SU1232148A3 - Способ получени инсулина человека - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к биохи в частности к получению инсулина ловека полусинтетическим путем.

Цель изобретени  - повышение стоты и упрощение способа получе инсулина человека за счет испольвани  модифицированного инсулина общей формулы.

дез(ВЗО)-инсулин- NH-CH-C-R

нс-сн.

I

он

где R - фенилаланил-фенилаланин, который подвергают обработке карбок- |5

сипептидазой А, специфически отщепл - -phe-phe выдел ют хроматографическим ющей « Пример 2. ДАЙ раствор ют в среде, состо щей на 60% из органической фракции (см. пример 1) и на 40% из 0,5 М трис-НС1 буфера до концентрации 32,2 г/л. Затем в этой среде раствор ют трипептид thr-phe-phe-HCl до концентрации 0,047 М. С помощью . 0,1 М раствора NaOH довод т рН полученной смеси до 6,5. После этого в раствор ввод т иммобилизованньА на силикагеле трипсин до концентрации 157 г/ли реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 3ч. ДАИ-thrостаток R с образованием инсулина человека.

Способ осуществл етс  следующим об-, разом.

Пример 1.В качестве исходного соединени  используетс  дез (ВЗО)- -инсульта (ДАЙ), получаемый из инсулина свиньи по методу Schmitt. Сначала провод т св зывание ДАЙ с три- пептидом thr-phe-phe. В качестве реакционной среды используют смесь, состо щую на 67% из органической фракции (смесь диметилформамида и этанола 1:1) и на 33% из 0,5 М трис-НС1 буфера. В этой среде раствор ют навеску ДАЙ до концентрации 13,6 г/л и навеску трипептида до концентрации 0,067 М. С помощью 0,1 М раствора NaOH довод т рН полученной смеси до 6,5. Затем в раствор ввод т трипсин

до концентрации 5 г/л и реакционную смесь инкубируют при в течение 35 мин. ДАИ-thr-phe-phe вьздел ют из реакционной системы хроматографическим способом и подвергают лиофили- зации. Выход составл ет 54%. ДАИ-thr- phe-phe раствор ют в 0,2 М растворе бикарбоната аммони  с рН 8,5 до кон20

30

способом и подвергают лиофилизации. Выход препарата 27%; Превращение ДАИ- -thr-phe-phe в инсулин человека и наделение инсулина провод т аналогично примеру 1.

Пример 3. ДАЙ раствор ют в среде, составленной по примеру 2, до концентрации 25,2 г/л. Затем рас- твор ют трипептид thr-phe-phe-HCl до концентрации 0,037 М. С помощью 0,1 М раствора NaOH довод т рН полученной смеси до 6,3. После этого в раствор ввод т иммобилизованную на силикагеле лизилэндопептидазу до концентрации 77 г/л и реакционную смесь инкубир5гют при 37°С в течение 48 ч, ДАИ-thr-phe-phe вьщел ют хроматографическим способом и подвергают лиофилизации. Выход препарата 38%. Превращение ДАИ-thr-phe-phe в инсулин человека и ввделение инсулина провод т по примеру Г.

Идентичность получаемого препарата с инсулином человека подтверждена данными аминокислотного анализа, свидетельствующего о полном соответствии аминокислотного состава, получаемого препарата и инсулина челове35

40

цеитрации 2,8 мг/мл. К этому раствору 45 ка. Высока  чистота (гомогенность)

добавл ют 2 мкл (2,3 Е) карбоксипеп- тидазы. Ферментативную реакцию останавливают через 30 мин путем добавлени  равного объема 0,5 М раствора лимонной кислоты. Образующийс  инсу-phe-phe выдел ют хроматографическим

ЛИН человека вьщел ют с помощью кристаллизации .

Пример 2. ДАЙ раствор ют в среде, состо щей на 60% из органической фракции (см. пример 1) и на 40% из 0,5 М трис-НС1 буфера до концентрации 32,2 г/л. Затем в этой среде раствор ют трипептид thr-phe-phe-HCl до концентрации 0,047 М. С помощью . 0,1 М раствора NaOH довод т рН полученной смеси до 6,5. После этого в раствор ввод т иммобилизованньА на силикагеле трипсин до концентрации 157 г/ли реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 3ч. ДАИ-thr-phe-phe выдел ют хроматографическим

0

0

способом и подвергают лиофилизации. Выход препарата 27%; Превращение ДАИ- -thr-phe-phe в инсулин человека и наделение инсулина провод т аналогично примеру 1.

Пример 3. ДАЙ раствор ют в среде, составленной по примеру 2, до концентрации 25,2 г/л. Затем рас- твор ют трипептид thr-phe-phe-HCl до концентрации 0,037 М. С помощью 0,1 М раствора NaOH довод т рН полученной смеси до 6,3. После этого в раствор ввод т иммобилизованную на силикагеле лизилэндопептидазу до концентрации 77 г/л и реакционную смесь инкубир5гют при 37°С в течение 48 ч, ДАИ-thr-phe-phe вьщел ют хроматографическим способом и подвергают лиофилизации. Выход препарата 38%. Превращение ДАИ-thr-phe-phe в инсулин человека и ввделение инсулина провод т по примеру Г.

Идентичность получаемого препарата с инсулином человека подтверждена данными аминокислотного анализа, свидетельствующего о полном соответствии аминокислотного состава, получаемого препарата и инсулина челове5

0

получаемого препарата инсулина человека доказана методом жидкостной хроматографии высокого давлени  (один основной пик при времени удержани  1089).

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты и упрощения способа, модифицированный инсулин человека общей формулы

   О дез(ВЗО)-инсулин-nh-CH-C-R нс-сн.

   I

   ОН · где R - фенилаланил-фенйлаланин, подвергают обработке'карбоксипептидазой А с последующим выделением целевого продукта.

   g со

   У·» 1232148 АЗ ¹ 1232