CN114317446A - 一种无血清培养基用添加剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种无血清培养基用添加剂及其应用。添加剂由瓜氨酸、L‑茶氨酸、牛磺酸、D‑半乳糖、棉子糖和N‑乙酰甘露糖胺组成。添加了该添加剂的无血清培养基可以使细胞在悬浮状态下快速生长，结合丁酸钠使用可促进293细胞表达高活性的重组蛋白，有助于在短期内获得大量的具有生物活性的重组蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无血清培养基用添加剂及其应用。
背景技术
人胚肾293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，其广泛应用于病毒包装、蛋白质表达等，是生物医药行业里常用的细胞系。人胚肾293细胞是人源细胞，其表达的蛋白的糖基化模式与人类的更为接近，因此，用293细胞制备的重组蛋白作为药物更有优势，或用于评价新药物或新医疗器械的靶向性更为准确。
动物血清作为哺乳动物细胞培养基的关键成分已被广泛应用，以牛血清为主。但动物血清价格高昂，可利用的血清量受气候、牛群健康状况、政治经济等因素影响，其次血清中各成分的含量和作用还未完全确定，不同批次的血清也不完全一样，难以实现实验程序和生产程序的标准化，而且可能存在病毒污染和抗生素污染，对细胞产生潜在的毒性，还增加了产物纯化的难度，甚至可能影响产物的药物学效应。为了解决这些问题，无血清培养基应运而生，其可以作为标准培养基，使用纯的组分及标准的培养基配方，便于工业生产过程的验证，且实验室之间可复制条件，重复及验证实验数据；还可以通过调节组分的类型和浓度改变培养基对细胞的功能。
无血清培养基主要包括氨基酸部分、维生素部分、无机盐和其他部分，如CN1908162A、CN101220347A公开了组成明确的无血清培养基。
目前已有多种商品化的适用于293细胞培养的无血清培养基，例如
293Serum-Free Medium(Merck),Pro293s-CDM(Lonza)、293-SFMII、CD 293 Medium、FreestyleTM 293 Expression Medium(Gibco)、HyClone SFMTransfx-293 medium(Cytiva),SMM 293TII(义翘神州)等。但是这些无血清培养基的价格较高，而且成分不公开，为优化蛋白质的表达方案、提高性能带来困难。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种无血清培养基添加剂及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种无血清培养基用添加剂，所述添加剂各组分在无血清培养基中的终浓度为：
| 组分 | 终浓度/mg/L |
| 瓜氨酸 | 20-200 |
| L-茶氨酸 | 0.1-5 |
| 牛磺酸 | 5-125 |
| D-半乳糖 | 10-900 |
| 棉子糖 | 100-500 |
| N-乙酰甘露糖胺 | 100-500 |
。
在一些实例中，所述添加剂各组分在无血清培养基中的终浓度为：
| 组分 | 终浓度/mg/L |
| 瓜氨酸 | 30-180 |
| L-茶氨酸 | 0.5-3.6 |
| 牛磺酸 | 20-120 |
| D-半乳糖 | 100-800 |
| 棉子糖 | 200-400 |
| N-乙酰甘露糖胺 | 150-360 |
。
本发明的第二个方面，提供：
一种无血清培养基，由基本培养基成分和本发明第一个方面所述的无血清培养基用添加剂组成。
在一些无血清培养基的实例中，所述基本培养基成分的组成为：
在一些无血清培养基的实例中，所述基本培养基成分的组成为：
本发明的第三个方面，提供：
一种细胞的无血清培养方法，其使用的无血清培养基如本发明第二个方面所述。
在一些细胞的无血清培养方法的实例中，所述细胞用于生产重组蛋白。
在一些细胞的无血清培养方法实例中，包括如下步骤：
S1)对细胞进行驯化，使其适应无血清培养基；
S2)将编码目的蛋白基因片段的表达载体导入细胞，以导入外源基因；
S3)导入外源基因24h后，加入适量链烷酸和/或链烷酸盐，继续培养；
S4)收集表达上清，分离、纯化得到重组蛋白。
在一些细胞的无血清培养方法的实例中，所述细胞为人胚肾293细胞。
在一些细胞的无血清培养方法的实例中，所述人胚肾293细胞为悬浮细胞。
在一些细胞的无血清培养方法的实例中，所述重组蛋白选自重组MICA、MICB、ULBP、NKG2D或IgE蛋白。
在一些细胞的无血清培养方法实例中，所述链烷酸为丁酸。
在一些细胞的无血清培养方法实例中，所述链烷酸盐为丁酸钠。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的无血清培养基用添加剂，成分明确，添加在无血清培养基中，可以显著提高蛋白的表达率，促进蛋白质的正确折叠，在短时间内获得大量有生物学活性的蛋白。
本发明一些实例的无血清培养基，成分明确，不含动物源性成分和血清中的生长抑制剂，成本低，可大规模生产，用于细胞培养时，可以显著提高蛋白的表达率，促进蛋白质的正确折叠，在短时间内获得大量有生物学活性的蛋白。
本发明一些实例的细胞无血清培养方法，通过添加适量链烷酸和/或其盐，特别是丁酸盐，更具体为丁酸钠，可以显著提高重组蛋白的产率和生物学活性。
附图说明
图1是293F细胞的增长曲线；
图2是293F细胞的存活率曲线；
图3是不同无血清培养基对重组蛋白表达量的影响；
图4是添加剂对重组蛋白活性的影响。
具体实施方式
下面结合实例和实验数据，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：
按本领域常规的配制方法配制293细胞无血清培养基，无血清培养基的基本培养基组成如下：
添加剂的组成如下：
| 组分 | 终浓度/mg/L |
| 瓜氨酸 | 180 |
| L-茶氨酸 | 3.6 |
| 牛磺酸 | 20 |
| D-半乳糖 | 800 |
| 棉子糖 | 400 |
| N-乙酰甘露糖胺 | 360 |
实施例2：
按本领域常规的配制方法配制293细胞无血清培养基，无血清培养基的基本培养基组成如下：
添加剂的组成如下：
| 组分 | 终浓度/mg/L |
| 瓜氨酸 | 30 |
| L-茶氨酸 | 0.5 |
| 牛磺酸 | 120 |
| D-半乳糖 | 100 |
| 棉子糖 | 200 |
| N-乙酰甘露糖胺 | 150 |
实施例3：293细胞在无血清培养基的驯化
S1)将冻存的悬浮293F细胞(Gibco)用293 SFM II(Gibco)复苏；
S2)将细胞置于125mL的锥形培养瓶中，在温度为37℃、二氧化碳浓度为8％的培养箱中以130rpm进行培养；
S3)当细胞密度达到2×106-3×106细胞/mL且细胞活率≥90％时，以3×105-6×105细胞/mL进行传代，传代3次后，从第4次传代开始，每次传代就增加20％实施例1或实施例2的培养基，同时将二氧化碳浓度以1％的比例逐步下降至5％；
S4)当培养基完全更换为实施例1或实施例2的培养基后，按上述方法继续传代，并测量细胞在对数生长期的倍增时间以及最大细胞密度，当倍增时间和最大细胞密度连续3代都稳定在一定水平后，驯化完成。
将适应实施例1、实施例2的293F细胞以3×105进行传代，分别置于不同的125mL锥形培养瓶中，添加对应的培养基进行培养，每隔24h从中取样，用0.4％的台盼蓝溶液进行染色，计算细胞密度和和细胞活率，绘制生长曲线和存活率曲线，如图1和图2。由图1和图2可知，驯化后的293F细胞在实施例1或实施例2的无血清培养基中均具有较好的悬浮生长速度。与实施例1相比，实施例2的无血清培养基，悬浮细胞可以更快的生长，可以更快满足生产需要。实施例1和实施例2的细胞存活率基本无区别。
实施例4：可溶性重组蛋白的表达
S1)以pcDNA3为表达载体，分别将C端带His×6标签的编码MICA、MICB、ULBP、NKG2D和IgE蛋白的cDNA序列连接到载体上(委托广州艾基生物技术有限公司合成)；
S2)获得含质粒的转化菌后，用LB液体培养基发酵，用QIAGEN EndoFree PlasmidKit处理菌液并提取质粒；
S3)取处于对数生长期的且存活率≥90％的293F细胞，用对应的培养基将细胞稀释至4×106细胞/mL，置锥形培养瓶中备用；
S4)以生理盐水为介质，以120μL/mL加入Polyjet(SignaGen)配制成A液，以40μg/mL加入质粒DNA配制成B液，在室温静置5min，将A、B液等比例混合后静置10min，再将转染复合物以1:20加入到配制好的293F细胞悬液中，置二氧化碳振荡培养箱中以130rpm进行悬浮培养；
S5)培养24小时后，加入1mM丁酸钠，以同样的条件继续培养48小时，以2000rpm离心10min收集表达上清，并用0.45μm滤膜进行过滤。
实施例5：可溶性重组蛋白的纯化
S1)用截留分子量为3.5KD的超滤管对表达上清进行超滤浓缩，并置换成1X PBS体系；
S2)取镍离子亲和层析填料于一次性层析柱中，先用5倍柱体积的纯化水冲洗填料，再用5倍柱体积的PBS溶液平衡填料；
S3)将处理后的表达上清加入层析柱，继续用10倍柱体积的1X PBS溶液平衡；
S4)用含500mM咪唑的PBS溶液洗脱蛋白，收集洗脱液，将洗脱液转移至3.5KD的超滤管，以4000rpm离心10分钟，再加入1X PBS，再离心，重复3-4次，使蛋白的缓冲体系置换成1X PBS，最后一次离心后，收集蛋白溶液。
用BCA法测蛋白浓度并计算蛋白产率，如图3，本发明的培养基与293 SFM II相比，用实施例1和实施例2的培养基制备的多种重组蛋白的产率均有不同程度的提升。
实施例6：可溶性重组蛋白的活性测试
(1)测试MICA、MICB、ULBP蛋白的活性：
S1)用碳酸盐缓冲液将NKG2D-Fc蛋白(百普赛斯)稀释至5μg/mL，以每孔100μL加入至96孔板中，在4℃包被过夜；
S2)用BSA溶液封闭后，用1X PBS溶液将实施例5中制备的MICA、MICB和ULBP蛋白稀释至5μg/mL，以100μL/孔加入，在37℃孵育2h；
S3)加入带HRP的抗His抗体并在37℃孵育2h，洗板；
S4)加入TMB底物溶液，室温孵育10分钟后加入1M硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读数。
(2)测试NKG2D蛋白的活性：
S1)用碳酸盐缓冲液将MICA-Fc蛋白(义翘神州)稀释至2μg/mL，以每孔100μL加入至96孔板中，在4℃包被过夜；
S2)用BSA溶液封闭后，用1X PBS溶液将实施例5中制备的NKG2D蛋白稀释至5μg/mL，以100μL/孔加入，在37℃孵育2h；
S3)加入带HRP的抗His抗体并在37℃孵育2h，洗板；
S4)加入TMB底物溶液，室温孵育10分钟后加入1M硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读数。
(3)测试IgE蛋白的活性：
S1)用碳酸盐缓冲液将人IgE受体蛋白(自制)稀释至5μg/mL，以每孔100μL加入至96孔板中，在4℃包被过夜；
S2)用BSA溶液封闭后，用1X PBS溶液将实施例5中制备的IgE蛋白稀释至5μg/mL，以100μL/孔加入，在37℃孵育2h；
S3)加入带HRP的抗His抗体并在37℃孵育2h，洗板；
S4)加入TMB底物溶液，室温孵育10分钟后加入1M硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读数。
以上实验的结果如图4，本发明的培养基与293 SFM II相比，用实施例1和实施例2的培养基制备的多种重组蛋白的活性均有不同程度的提升。
对比例1：本发明无血清培养基用添加剂对蛋白表达量和蛋白活性的影响
按照实施例1和实施例2的基本培养基配方配制293细胞无血清培养基，配制方法为本领域常规的配制方法。然后按实施例3对293F细胞进行驯化，按实施例4和5制备MICA、MICB、ULBP、NKG2D和IgE蛋白，按实施例6对蛋白活性进行评价。结果如图4所示，添加剂的缺失使重组蛋白的活性明显下降。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种无血清培养基用添加剂，所述添加剂各组分在无血清培养基中的终浓度为：
。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基用添加剂，其特征在于：所述添加剂各组分在无血清培养基中的终浓度为：
。
3.一种无血清培养基，由基本培养基成分和添加剂组成，其特征在于：所述添加剂如权利要求1或2所述。
4.根据权利要求3所述的无血清培养基，其特征在于：所述基本培养基成分的组成为：
5.根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于：所述基本培养基成分的组成为：
6.一种细胞的无血清培养方法，其特征在于：其使用的无血清培养基如权利要求3～5任一项所述。
7.根据权利要求6所述的无血清培养方法，其特征在于：所述细胞用于生产重组蛋白。
8.根据权利要求7所述的无血清培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1)对细胞进行驯化，使其适应无血清培养基；
S2)将编码目的蛋白基因片段的表达载体导入细胞，以导入外源基因；
S3)导入外源基因24h后，加入适量链烷酸和/或链烷酸盐，继续培养；
S4)收集表达上清，分离、纯化得到重组蛋白。
9.根据权利要求8所述的无血清培养方法，其特征在于：所述细胞为293细胞；优选的，所述293细胞为悬浮细胞。
10.根据权利要求8或9所述的无血清培养方法，其特征在于：所述重组蛋白选自重组MICA、MICB、ULBP、NKG2D或IgE蛋白。
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