CN113373108A - 一种表皮干细胞扩增培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表皮干细胞扩增培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基的以下成分：胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱、棉子糖、甘氨酸亚铁、辅酶Q10、维生素E、复合氨基酸。本发明提供的培养基，无需添加滋养细胞共培养，通过添加胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱可显著提高表皮干细胞的增殖速率，提高培养获得的细胞数量。培养基中还添加棉子糖和甘氨酸亚铁，有助于表皮干细胞维持未分化的状态，保持细胞增殖活性，提高了细胞传代培养的效率。本本发明还提供了一种表皮干细胞扩增培养基的制备方法，过程简便，易于操作。本发明还提供了上述培养基在表皮干细胞扩增中的应用，实现了表皮干细胞在体外的大量扩增，在短时间内可收获大量表皮干细胞。

Description

一种表皮干细胞扩增培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种表皮干细胞扩增培养基及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是构成人体器官的最大器官，与外部环境直接接触，起到使人体免受包括有害微生物在内的多种有害因子和紫外线等外部刺激影响，有重要的保护膜作用，并且是对全身代谢所需的生化功能的维持必不可少的器官。在皮肤表皮中存在多种干细胞，其中表皮干细胞存在于皮肤最外侧的基底层中，是一类具有无限增殖能力，可增殖分化为表皮中各种功能细胞的细胞群。在表皮形成、表皮组织结构稳定和皮肤创伤愈合及各种皮肤疾病发生、发展过程中发挥重要作用。
随着生物学的发展，发现在受损皮肤和粘膜功能与结构的重建方面，表皮干细胞有着极其重要的作用。如在遗传性皮肤病的治疗中，要达到基因治疗目的，必须把目的基因导入表皮干细胞中，才能在患者整个机体皮肤中得到该基因的产物。在各种临床及科研应用中，均需要大量表皮干细胞，因此为了获得大量的表皮干细胞，表皮干细胞的体外扩增显得尤为重要。
现有表皮干细胞的体外扩增中存在诸多问题，如培养基成分复杂，需要滋养细胞共培养、稳定性差等，在临床应用中存在安全隐患，并且细胞增殖速度慢，短时间内无法获得足够数量的表皮干细胞等，细胞分化快，一般只能传代至P3-P5代，也限制了扩增得到的细胞数量。因此有必要对表皮干细胞的扩增培养基做出进一步改进，提供一种安全性高，稳定性好，可显著促进表皮干细胞扩增的培养基对表皮干细胞的临床应用显得尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种表皮干细胞扩增培养基，成分明确安全，稳定性好，能显著提高表皮干细胞的增殖效率。
本发明的目的之二在于提供一种表皮干细胞扩增培养基的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种上述培养基在表皮干细胞扩增培养中的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种表皮干细胞扩增培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基的以下成分：胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱、棉子糖、甘氨酸亚铁、辅酶Q10、维生素E、复合氨基酸。
进一步地，各组分在培养基中终浓度为：胸腺肽α1 2.5-3.2μg/mL、甘油磷脂酰胆碱1.8-2.7μg/mL、棉子糖3.0-5.5ng/mL、甘氨酸亚铁10-15ng/mL、辅酶Q10 1.5-3ng/mL、维生素E12-18μg/mL、复合氨基酸5-8μg/mL。
进一步地，各组分在培养基中终浓度为：胸腺肽α1 2.8μg/mL、甘油磷脂酰胆碱2.4μg/mL、棉子糖3.2ng/mL、甘氨酸亚铁12.5ng/mL、辅酶Q10 2.5ng/mL、维生素E15μg/mL、复合氨基酸6μg/mL。
进一步地，所述基础培养基为RPMI1640。
进一步地，所述复合氨基酸为谷氨酸、精氨酸、色氨酸、赖氨酸中的一种或多种。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述培养基的制备方法，包括以下步骤：向基础培养基中加入胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱、棉子糖、甘氨酸亚铁、辅酶Q10、维生素E、复合氨基酸，搅拌均匀，过膜除菌即得。
进一步地，采用0.22μm滤膜过滤除菌。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
上述培养基在表皮干细胞扩增中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种表皮干细胞扩增培养基，无需添加滋养细胞共培养，通过添加胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱可显著提高表皮干细胞的增殖速率，提高培养获得的细胞数量。
2、本发明的培养基中还添加棉子糖和甘氨酸亚铁，有助于表皮干细胞维持未分化的状态，保持细胞增殖活性，提高了细胞传代培养的效率。
3、本发明提供的培养基成分明确，不含异源物质，如动物血清、滋养细胞等，符合表皮干细胞临床应用的安全性要求。
4、本发明还提供了一种表皮干细胞扩增培养基的制备方法，过程简便，易于操作。
5、本发明还提供了上述培养基在表皮干细胞扩增中的应用，实现了表皮干细胞在体外的大量扩增，在短时间内可收获大量表皮干细胞。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种表皮干细胞扩增培养基，由基础培养基RPMI1640和添加在RPMI1640培养基的以下成分组成：胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱、棉子糖、甘氨酸亚铁、辅酶Q10、维生素E、复合氨基酸；各组分在培养基中终浓度为：胸腺肽α1 2.8μg/mL、甘油磷脂酰胆碱2.4μg/mL、棉子糖3.2ng/mL、甘氨酸亚铁12.5ng/mL、辅酶Q10 2.5ng/mL、维生素E15μg/mL、谷氨酸6μg/mL。
上述培养基的制备方法，包括以下步骤：向基础培养基中加入胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱、棉子糖、甘氨酸亚铁、辅酶Q10、维生素E、复合氨基酸，搅拌均匀，采用0.22μm滤膜过滤除菌即得。
实施例2
一种表皮干细胞扩增培养基，由基础培养基RPMI1640和添加在RPMI1640培养基的以下成分组成：胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱、棉子糖、甘氨酸亚铁、辅酶Q10、维生素E、复合氨基酸；各组分在培养基中终浓度为：胸腺肽α1 2.5μg/mL、甘油磷脂酰胆碱1.8μg/mL、棉子糖3.0ng/mL、甘氨酸亚铁10ng/mL、辅酶Q10 1.5ng/mL、维生素E12μg/mL、精氨酸2μg/mL、色氨酸3μg/mL。
上述培养基的制备方法和实施例1相同。
实施例3
一种表皮干细胞扩增培养基，由基础培养基RPMI1640和添加在RPMI1640培养基的以下成分组成：胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱、棉子糖、甘氨酸亚铁、辅酶Q10、维生素E、复合氨基酸；各组分在培养基中终浓度为：胸腺肽α1 3.2μg/mL、甘油磷脂酰胆碱2.7μg/mL、棉子糖5.5ng/mL、甘氨酸亚铁15ng/mL、辅酶Q10 3ng/mL、维生素E 18μg/mL、赖氨酸8μg/mL。
上述培养基的制备方法和实施例1相同。
对比例1
对比例1提供一种培养基，和实施例1的区别为：省去胸腺肽α1，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例1提供一种培养基，和实施例1的区别为：省去甘油磷脂酰胆碱，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种培养基，和实施例1的区别为：省去胸腺肽α1，将甘油磷脂酰胆碱的用量调整为5.2μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种培养基，和实施例1的区别为：省去甘油磷脂酰胆碱，将胸腺肽α1的用量调整为5.2μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种培养基，和实施例1的区别为：省去甘氨酸亚铁，将棉子糖的用量调整为15ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种培养基，和实施例1的区别为：省去棉子糖，将甘氨酸亚铁的用量调整为15ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例7
对比例7提供一种培养基，和实施例1的区别为：将甘氨酸亚铁替换为甘氨酸，其余均和实施例1相同。
对比例8
对比例8提供一种培养基，和实施例1的区别为：将棉子糖替换为海藻糖，其余均和实施例1相同。
试验例
表皮干细胞的制备：取健康的人皮肤组织，用手术刀切成1cm×1cm大小，用含双抗的PBS清洗3次，加入0.25%的中性蛋白酶孵育20h，将表皮和真皮分离，取分离的表皮加入0.05%胰蛋白酶在37℃的细胞培养箱中消化10min，加入完全培养基终止消化，将细胞悬液过滤后离心，取上清加入完全培养基重悬细胞，细胞密度为1×104个/cm2，接种在Ⅳ型胶原蛋白包被的培养皿上，在37℃，5%CO2的培养箱中培养，每3d换液一次，待细胞生长至80%汇合后，采用0.25%胰蛋白酶消化后，离心，去除上清，分别加入实施例1至3，对比例1至8中的培养基重悬细胞，细胞密度为1×105个/mL，在T25培养瓶中按照1:2的比例进行传代培养，每个培养瓶中培养基的体积为7mL，对培养的P6代细胞采用台盼蓝染色法统计细胞的总数，活细胞数，计算细胞的存活率，结果如表1所示。
表1
组别 存活率 细胞总数（×10<sup>5</sup>）
实施例1 98.32% 7242
实施例2 98.03% 7225
实施例3 97.89% 7239
对比例1 82.72% 4376
对比例2 85.61% 4599
对比例3 81.80% 4283
对比例4 84.39% 4472
对比例5 87.98% 5794
对比例6 90.15% 5945
对比例7 92.37% 6367
对比例8 93.70% 6691
由表1可以看出，实施例1至3中的表皮干细胞存活率高，经培养后细胞的数量远远高于对比例1至7。对比例1至4中分别省去胸腺肽α1和甘油磷脂酰胆碱中的一种，无论是否调整剩余组分的用量，细胞的数量均远远低于实施例1，并且细胞的存活率也有不同程度的下降，这是因为本发明在培养基中添加上述两种成分，可显著提高表皮干细胞的增殖速率，提高培养获得的细胞数量。对比例5至8中分别省去了棉子糖或者甘氨酸亚铁，并调整了剩余组分的用量，或者将甘氨酸亚铁替换为甘氨酸，将棉子糖替换为海藻糖后，细胞的总数和对比例1至4相比有所提升，但是和实施例1相比还是有一定程度的下降，说明棉子糖和甘氨酸亚铁在本发明的培养基中协同作用，有助于表皮干细胞维持未分化的状态，保持细胞增殖活性，提高了细胞传代培养的效率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种表皮干细胞扩增培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在基础培养基的以下成分：胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱、棉子糖、甘氨酸亚铁、辅酶Q10、维生素E、复合氨基酸。
2.根据权利要求1所述表皮干细胞扩增培养基，其特征在于，各组分在培养基中终浓度为：胸腺肽α1 2.5-3.2μg/mL、甘油磷脂酰胆碱1.8-2.7μg/mL、棉子糖3.0-5.5ng/mL、甘氨酸亚铁10-15ng/mL、辅酶Q10 1.5-3ng/mL、维生素E12-18μg/mL、复合氨基酸5-8μg/mL。
3. 根据权利要求2所述表皮干细胞扩增培养基，其特征在于，各组分在培养基中终浓度为：胸腺肽α1 2.8μg/mL、甘油磷脂酰胆碱2.4μg/mL、棉子糖3.2ng/mL、甘氨酸亚铁12.5ng/mL、辅酶Q10 2.5ng/mL、维生素E15μg/mL、复合氨基酸6μg/mL。
4.根据权利要求1至3任一项所述表皮干细胞扩增培养基，其特征在于，所述基础培养基为RPMI1640。
5.根据权利要求1所述表皮干细胞扩增培养基，其特征在于，所述复合氨基酸为谷氨酸、精氨酸、色氨酸、赖氨酸中的一种或多种。
6.如权利要求1至5任一项所述培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：向基础培养基中加入胸腺肽α1、甘油磷脂酰胆碱、棉子糖、甘氨酸亚铁、辅酶Q10、维生素E、复合氨基酸，搅拌均匀，过膜除菌即得。
7.根据权利要求6所述培养基的制备方法，其特征在于，采用0.22μm滤膜过滤除菌。
8.如权利要求1至5任一项所述培养基的应用，其特征在于，所述培养基在表皮干细胞扩增中的应用。
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