RU1796676C - Способ получени рестриктирующей эндонуклеазы SaU 6782 - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи  и генна  инженери . Сущность изобретени : клетки Staphylococcus aureus 6782 культивируют в ферментере на среде, приготовленной на основе триптического гидролизата казеина и дрожжевой воды, и осаждают центрифугированием . Бактериальную массу суспенди- руют в рабочем буфере рН 7,4, содержащем 10 мМ К-фосфат, 7 мМ ft -меркаптоэтанол и 1 мМ ЭДТА, добавл ют лизостафин и инкубируют 20 мин при 20°С. Затем клеточную суспензию подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугируют при 105 тыс.д в течение 1 ч. Нэдбсадочна  жидкость представл ет собой грубый экстракт. Освобождают от нуклеиновых кислот с помощью сульфата стрептомицина. Высаливание белков провод т сульфатом аммони  (СА) 80% насыщени . Осадок раствор ют в рабочем буфере рН 9, диализуют от СА и нанос т на колонку с ФЦ-Р11, уравновешенную тем же буфером со скоростью 10 мл/ч. Колонку промывают трем  объемами буфера и фермент элюируют двойным комбинированным градиентом повышающейс  концентрации NaCI от 0,0 до 1,0 М и снижающихс  значений рН от 9 до 6. При этих услови х R sau 6782 элюируетс  узким пиком в области 0,4- 0,45 М NaCI, а неспецифические нуклеазы элюируютс  близкими концентраци ми NaC 0,45-0,55 М. Полученный препарат R sau 6782 содержит незначительное количество неспецифических примесей. Выход фермента составл ет 1300ед. из 1 г. биомассы . Активность - 2500 ед./мл. Удельна  активность - 60000 ед./мг. 2 ил. ел С 4 Ю О о 4 О

Description

Изобретение относитс  к микробиологии и генной инженерии и касаетс  способа получени  рестриктирующей эндонуклеазы (R) Sau 6782, котора  может быть использована в молекул рно-биологических и генетических экспериментах по изучению структуры и функций ДНК. а также в генной

инженерии дл  конструктировани  реком- бинантных молекул.

Целью изобретени   вл етс  упрощение способа, сокращение продолжительности процесса и повышение выхода целевого продукта.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что в способе получени  рестриктазы Sau 6782 катионообменную хромэтографию на фос- фоцеллюлозе РИ осуществл ют непосредственно после высаливани  белков с использованием двойного комбинированного градиента повышающейс  концентрации хлористого натри  от 0,0 до 1,0 М и снижающихс  значений рИ от 9 до 6.

За единицу активности препаратов рестриктазы принимают количество мкл фермента , вызывающих полный гидролиз 1 мкг ДНК фага Аза 1 ч инкубации при 37°С.

Реакцию рестрикций провод т в инкубационной смеси объемом 30 мкл следующего состава: 0,06 М трис-HCI рН 7,5, 0,015 М MgCi2 0,06 М NaCI, 7мМ / -меркаптоэта- нола, 1 ЕД рестриктазы, 1 м кгДНКфагаА,

Рестриктазную активность тестируют при горизонтальном электрофорезе в 1 % агарозном геле. Гель окрашивают раствором этиди  бромида в концентрации 3 м кг/мл 20 мин и фотографируют в ультрафиолетовом свете при 254 нМ с красным светофильтром ..

Удельна - активность выражаетс  в единицах активности на 1 мг белка. Концентрацию белка определ ют спектррфото- метричееки.

Примеры конкретного осуществлени  способа.

Приме р 1. Клетки S/aureus 6782 культивируют в ферментере на среде, приготовленной на основе триптическогогид- ролизата казеина и дрожжевой воды, и осаждают центрифугированием. Бактериальную массу суспендируют в рабочем буфере (РБ) рН 7,4, содержащем 10 мМ К-фосфат, 7 мМ Р -мёркаптоэтанол и 1 м М ЭДТА, добавл ют лизостафин и инкубируют 20 мин при 20°С, Полученную клеточную суспензию подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугируют при 105 тыс. g 1 ч.Надйсадочна  жидкость представл ет, собой грубый экстракт. Освобождение от нуклеиновых кислот осуществл ют с помощью сульфата стрептомицина. Высалива- н ие белков провод т сульфатом аммони  (СА) 80% насыщени . Осадок раствор ют в РБ рН 9 до конечной концентрации 2 мг/мл, диалйзуют от СА и нанос т на колонку 1,2x10 см с ФЦ, уравновешенную тем же буфером со скоростью 10мл/ч. Колонку промывают трем  объемами РБ и элюируют фермент двойным комбинированным градиентом повышающейс  концентрации NaCI от 0,0 до .1,0 М и снижающихс  значений рН от 9 до 6. Объем градиента 80 мл, собираемой фракции 4 мл. Рестриктаза

элюируетс  узким пиком в области 0,4-0.45 М NaCI, а неспецифические нуклеазы - близкими концентраци ми NaCI 0,45-0,55 М (фиг. 1, пример 1),

5Полученный препарат R Sau 6782 содержит незначительное количество неспецифических : примесей. Выход фермента составл ет 1300 ЕД из 1 г биомассы. Активность - 250 ЕД/мл. Удельна  активность

0 60000 ед/мг.

П р и ме р 2. Культивирование клеток, их разрушение, получение грубого экстракта , освобождение от нуклеиновых кислот и высаливание белков ведут, как в примере 1.

5 Осадок раствор ют в рабочем буфере рН 8 до конечной концентрации 2 мг/мл, диализуют против РБ и нанос т на колонку 1,2x10 см с ФЦ, уравновешенную тем же буфером СО скоростью 10. мл/ч. Колонку промывают

0 трем  объемами буфера и фермент элюируют двойным комбинированным градиентом повышающейс  концентрации NaCI от 0,0 до 1,0 Ми снижающихс  значений рН от 8 до 7. При этих услови х рестрикта за элюи5 - руетс  0x4-0,5 М NaCI и отдел етс  от неспецифических нуклеаз, обнаруживаемых в зоне 0,55-0,65 М NaGI с хорошим разрешением . :: : ;.. ..- / -.;..- ;. ; Полученный таким способом препарат

0- R Sau 6782 полностью свободен от неспецифических примесей И пригоден дл  любых видов структурных исследований. Выход фермента 1500 ЕД на 1 г биомассы. Удельна активность 70000 ЕД/мг. Активность

5 3000 ЕД/мл. ;::

Пример 3. Все этапы вплоть до хроматографической очистки, как в примере

1. Ферменты элюируют градиентом повышающейс  концентрации NaCI от 0,0 до 1,0

0 Ми понижающихс  значений рН от 7,5 до 7. При этих услови х рестриктаза элюируетс  0,40-0.55 М NaCI, а неспецифические нуклеазы - 0,50-0,65 М NaCI. Следовательно, в услови х более пологого градиента пики

5 оказываютс  размытыми и эффективного разделени  ферментов не происходит. В

препарате R Sau 6782 содержатс  примеси нуклеаз. Выход фермента 1200 ед/г. Активность 2000 ёд/мл. Удельна  активность 0 55000 ед/мг.

Дл  стандартной процедуры выделени  фермента был выбран пример 2.

Доказательства высокой степени чистоты ферментного препарата получены при 5 использовании современных тестов (фиг.2). Тестирование экзонуклеазных примесей осуществл лось по степени лигирова- ни  фрагментов рестрикции. Полученные в результате гидролиза A Sau 6782 фрагменты ДНК фага Алигировались ДНК-лйгазой фага Т4 с эффективностью более 90%. Однако абсолютные доказательства отсутстви  следовых количеств экзонуклеаз в препарате R Sau 6782 получены при инкубации 14-член- ного синтетического меченого 32Р олиго- нуклеотида (ОНД), не имеющего сайта узнавани  дл  исследуемого фермента, с R Sau 6782. При инкубации ОНД с R в течение 18 ч на радиоавтограмме была получена лишь исходна  полоса, что свидетельствует об исчерпывающем освобождении фермента от сопутствующих экзонуклеаз.

Тестирование неспецифических эндо- нуклеазных примесей проводили путём длительной в течение 36 ч инкубации ДНК фага Я с избытком ферментного препарата. Различий со стандартной картиной гидролиза не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии неспецифических эндонуклеаз в препарате фермента.

Полученный таким способом препарат R Sau 6782 полностью свободен от неспецифических примесей и пригоден дл  любых видов структурных исследований. Выход фермента 1500 ЕД на 1 г биомассы, Удель- на  активность 70 тыс. ед/мг белка. Активность 3 тыс. ЕД/мл. Препарат хранитс  при -20°С в течение 3 лет без потери активности.

Сравнение показателей ферментного препарата R Sau 6782, полученных по пред-

латаемому способу и прототипу, представлено в таблице. Как видно из таблицы, предлагаемый способ позвол ет увеличить выход и активность R Sau 6782 в 1,5 раза, а также повысить его стабильность при хранении . Кроме того, предлагаемый способ более простой и технологичный и требует меньше времени дл  реализации.

Формул а изобретени   Способ получени  рестриктирующей эндонуклеазы Sau 6782, включающий культивирование продуцирующего микроорганизма Staphyfococcus aureus 6782, обработку бактериальной массы лизоста- фином. ультразвуковую дезинтеграцию, удаление нуклеиновых кислот сульфатом стрептомицина, высаливание белков сульфатом аммони , катионообменную хрома- тографию на фосфоцеллюлозе Р II, о т л и- ча ю щ и и с   тем, что, с целью упрощени  способа, сокращени  продолжительности процесса и повышени  выхода целевого продукта , катионообменную хррматографию на фосфоцеллюлозе Р II осуществл ют непосредственно после высаливани  белкое с использованием двойного комбинированного градиента повышающейс  концентрации хлористого натри  от 0,0 до 1,0 М и снижающихс  значений рН от 9,0 до 6.0.

Характеристика препарата R Sau 6782

Тестирование примесей нсспецифйческих нуклеаэ в препарате RЈvo782.. :-аУлкгирс-8ание фрагментов рестрикции /электрофорез в агарозе/

-I фага /контроль/ ,

2 трек- фрагментыДЬК фга после гидролиза R 5782.

3 трек- лигироБ н-ле фрагмс-нтс13 рсстр икции ДИК-лйгазой фага Тг

б/ Тест/ с тЬ ческкм меченые слйгонуклеотидом.

I -Wffl±S S«. . « 32Р ИНД /король/

2 трек- СЬД после инкубации с R Ј /о762 в течение 18 часов.