RU1771484C - Способ выделени двухферментного биокатализатора дл получени нуклеозидов - Google Patents
Способ выделени двухферментного биокатализатора дл получени нуклеозидовInfo
- Publication number
- RU1771484C RU1771484C SU904779881A SU4779881A RU1771484C RU 1771484 C RU1771484 C RU 1771484C SU 904779881 A SU904779881 A SU 904779881A SU 4779881 A SU4779881 A SU 4779881A RU 1771484 C RU1771484 C RU 1771484C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sephadex
- phosphodiesterase
- isolation
- enzyme
- nucleosides
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Использование: биохими , очистка белков . Сущность изобретени : очистку лиофи- лизата да кобры осуществл ют методом колоночной гель-фильтрации на сефадексе G-75, упакованном в два сло - верхний основной слой, состо щий из сефадекса марки сверхмелкий, и нижний вспомогательный слой толщиной не менее 1 см, состо щий из сефадекса с размером частиц 40-120 мкм. 1 табл., 1 фиг.
Description
Изобретение относитс к области биотехнологии и может быть использовано дл выделени ферментов-фосфодиэстеразы и 5 -нуклеотидазы из да кобры с целью производства с их помощью нуклеозидоз.
Известен способ выделени фосфоди- эстеразы и 5 -нуклеотидазы из да кобры, осуществл емый путем диализа раствора 1,5 г да с последующей гель-фильтрацией диализата на колонке (3x117 см) с сефадек- сом G-75 (сверхмелким), при этом диализ идет 18 часов, гель-фильтраци 35 ч (скорость элюции 6,9 мл/час) 1. Выход фосфоди- эстеразы 7%; удельна активность в 2-х ферментном биокатализаторе 5 -нуклеотидазы равна 1350 ед/мг белка, фосфодиэсте- разы - 220 ед/мг белка. Недостатки: невысокий выход лимитирующего фермента - фосфодиэстеразы, длительность процесса .
Целью изобретени вл етс увеличение выхода фосфодиэстеразы и сокращение времени процесса.
Поставленна цель достигаетс предлагаемым способом выделени двухфермент- ного биокатализатора (фосфодиэстеразы и 5 -нуклеотидазы) из да кобры, по которому очистку буферного раствора сухого да кобры провод т методом гель - фильтрации на колонке, заполненной сефадексом в два сло , причем нижний слой имеет толщину не менее 1 см и состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 40-120 мкм, а верхний - толщиной 8,4-9,4 диаметра колонки, состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 10-40 мкм.
Чертеж по сн ет предлагаемый способ .
Отличительные признаки от прототипа:
-гель-фильтрацию провод т без предварительного диализа;
-колонку дл гель-фильтрации заполн ют гелем на высоту, равную 8.4- 9,4 ее диаметров;
-перед наполнением в колонке предварительно подслаивают тонкую (1 см) поN vi
Ь 00
W
душку из крупного сефадекса G-75 (с диаметром гранул 40-120 мкм).
Предлагаемый способ иллюстрируетс примерами.
Пример 1. Выделение фосфодиэсте- разы и 5 -нуклеотидазы провод т при 4-6°С. 1,5 г сухого да кобры раствор ют в 20 мл буфера А (0,05 М трис-сукцинат, рН 5,6) и нанос т на колонку К 50/60 (Pharmacia, Швеци ), заполненную на 47 см (1:9,4) сефа- дексом G-75 (сверхмелким), наслоенным на 1 см подушку из сефадекса G-75 с диаметром гранул 40-120 мкм, уравновешенную буфером А. Элюцию осуществл ют буфером А со скоростью 24 мл/час. Во фракци х, собираемых каждые 15 мин,, определ ют активность фосфодиэетеразы и 5 -нукле- отизады по методу (1). Фракции 32-39, содержащие элюирующиес совместно фосфодиэстеразу и 5 -нуклеотидазу, объе- дин ют(объем 48 мл), измер ют в них содержание ферментов и белка (см. таблицу) и концентрируют диализом против 50% глицерина или лиофилизуют.
.Пример 2. При соблюдении условий примера 1 заполн ют на 42 см (1:8,4). Выход целевых объектов аналогичен примеру 1.
Пример 3. При уменьшении высоты заполнени до 41 см (1:8,2) и соблюдении других условий по примеру 1 снижаетс степень очистки ферментов на 10 %.
Пример 4. При увеличении высоты до 48 см (1:9,6) выход ферментов снижаетс на 5 %, степень очистки сохран етс аналогично примеру 1.
Пример 5. При соблюдении условий примера 1 подушку наслаивают толщиной 1.5 см. Результаты аналогичны примеру 1.
Пример 6. Декарибоадениловую кислоту (рА)10 инкубировали с двухфермен- тным биокатализатором, выделенным из да кобры, как описано в примере 1. Реакцию проводили в объеме 0,5 мл при комнатной температуре, в течение 5 мин.
Концентрации компонентов полученной реакционной смеси: (рА)ю - 5,0
ав2бо/мл; трис-НОбуфера (рН 8,5) - 0,1 М, MgCIa - 5 мМ, биокатализатора - 8,9 мкг/мл. Реакцию останавливали кип чением реакционной смеси в течение 2 мин. Пробу
анализировали методом микроколоночной хроматографии (см. чертеж).
Как видно из чертежа, за 5 мин гидроли- зуетс 20.7% фосфодиэфирных св зей субстрата (активность фосфодиэетеразы). За
0 это же врем 47,7% рА превращаетс в А (активность 5 -нуклеотидэзы).
Таким образом, активность содержащейс Ё двухферментном биокатализаторе 5 -нуклеотидазы в 2,3 раза выше активности
5 фосфодиэетеразы, т.е. лимитирующим ферментом вл етс фосфодиэстераза.
Технико-экономические преимущества перед базовым объектом (1). Указанные отличительные признаки в совокупности с из0 вестными обеспечивают: увеличение выхода фосфодизстеразы до 86%, т.е. в 12,3 раза; сокращение времени выделени ферментов с 53 до 10 ч. (т.е. в 5,3 раза); исключена стади диализа; а скорость элюции при
5 гель-фильтрации увеличиваетс до 24 мл/ч. Двухферментный биокатализатор содержит в 12,3 рази больше лимитирующего фермен- та-фосфодиэстеразы, что позвол ет гидро- лизовать до нуклеозидов е 12,3 раза больше РНК (ДНК).
Ф о р м у л а л з о б р е т е н и Способ выделени двухферментного биокат лизатора дл получени нуклеози5 дов, включающий очистку буферного раствора сухого да кобры, отличающий- с тем, что, с целью упрощени способа и повышени выхода по активности, очистку провод т методом гельфильтрации на ко0 лонке, заполненной сефадексом в два сло , причем нижний слой имеет толщину не менее 1 см и состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 40-120 мкм, а верхний слой толщиной 8,4-9,4 от диаметра колонки
5 состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 10-40 мкм.
Выделение ферментов из да кобры
QO
W.I 91 7:54 0
тг
10.0
20.0
25.0
260м-280мм-
НШ.5 /ЮТШСЕ
ЮО200
тг
iL
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904779881A RU1771484C (ru) | 1990-01-09 | 1990-01-09 | Способ выделени двухферментного биокатализатора дл получени нуклеозидов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904779881A RU1771484C (ru) | 1990-01-09 | 1990-01-09 | Способ выделени двухферментного биокатализатора дл получени нуклеозидов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1771484C true RU1771484C (ru) | 1992-10-23 |
Family
ID=21490291
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904779881A RU1771484C (ru) | 1990-01-09 | 1990-01-09 | Способ выделени двухферментного биокатализатора дл получени нуклеозидов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU1771484C (ru) |
-
1990
- 1990-01-09 RU SU904779881A patent/RU1771484C/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1976, гл. 5.v Василенко С.К., Райт В.К. Метод выделени высокоочищенной рибонуклеазы из да среднеазиатской кобры. - Биохими , 1975, т. 40, №3, с. 578-583. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Smith et al. | More mutant tyrosine transfer ribonucleic acids | |
Rock et al. | Improved purification of acyl carrier protein | |
Remy et al. | Purification of yeast phenylalanyl-tRNA synthetase by affinity chromatography, on a tRNAPhe-sepharose column | |
JPS62223197A (ja) | アルフア−1−抗プロテア−ゼ精製 | |
Allan et al. | Human pancreatic proteins: Amylase, proelastase, and trypsinogen | |
Jordan et al. | Sequence and conformation of 5 S RNA from Chlorella cytoplasmic ribosomes: comparison with other 5 S RNA molecules | |
Sulkowski et al. | Venom exonuclease (phosphodiesterase) immobilized on concanavalin-A-sepharose | |
RU1771484C (ru) | Способ выделени двухферментного биокатализатора дл получени нуклеозидов | |
De Jong et al. | Haemoglobin Babinga (δ 136 Glycine→ Aspartic acid): a new delta chain variant | |
Alhadeff et al. | Carbohydrate composition of purified human liver α-l-fucosidase | |
KR19990081593A (ko) | 신규한 면역증강활성 다당류물질 및 그 제조방법 | |
RU2186849C2 (ru) | Способ очистки тромбиноподобной протеазы из змеиного яда | |
JPS60217894A (ja) | 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 | |
Pace et al. | Purification of ribonuclease T1 | |
SU1232148A3 (ru) | Способ получени инсулина человека | |
Yamasaki et al. | Three forms of α-glucosidase from suspension-cultured rice cells | |
MINATO et al. | Crystallization of ribonuclease T1 | |
JPH01281082A (ja) | ノイラミニダーゼ・アイソザイムs及びガングリオシド類の製造法 | |
JPH03500366A (ja) | 低分子量キシラナーゼ糖タンパク質 | |
US5698104A (en) | Purification process for hirudin using affinity chromatography | |
MAENO et al. | Studies on Habu Snake Venom IV. Fractionation of Habu Snake Venom by Chromatograpy on CM-Cellulose | |
JPH0198485A (ja) | 微生物による−α−N−アセチルガラクトサミニダーゼの製造法 | |
RU1796676C (ru) | Способ получени рестриктирующей эндонуклеазы SaU 6782 | |
SU1489186A1 (ru) | Cпocoб пoлучehия ц a m ф-cbязыbaющeгo бeлka бaktepий | |
JPS62122588A (ja) | 純コンドロイチナ−ゼの製造法 |