 많은 성장이 이루어지도록 새로 보충된 배지를 추가했다. 70%의 밀집도까지 성장한 부착 세포는 일차 배양 세포(p1)라고 정의하였다.
rb-중간엽줄기세포주를 획득하기 위해 해당 기술분야에 알려져 있는 표준 조건에 따라서 그리고 RPMI-1640에 대하여 명시된 제조업체의 가이드라인에 따라 p1 랫트 중간엽줄기세포를 계대배양했다. p1 세포는 Ca2 +-Mg2 +-free Hanks 용액(Sigma, USA, H9394-500ml)으로 씻고 37℃에서 5-10분 동안 0.25%의 트립신-EDTA 용액(Sigma, USA, T4424-100ml)으로 배양시켜 분리시켰다. 그 다음에 트립신을 비활성화시키기 위해 5%의 FBS(Sigma, USA, F6765)으로 보충한 Hanks 용액을 추가했다. 세포는 200G에서 10분 동안 원심분리시키고, 15% FBS으로 보충한 1-2ml RPMI-1640 배지에 다시 현탁시키고 노이바우어 궤선이 표시되어 있는 혈구계산기 그리드를 이용하여 수동으로 계수했다. 그런 다음 15% FBS(Sigma, USA, F6765), 100units/ml 페니실린-100μg/ml 스트렙토마이신(Sigma, USA, P4458), 100ng/ml 암포테리신(Sigma, USA, A2942), 2mM L-글루타민(Sigma, USA, G7513), RPMI-1640 배지용 0.005ml/ml 비타민(100x)(Sigma, USA, R7256), RPMI-1640 배지용 0.005ml/ml 아미노산(Sigma, USA, R7131)으로 보충한 RPMI-1640 배지(Sigma, USA, R5886)를 이용하여 세포를 1.0 x 106 의 밀도에서 75cm2 플라스크에 p2로 평판 배양했다. 침투성 무균 필터 캡이 구비된 플라스크를 5% CO2 대기 상태에서 습한 인큐베이터의 37℃에서 배양시켰다. RPMI-1640 배지(15% FBS로 보충했음)는 10일에서 14일 기간 동안(또는 70%의 밀집도에 도달했을 때) 3일마다 교체했다. 계대 번호 2(p2) 이후 세포는 플라스크 1개당 2 × 106 세포 수의 밀집도에서 175cm2에서 평판 배양했고 10% FBS으로 보충한 RPMI-1640을 사용했다. 그 다음 각 계대의 경우 세포들은 비슷하게 평판배양되어 70%의 밀집도까지 성장했다. 70%의 밀집도 이후에 세포들을 분류하여 플라스틱 배양 플라스크에 다시 접종했다. 계대 5(p5) rb-MSC는 hb-중간엽줄기세포주에 비교하기 위해 사용되었다.
예 3 - hb - MSC 배양
hb-중간엽줄기세포주를 획득하기 위해 p1 랫트 중간엽줄기세포를 다음과 같은 방법에 따라서 배양했다. 먼저, p1 세포는 Ca2 +-Mg2 +-free Hanks 용액(Sigma, USA, H9394-500ml)으로 씻고 37℃에서 5-10분 동안 트립신-EDTA 용액(Sigma, USA, T4424-100ml)으로 배양시켜서 분리시켰다. 그 다음에 트립신을 비활성화시키기 위해 5%의 FBS(Sigma, USA, F6765)으로 보충시킨 Hanks 용액을 추가했다. 세포는 200G에서 10분 동안 원심분리시키고, 15% FBS으로 보충한 1-2ml RPMI-1640 배지에 다시 현탁시키고 노이바우어 궤선이 표시되어 있는 혈구계산기 그리드를 이용하여 수동으로 계수했다. 그런 다음 15% FBS(Sigma, USA, F6765), 100units/ml 페니실린-100μg/ml 스트렙토마이신(Sigma, USA, P4458), 100ng/ml 암포테리신(Sigma, USA, A2942), 2mM L-글루타민(Sigma, USA, G7513), RPMI-1640 배지용 0.005ml/ml 비타민(100x)(Sigma, USA, R7256), RPMI-1640 배지용 0.005 ml/ml 아미노산(Sigma, USA, R7131)으로 보충한 RPMI-1640 배지(Sigma, USA, R5886)를 이용하여 세포를 1.0 × 106 의 밀도에서 75cm2 플라스크에 p2로써 평판 배양했다. 침투성 무균 필터 캡이 구비된 플라스크를 5% CO2 대기 상태에서 습한 인큐베이터의 37℃에서 배양시켰다. RPMI-1640 배지(15% FBS로 보충했음)는 10일에서 14일 기간 동안(또는 70%의 밀집도에 도달했을 때) 3일마다 교체했다.
계대 번호 2(p2) 이후 세포는 플라스크 1개당 2 × 106 세포 수의 밀집도에서 175cm2에서 평판 배양했고 10% FBS으로 보충한 RPMI-1640을 사용했다. 배양물은 대기에 CO2 5%가 함유된 상태에서 습한 인큐베이터의 37℃에서 계속 성장했다. 세 번째 계대(p3) 후에 세포는 감소된 CO2 농도에서 계대배양되었다. CO2 농도를 감소시키기 위해 배양 플라스크는 대기 CO2 조건 하에서 불투과 캡으로 밀봉시켜 37℃에서 배양시켰다. 다음과 같은 모든 계대에서는 보충 CO2를 사용하지 않았다. 앞에서 설명한 바와 같이 10% FBS가 보충된 신선한 RPMI-1640 배치를 추가하고 대략 14일 동안 3일-4일마다 교체했다. 각 계대의 경우 세포들은 비슷하게 평판배양되어 70%의 밀집도까지 성장했다. 70%의 밀집도 이후에 세포들을 분류하여 플라스틱 배양 플라스크에 다시 접종했다. 계대 9 (p9) hb-MSC를 rb-MSC와 비교했다. PCR 분석(Nanodiagostika, LLC, RUS)을 통해 hb-MSC에는 박테리아, 바이러스, 마이코플라스마 또는 균류에 의한 오염이 없다는 것이 확인되었다.
hb-중간엽줄기세포주는 2밀리리터(ml) 앰플에서 3.0 × 106~5.0 × 106 사이의 농도에서 액체 질소 온도에서 10% DMSO 및 50% FBS 배지를 이용하여 보존했다.
예 4 - 유동세포계측법에 의한 hb - MSC의 특성화
[01] 유동세포계측법 실험을 수행하여 hb-중간엽줄기세포주와 rb-중간엽줄기세포주의 세포 표면 표지자를 파악했다. 이 실험의 목적을 위해 100μl 세포 현탁액체 해당 항체 50μl를 추가했다. 현탁액을 5초의 기간 동안 소용돌이 치게 한 다음 빛이 없는 상태에서 30분의 기간 동안 +4°C에서 유지시켰다. 배양 후에 혼합물을 500μl의 식염수 용액으로 희석시킨 다음 원심분리를 통하여 2번 씻어내어 과도한 시약을 제거했다. 각각의 원심분리는 10분의 기간 동안 400G에서 수행했다(ELMI). 각 검체별로 최소한 10,000개 이상을 분석했다. 결과는 WinMDI 2.7 분석 프로그램을 이용하여 분석했으며 분석 결과는 도 1에 나와 있다. rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주에 의해 발현된 표면 표지자에 대한 요약은 아래의 표 1에 나와 있다.
rb - 중간엽줄기세포주와 hb - 중간엽줄기세포주 표면 표지자
세포 표면 표지자 hb - 중간엽줄기세포주 rb - 중간엽줄기세포주
CD29 95.0 % 94.6 %
CD44 94.8 % 98.7 %
CD11b < 3% < 3%
CD45 < 3% < 3%
대표적인 골수 랫트 중간엽줄기세포에는 CD44, CD29 표지자가 양성으로 발현되며 CD45, 및 CD11b 표지자는 음성으로 발현된다. 위의 표 1에 제시된 대로 hb-MSC 중간엽줄기세포주에는 랫트의 골수 간중간엽줄기세포와 일치하는 표면 표지자가 나타난다. 이를 통해 hb-MSC를 획득하는 방법으로 인해 세포의 표면 표지자가 변경되지 않는다는 것이 입증되었다.
예 5 - 상처 봉합에 대한 형태계측 연구
실험용 마우스의 상처 치유 과정을 추적하기 위해 형태계측 연구를 수행했다. 모든 동물 실험은 K.I.Scriabin의 이름을 따라 명명한 모스크바국립 수의학·생명공학 아카데미의 수의학 수술부에서 수행했다. 모든 실험에 몸무게가 대략 22-25g인 생후 3~5개월의 흰색 실험용 마우스를 이용했다. 각 실험마다 총 6마리의 마우스를 이용했다. 마취시킨 각 마우스의 깨끗하게 털을 밀어낸 견갑골 부위에서 대략 0.5cm의 직경을 절개했다. 절개 후에 이 마우스들은 대조군과 표본군으로 분류하여 각각의 그룹마다 마우스 3마리씩 배정했다. 디지털 형태계측 지표를 획득하기 위해 각각의 상처를 사진찍었다. 절개한 지 30분 후에 각각의 상처는 50μl의 RPMI-1640 방울 또는 hb-MSC 조성물로 치료했다. 이 예에서는 hb-MSC 조성물에는 예 8에 설명되어 있는 것과 같은 hb-MSC 적응용배지가 포함되었지만 반면에 각각의 조건 기간(96, 144, 192, 216, 240, 264, 288시간) 마다 수집한 적응용배지들은 단 1개의 용기 안에서 결합되었다. 이 조성물에는 보존제로 염화벤잘코늄(BEK) 및 계면활성제로 트리톤 X-100가 포함되어 있다. 상처 크기는 15일의 기간 동안 하루에 한 번 측정했다. 상처 평가 후에 하루에 한 번 각 군의 각 동물에게 hb-MSC 조성물 및 RPMI-1640를 도포했다. hb-MSC 조성물 및 RPMI-1640 배지로 치료한 상처의 비교 치유 과정을 보여주는 디지털 이미지는 도 4에 제시되어 있다. 도 4는 대조군 내 마우스의 치료 제1일 및 똑같은 마우스의 치료 제9일을 보여준다. 도 4는 똑같은 대조군 내 마우스(hb-MSC 조성물로 치료받음)의 치료 제1일 및 똑같은 마우스의 치료 제9일을 보여준다. hb-MSC 조성물과 RPMI-1640을 이용한 치료가 평균 상처 크기에 미치는 효과는 도 5에 도해되어 있다.
예 6 - hb - MSC 조성물의 치료 효과
hb-MSC 조성물의 치료 효과를 시험하기 위해 개(65+), 고양이(80+), 말(40+), 가축(25+), 설치류(200+), 조류(15+) 등을 포함하여 다양한 동물에게서 실험을 수행했다. hb-MSC 조성물을 사용하여 위의 시험 피험자의 다양한 질환을 치료했다. 이 예에서 사용된 hb-MSC 조성물은 예 5와 똑같은 조성물이다. 이 치료에는 다음이 포함되었다. 1) 시술 이후의 절개 부위를 포함한 상처에 도포, 2) 화학 화상을 포함한 화상 치료, 3) 당뇨성 궤양을 포함한 궤양, 4) 누관, 5) 화농성 염증, 결막염, 각막염, 유방염, 연조직염, 위염, 피부염을 포함한 조직 염증, 6) 골절을 포함한 기형 교정에 적용, 7) 피부, 인대, 근육 조직을 포함한 다양한 조직 치료. 이와 같은 실험에서 hb-MSC 조성물은 국소, 경구, 코, 정맥내, 피하, 피부내, 경피, 근육내 또는 복강내 등과 같은 방법에 의해 전달되었다. 또한, hb-MSC 조성물은 무균 냅킨을 이용하여 에어로졸로 도포하였으며 상처 부위에 (예를 들면 젖꼭지 모양의 깊은 컵을 이용하여) 직접 발라서 도포했다. hb-MSC 조성물은 상기 질환 모두를 치료하는 데 효과적이었으며 재생 효과 개선, 상처 봉합 속도, 염증 및 국소적 세균 집락의 유의미한 감소, 항균 효과, 혈관형성 및 맥관형성, 조직 상처 감소 및 상처 부위의 모낭 복구 등이 나타났다. 이들 실험에서 관찰된 상당한 재생 효과는 예 5에서 설명한 마우스 상처 시험의 결과와 일치했다. 모든 사례의 경우 동물들은 hb-MSC 조성물로 치료한 후에 건강한 상태가 유지되었다. 모든 사례에 대하여 독성, 자극, 감작 및 생물축적을 평가했다. hb-MSC 조성물을 투여한 지 30일 이내의 모든 동물에 대하여 추적한 모든 지표는 혈액 검사에 의해 평가한 정상 범위 내에서 유지되었다. 신장, 간, 폐, 비장, 창자, 연조직의 조직검사에서는 hb-MSC 조성물 적용으로 인한 급성 또는 만성 독성 징후가 나타나지 않았다. 또한, 알레르기 반응, 감염, 또는 기타 부정적인 부작용에 대하여 기록된 사례가 없었다. 함께 수행된 이러한 실험은 hb-MSC 조성물이 화상 치료, 피부 관리, 혈관형성, 맥관형성, 장기 또는 조직 치유, 화장품, 조직 염증, 세균감염, 상처 치료제, 당뇨병, 제약 제품 및 안과 제품, 흉터 감소, 모발 성장 자극, 면역 요법 활용 및 면역 교정(Immunocorrection) 요법, 피부, 골수 또는 장기 이식, 장기나 조직 치료, 또는 기타 질병 치료 등과 같이 인간과 동물의 다양한 질환을 안전하고 효과적으로 치료하는 데 사용할 수 있다는 것을 입증해 주었다.
예 7 - rb - MSC 및 hb - MSC 세포주에 의해 조건 형성된 배양 배지 분석
배양 배지에 미치는 hb-MSC 및 rb-MSC의 영향을 비교하기 위해 각 세포주마다 별도의 9개 75cm2 플라스크를 플라스크 1개당 0.7 × 106 세포의 밀도에서 평판 배양했다. 세포는 37℃에 설정된 인큐베이터에서 5% CO2로 보충된 RPMI-1640/10% FBS에서 계대배양시켰다. 세포 플라스크는 기체 투과성 캡으로 닫아 두었다. 총 9번의 기간 즉 24, 48, 96, 144, 192, 216, 240, 264, 288시간 분석했다. 지정된 각각의 기간에 단 1개의 세포 플라스크를 분석했다. 3일(시간), 5일(120시간), 7일(168시간) 후에, 그리고 그 후에는 매일 남아 있는 모든 유리병에서 배지를 교환했다. 배지의 젖산염 농도 및 pH은 9번의 기간 각각에서 측정했다. 48시간 측정을 제외하고 배지를 교환하고 24시간 후에 측정이 이루어질 수 있도록 기간을 선택했다. 젖산염은 SPINREACT의 젖산 특성 분석 키트와 함께 생화학분석기를 활용하여 3회에 걸쳐 측정했다. pH는 전자 pH 계측기(METTLER TOLEDO InLab Versatile Pro)를 이용하여 측정했다. 또한, 각각의 기간에 세포 계수를 측정했으며 세포는 7.05 미만의 pH에서 최소 하나의 모집단에서 두 배가 되었다.
도 6에는 이 예에서 설명된 세포 수집 당시에 측정한 순수 RPMI-1640 배양 배지, rb-MSC 적응용배지, hb-MSC 적응용배지에 대한 시간 경과에 따른 pH의 변화가 도해되어 있다. 도 7에는 배양 동안 rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주의 젖산염 농도 변화(mM)가 나와 있다. 에러 바는 젖산염 농도의 1개 표준 편차를 나타낸다. 도 6 및 7의 데이터에 근거한 아래의 표에는 이 예의 rb-MSC와 hb-MSC에 대한 다양한 측정 값에 대한 비교치가 나와 있다.
rb - 중간엽줄기세포주와 hb - 중간엽줄기세포주에 대한 차이 확인 방법
차이 확인 방법 rb - MSC hb - MSC
배양 시 최소한 150시간 이상 경과한 후 배지의 pH(배지 교환 후 24시간 이내) > 7.05(모든 시간에서) < 7.0
RPMI -1640 배지의 pH로부터 최대 이탈(배지 교환 후 24시간 이내) < 0.15 > 0.4
배양 시 최소한 96시간 이상 경과한 후 배지의 젖산염 농도(배지 교환 후 24시간 이내) < 3 mM > 4 mM
7.05 미만의 pH에서 두 배가 된 모집단 수 0 > 1
예 8 - rb - MSC 및 hb - MSC 세포주에 의해 조건 형성된 배지 내 요소 비교
rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주는 세포주를 배양 배지에 유지할 때 각각의 세포주에 의해 생성되는 요소를 비교하여 구별할 수 있다. hb-MSC 및 rb-MSC에 의해 생성된 요소를 비교하기 위해 각 세포주마다 별도의 7개 75cm2 플라스크를 플라스크 1개당 0.7 × 106 세포의 밀도에서 평판 배양했다. 세포는 37℃에 설정된 인큐베이터에서 5% CO2가 보충된 RPMI-1640/10% FBS에서 계대배양시켰다. 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람은 보충 혈청을 추가하면 조건을 형성하기 전에 배지 내 요소들의 시작 농도에 영향을 미치게 된다는 것을 이해할 것이다. 세포 플라스크는 기체 투과성 캡으로 닫아 두었다. 총 7번의 기간(즉 96, 144, 192, 216, 240, 264, 288시간)을 분석했다. 규정된 각각의 기간에 단 1개의 세포 플라스크를 분석했다. 3일(72시간), 5일(120시간), 7일(168시간) 후에, 그리고 그 후에는 매일 남아 있는 모든 유리병에서 배지를 교환했다. 배지를 교환하고 24시간 후에 측정이 이루어질 수 있도록 기간을 선택했다. 요소들에 대한 분석은 Eve Technologies Rat Cytokine Array/Chemokine Array 27-Plex Panel, TGF-Beta 3-Plex Cytokine Array 및 Rat Bone 1-Plex Array을 이용하여 수행했다. 표 1에 비교되어 있는 특정 요소로는 인터류킨-10(IL-10), 인터페론-감마 유도 단백질 10(IP-10), CXCL1(GRO/KC), 혈관내피성장인자(VEGF), 오스테오프로테게린(OPG), 전환성장인자-베타 1(TGF-β1), 전환성장인자-베타 2(TGF-β2), 전환성장인자-베타3(TGF-β3) 등이 있다. 다중 측정은 검량선에 따라 다르며 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람이 이해하는 바와 같이 어느 정도까지는 변화가 있을 수 있다는 것을 이해해야 한다.
분석 기간 동안 관찰된 요소들의 범위는 아래의 표 3에 요약되어 있다. 요소들의 농도는 세포 배양 기간 및 플라스크 내 세포 수에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다.
rb - MSC와 hb - MSC에 대한 농축 계수 비교( pg /ml 단위)
계수 rb - MSC hb - MSC
IL-10 0 - 12 12 - 38
IP-10 7 - 26 18 - 120
GRO / KC 14 - 100 460 - 5600
VEGF 300 - 2400 760 - 15800
OPG 540 - 3200 0 - 90
TGF - β1 550 - 2600 67 - 2000
TGF - β2 520 - 3200 170 - 2900
TGF - β3 100 - 610 0 - 40
rb - 중간엽줄기세포주와 hb - 중간엽줄기세포주 비교 분석
hb-중간엽줄기세포주와 rb-중간엽줄기세포주를 구별하는 방법은 여러 가지가 있다. 2개 세포주를 구별하는 한 가지 방법은 세포가 성장하는 동안 배양 배지의 pH를 측정하는 것이다. 예 7은 rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주에 의해 조건 형성된 배양 배지(RPMI-1640)의 pH 측정을 설명한 것이다. 배양 전에 RPMI-1640의 pH는 대략 7.01로 측정되었다. 예상했던 바와 같이 전체 실험 기간 동안 RPMI-1640에 대해 지정된 보충 CO2 수량(즉 5%)은 대조 RPMI-1640의 pH를 효과적으로 7.2로 완충시켰다. rb-MSC 배양물의 pH는 전체 실험 기간 내내 대략 7.08과 7.2 사이에서 유지되었다. 그러나 hb-MSC의 경우 pH는 24시간에 대략 7.2로부터 그 다음 216시간의 과정 동안 대략 6.6의 pH까지 감소되었고 실험 기간 동안 대략 대략 6.6의 pH에서 유지되었다. 150시간의 배양 후에 배양 배지의 pH는 배지 교환 후 24시간 이내에 7.0 미만으로 감소된다. 이와 마찬가지로 150시간의 배양 후에 배양 배지의 pH는 배지 교환 후 24시간 이내에 RPMI-1640의 pH에서 최소한 0.4 단위 이상 감소된다. rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주에 의해 조건 형성된 배지의 pH에 차이가 나면 이 2개 세포주가 각기 다르다는 것이 입증된다.
rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주를 구별하기 위한 또 다른 방법은 예 7에 설명된 대로 배지 내 세포에 의한 젖산염 생성을 측정하는 것이다. 도 7은 hb-MSC가 젖산염을 생성하고 이로 인해 농도가 rb-MSC에 의해 생성된 농도를 초과하는 결과를 초래한다는 것을 보여준다. 배양 시 대략 96시간 후에 hb-MSC는 배지 교환 후 24시간 이내에 최소한 4mM 이상의 젖산염을 생성하고 배지를 교환하고 24시간 이내에 12.4mM 정도의 젖산염을 생성할 수 있다. 이와는 대조적으로, rb-MSC에 의해 생성 된 젖산염 농도는 배지 교환 후 24시간 이내에 3mM을 초과하지 않는다. rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주에 의해 조건 형성된 배지의 젖산염 농도에 차이가 나면 이 2개 세포주가 각기 다르다는 것이 입증된다.
rb-중간엽줄기세포주와 hb-중간엽줄기세포주를 구별하기 위한 또 다른 방법은 각 세포주에 의해 조건 형성된 배지를 평가하는 것이다. 이러한 비교를 위해 예 8에 설명된 대로 배지를 수집했다. 요소들에 대한 측정 결과는 상기 표 3에 요약되어 있다. rb-중간엽줄기세포주에 의해 조건 형성된 배지와 hb-중간엽줄기세포주에 의해 조건 형성된 배지의 요소들의 농도에 차이가 나면 이 2개 세포주가 각기 다르다는 것이 입증된다.
전체적으로 위에서 설명한 특성확인 방법으로 인해 hb-중간엽줄기세포주는 rb-중간엽줄기세포주는 다르다는 결론에 도달하게 된다.
본 발명에 대해 특별히 본 발명의 대표적인 시행 예를 참조하여 보여주고 설명한 반면 해당 기술분야의 통상적인 지식이 있는 사람들은 아래의 청구범위 및 그에 상응하는 범위에 정의된 바와 같이 본 발명이 본 발명의 발명의 진정한 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부항목에 있어서 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

Claims (59)

  1. 러시아 국립 공업용 미생물 수집센터(VKPM)에 수탁 번호 H-154로 맡겨져 있는 중간엽줄기세포주.
  2. 0.7 ×106 세포를 75cm2 플라스크에 접종하고 최소한 96시간 이상 배양하는 경우 다음과 같은 특성 중 최소한 1개 이상의 특성을 갖는 중간엽줄기세포주: (a) 세포는 배지를 교환하고 24시간 이내에 최소한 4.5 mM의 젖산염을 생성하거나, (b) 세포는 배지를 교환하고 24시간 이내에 최소한 150pg/mL의 GRO/KC를 생성하거나, (c) 세포는 배지를 교환하고 24시간 이후에 250pg/mL 미만의 OPG를 생성하거나, (d) 세포는 배지를 교환하고 24시간 이후에 80pg/mL미만의 TGF-β3을 생성한다.
  3. 세포를 골수에서 유래한 제2항의 줄기세포주.
  4. 세포를 위스타르 랫트의 골수에서 유래한 제3항의 줄기세포주.
  5. 세포가 7.05 미만의 pH에서 최소 하나의 모집단에서 두 배가 된 제2항의 줄기세포주.
  6. 0.7 × 106 세포를 75cm2 플라스크에 접종하고 최소한 150시간 이상 배양하는 경우 다음과 같은 특성 중 최소한 1개 이상의 특성을 갖는 제2항의 줄기세포주. (e) 배양 배지의 pH는 배지를 교환하고 24시간 이내에 7.0 미만으로 감소하거나, (f) 배양 배지의 pH는 배양 배지를 교환하고 24시간 이내에 세포가 존재하지 않는 경우의 배양 배지의 pH에 비해 최소한 0.4 단위 이상 감소한다.
  7. 줄기세포가 5% CO2에 의해 보충된 RPMI-1640 배양 배지에서 배양된 제6항의 줄기세포주.
  8. 배지를 교환하고 24시간 이내에 세포가 최소한 460pg/mL 이상의 GRO/KC를 생성하는 제2항의 줄기세포주.
  9. 배지를 교환하고 24시간 후에 세포가 최소한 90pg/mL 이상의 OPG를 생성하는 제2항의 줄기세포주.
  10. 배지를 교환하고 24시간 후에 세포가 최소한 40pg/mL 이상의 TGF-β3을 생성하는 제2항의 줄기세포주.
  11. 제2항에 기술된 특성들 중 최소한 2개 이상의 특성을 갖는 제2항의 줄기세포주.
  12. 제2항에 기술된 특성들 중 최소한 3개 이상의 특성을 갖는 제2항의 줄기세포주.
  13. 세포에 있어서 CD29와 CD44 표지자 발현이 양성이고 CD11b와 CD45 표지자 발현은 음성이라는 특징을 갖는 제2항의 줄기세포주.
  14. 최소한 90% 이상의 세포에 2n=42의 핵형이 보이는 제2항의 줄기세포주.
  15. 다음과 같은 단계로 구성된 과정에 의해 준비된 적응용배지:
    배양 배지 제공;
    제1항의 줄기세포주에서 유래한 다수의 줄기세포를 조건 기간 동안 배양 배지에 그대로 존속시키고, 이에 의해 배양 배지를 보정;
    적응용배지 수집.
  16. 다음과 같은 단계로 구성된 과정에 의해 준비된 적응용배지:
    배양 배지 제공;
    제2항의 세포를 조건 기간 동안 배양 배지에 그대로 존속시키고, 이에 의해 배양 배지를 보정;
    적응용배지 수집.
  17. 배양 배지가 5% CO2에 의해 보충된 RPMI-1640인 제16항의 적응용배지.
  18. 세포를 CO2의 대기 농도에서 유지시킨 제16항의 적응용배지.
  19. 세포를 저산소 상태에서 유지시킨 제16항의 적응용배지.
  20. 세포를 위스타르 랫트의 골수에서 유래한 제16항의 적응용배지.
  21. 조건 기간이 최소한 12시간 이상인 제16항의 적응용배지.
  22. 조건 기간이 적응용배지에 최소한 150pg/mL 이상의 GRO/KC가 함유되기에 충분한 시간이 되는 제16항의 적응용배지.
  23. 다수의 중간엽줄기세포에 의해 조건 형성된 배양 배지로 구성된 적응용배지로써 여기에서 적응용배지에는 다음과 같은 물질들 중 최소한 1개 이상의 물질을 함유하고 있다: (a) 최소한 500pg/mL 이상의 GRO/KC, (b) 최소한 4000pg/mL의 VEGF, (c) 250pg/mL 미만의 OPG, 또는 (d) 80pg/mL 미만의 TGF-β3.
  24. 적응용배지에 최소한 2500pg/mL 이상의 GRO/KC가 함유되어 있는 제23항의 적응용배지.
  25. 적응용배지에 최소한 8,000pg/mL 이상의 VEGF가 함유되어 있는 제23항의 적응용배지.
  26. 적응용배지에 최소한 50pg/mL 이상의 OPG가 함유되어 있는 제23항의 적응용배지.
  27. 적응용배지에 최소한 50pg/ml/mL 이상의 TGF-β3이 함유되어 있는 제23항의 적응용배지.
  28. 적응용배지를 동결 건조시키거나 재구성할 수 있으며 재구성 적응용배지의 농도가 1부터 100까지 변화시킬 수 있는 제23항의 적응용배지.
  29. 다음과 같은 항목으로 구성된 조성물:
    제15항의 적응용배지; 및
    수락 가능한 담체.
  30. hb-MSC 조성물 내 hb-MSC 적응용배지의 총량이 부피에 따라 0.00001%로부터 99.99%까지 다양할 수 있는 제29항의 조성물.
  31. 다음과 같은 항목으로 구성된 조성물:
    제16항의 적응용배지; 및
    수락 가능한 담체.
  32. 두 번째 조건 기간 동안 제2항의 세포에 의해 조건 형성된 두 번째 배양 배지가 추가적으로 구성되어 있는 제31하의 조성물.
  33. hb-MSC 조성물 내 hb-MSC 적응용배지의 총량이 부피에 따라 0.00001%로부터 99.99%까지 다양할 수 있는 제31항의 조성물.
  34. 적응용배지에서 최소한 90% 이상의 세포를 제거할 수 있도록 적응용배지를 추가로 처리한 제31항의 조성물.
  35. 배지의 조건을 형성하기 위해 사용된 세포가 위스타르 랫트의 골수로부터 수득된 제31항의 조성물.
  36. 배지의 조건을 형성하기 위해 사용된 세포에 있어서 CD29와 CD44 표지자 발현이 양성이고 CD11b와 CD45 표지자 발현은 음성이라는 특징을 갖는 제31항의 줄기세포주.
  37. 제2항의 다수 세포로 추가 구성된 제31항의 조성물.
  38. 담체에 액체, 크림, 에어로졸, 로션, 연고 또는 하이드로겔 등이 포함된 제31항의 조성물.
  39. 다음과 같은 항목으로 구성된 조성물:
    다수의 중간엽줄기세포에 의해 조건이 형성된 배양 배지,
    조성물이 250pg/mL 미만의 OPG 또는 80pg/ml 미만의 TGF-β3로 구성된 적합한 담체.
  40. 조성물이 추가로 최소한 150pg/ml 이상의 TGF-β2로 구성된 제39항의 조성물.
  41. 조성물이 추가로 최소한 250pg/ml/ml 이상의 GRO/KC로 구성된 제39항의 조성물.
  42. 배양 배지가 최소한 12시간 이상 동안 조건 형성된 제39항의 조성물.
  43. 제15항의 적응용배지를 피험자에게 투여하는 것으로 구성된 제15항의 적응용배지 이용 방법.
  44. 제29항의 조성물을 피험자에게 투여하는 것으로 구성된 제29항의 조성물 이용 방법.
  45. 제39항의 조성물을 피험자에게 투여하는 것으로 구성된 제39항의 조성물 이용 방법.
  46. 도포용 도구가 봉합선, 붕대, 편직 메쉬, 이식물, 스텐트, 이식편, 습식 와이프(wet wipe), 또는 치주 패드 등으로 구성된 제44항의 조성물을 함유하고 있는 도포용 도구로 구성된 치료 장비.
  47. 화상 치료, 피부 관리, 혈관형성, 맥관형성, 장기 또는 조직 치유, 화장품, 조직 염증, 세균감염, 상처 치료제, 당뇨병, 제약 제품 및 안과 제품, 흉터 감소, 모발 성장 자극, 면역 요법 활용 및 면역 교정(Immunocorrection) 요법, 피부, 골수 또는 장기 이식, 장기나 조직 치료에 사용하기 위한 제23항의 적응용배지.
  48. 적응용배지를 주입하거나, 이식하거나 국소적으로 도포하여 적응용배지를 투여하는 제23항의 적응용배지.
  49. 화상 치료, 피부 관리, 혈관형성, 맥관형성, 장기 또는 조직 치유, 화장품, 조직 염증, 세균감염, 상처 치료제, 당뇨병, 제약 제품 및 안과 제품, 흉터 감소, 모발 성장 자극, 면역 요법 활용 및 면역 교정(Immunocorrection) 요법, 피부, 골수 또는 장기 이식, 장기나 조직 치료에 사용하기 위한 제29항의 조성물.
  50. 조성물을 주입하거나, 이식하거나 국소적으로 도포하여 조성물을 투여하는 제29항의 조성물.
  51. 화상 치료, 피부 관리, 혈관형성, 맥관형성, 장기 또는 조직 치유, 화장품, 조직 염증, 세균감염, 상처 치료제, 당뇨병, 제약 제품 및 안과 제품, 흉터 감소, 모발 성장 자극, 면역 요법 활용 및 면역 교정(Immunocorrection) 요법, 피부, 골수 또는 장기 이식, 장기나 조직 치료에 사용하기 위한 제39항의 조성물.
  52. 조성물을 주입하거나, 이식하거나 국소적으로 도포하여 조성물을 투여하는 제39항의 조성물.
  53. 줄기세포주 중에서 1개 이상의 줄기세포가 화상 치료, 피부 관리, 혈관형성, 맥관형성, 장기 또는 조직 치유, 화장품, 조직 염증, 세균감염, 상처 치료제, 당뇨병, 제약 제품 및 안과 제품, 흉터 감소, 모발 성장 자극, 면역 요법 활용 및 면역 교정(Immunocorrection) 요법, 피부, 골수 또는 장기 이식, 장기나 조직 치료에 사용되는 제1항의 중간엽줄기세포주.
  54. 줄기세포를 주입하거나, 이식하거나 국소적으로 도포하여 1개 이상의 줄기세포를 투여하는 제1항의 중간엽줄기세포주.
  55. 줄기세포주 중에서 1개 이상의 줄기세포가 화상 치료, 피부 관리, 혈관형성, 맥관형성, 장기 또는 조직 치유, 화장품, 조직 염증, 세균감염, 상처 치료제, 당뇨병, 제약 제품 및 안과 제품, 흉터 감소, 모발 성장 자극, 면역 요법 활용 및 면역 교정(Immunocorrection) 요법, 피부, 골수 또는 장기 이식, 장기나 조직 치료에 사용되는 제2항의 중간엽줄기세포주.
  56. 줄기세포를 주입하거나, 이식하거나 국소적으로 도포하여 1개 이상의 줄기세포를 투여하는 제2항의 중간엽줄기세포주.
  57. 추가로 보존제 및 계면활성제가 포함된 제31항의 조성물.
  58. 추가로 보존제 및 계면활성제가 포함된 제39항의 조성물.
  59. 보존제는 1개 이상의 티메로솔, 크레졸, 포르말린, 벤잘코늄클로라이드 또는 벤질 알코올이고 계면활성제는 트리톤 X-100인 제58항의 조성물.
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