JPH0735399B2 - 変性ヒトインシュリン - Google Patents
変性ヒトインシュリンInfo
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- JPH0735399B2 JPH0735399B2 JP4290556A JP29055692A JPH0735399B2 JP H0735399 B2 JPH0735399 B2 JP H0735399B2 JP 4290556 A JP4290556 A JP 4290556A JP 29055692 A JP29055692 A JP 29055692A JP H0735399 B2 JPH0735399 B2 JP H0735399B2
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- Japan
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- insulin
- human insulin
- amino acid
- ester
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】本発明は、新規な変性ヒトインシュリンに
関するものである。
関するものである。
【０００２】血液中のインシュリン欠乏の結果生ずる低
血糖症（糖尿病）は、たとえば注射により或いは投与用
ポンプを用いてインシュリンを投与することにより処置
することができる。この目的には、たとえば豚または牛
のような動物の膵臓から単離されたインシュリンが使用
される。
血糖症（糖尿病）は、たとえば注射により或いは投与用
ポンプを用いてインシュリンを投与することにより処置
することができる。この目的には、たとえば豚または牛
のような動物の膵臓から単離されたインシュリンが使用
される。
【０００３】この種のインシュリン製剤は、或る場合に
は抗原性もしくはアレルギー性の活性を示す。これは一
部、不純物［たとえばプロインシュリン、その部分分解
生成物、アルギニン−インシュリン、インシュリン−エ
チルエステル、モノデアミノ−インシュリンまたはイン
シュリン集合体（アグレゲート）］が存在する結果とし
て生ずる。さらに、抗原性の活性は動物インシュリンと
ヒトインシュリンとの間の構造上の差に関するものであ
り、その結果動物から得られる蛋白質は人体により拒否
される。たとえば、豚とヒトのインシュリンは１個のア
ミノ酸、すなわちいわゆるＢ−連鎖のカルボキシ末端ア
ミノ酸が異なっている。このいわゆるＢ３０アミノ酸
は、豚インシュリンにおいてはアラニンであるが、ヒト
インシュリンにおいてはスレオニンである。
は抗原性もしくはアレルギー性の活性を示す。これは一
部、不純物［たとえばプロインシュリン、その部分分解
生成物、アルギニン−インシュリン、インシュリン−エ
チルエステル、モノデアミノ−インシュリンまたはイン
シュリン集合体（アグレゲート）］が存在する結果とし
て生ずる。さらに、抗原性の活性は動物インシュリンと
ヒトインシュリンとの間の構造上の差に関するものであ
り、その結果動物から得られる蛋白質は人体により拒否
される。たとえば、豚とヒトのインシュリンは１個のア
ミノ酸、すなわちいわゆるＢ−連鎖のカルボキシ末端ア
ミノ酸が異なっている。このいわゆるＢ３０アミノ酸
は、豚インシュリンにおいてはアラニンであるが、ヒト
インシュリンにおいてはスレオニンである。
【０００４】したがって、豚インシュリンはこのＢ３０
アミノ酸をスレオニンで交換することによりヒトインシ
ュリンに変換することができ、これを行なうための多く
の方法が知られている。
アミノ酸をスレオニンで交換することによりヒトインシ
ュリンに変換することができ、これを行なうための多く
の方法が知られている。
【０００５】勿論、殆ど全ての公知方法はＢ３０アミノ
酸を除去することから出発し、豚インシュリンの場合は
したがってアラニンが除去される。この結果、デス（Ｂ
３０）インシュリン［これはしばしばデス（Ａｌａ）イ
ンシュリン、簡単にはＤＡＩと呼ばれる］が生ずる。そ
の後の工程については、ヒトインシュリンの生成をもた
らす多くの方法が知られている。これらはスレオニンの
酵素的もしくは非酵素的に結合させることを包含するも
のであり、この場合カルボキシル基をたとえばエステル
によりデス（Ｂ３０）インシュリンに対し保護する。こ
の保護基はスレオニンの結合後に除去されねばならな
い。一般に使用される保護基は第３ブトキシ基であり、
これを除去するには特に極端なｐＨのような極めて過酷
な反応条件が必要とされ、これはインシュリン分子の残
部にも影響を及ぼす。その結果、インシュリンの部分的
分解生成物が生じ、これは所望生成物すなわちヒトイン
シュリンから実質的に分離することができない。したが
って、極めて不純なインシュリン製剤が得られる。さら
に、初期の段階において、スレオニン結合工程実施後の
反応混合物から反応生成物および未反応デス（Ｂ３０）
インシュリンを分離することを含む精製工程に大きな問
題がある。この分離では、特に大規模の製造に際し、極
めて大きな損失を伴なわない限り、大して純粋でない物
質が生ずるのである。
酸を除去することから出発し、豚インシュリンの場合は
したがってアラニンが除去される。この結果、デス（Ｂ
３０）インシュリン［これはしばしばデス（Ａｌａ）イ
ンシュリン、簡単にはＤＡＩと呼ばれる］が生ずる。そ
の後の工程については、ヒトインシュリンの生成をもた
らす多くの方法が知られている。これらはスレオニンの
酵素的もしくは非酵素的に結合させることを包含するも
のであり、この場合カルボキシル基をたとえばエステル
によりデス（Ｂ３０）インシュリンに対し保護する。こ
の保護基はスレオニンの結合後に除去されねばならな
い。一般に使用される保護基は第３ブトキシ基であり、
これを除去するには特に極端なｐＨのような極めて過酷
な反応条件が必要とされ、これはインシュリン分子の残
部にも影響を及ぼす。その結果、インシュリンの部分的
分解生成物が生じ、これは所望生成物すなわちヒトイン
シュリンから実質的に分離することができない。したが
って、極めて不純なインシュリン製剤が得られる。さら
に、初期の段階において、スレオニン結合工程実施後の
反応混合物から反応生成物および未反応デス（Ｂ３０）
インシュリンを分離することを含む精製工程に大きな問
題がある。この分離では、特に大規模の製造に際し、極
めて大きな損失を伴なわない限り、大して純粋でない物
質が生ずるのである。
【０００６】しかしながら、本発明によれば、収率を減
少させるような多くの分離および精製工程を用いること
なく、高純度のヒトインシュリンを製造することができ
る。
少させるような多くの分離および精製工程を用いること
なく、高純度のヒトインシュリンを製造することができ
る。
【０００７】本発明による方法は、一般式：
【０００８】
【化２】
【０００９】［式中、ＲはＨまたは酵素的に分離しうる
糖残基もしくはそのエステルであり、Ｒ1 は酵素的に分
離しうる糖残基もしくはそのエステル、またはアミノ酸
もしくはペプチド、または該アミノ酸もしくはペプチド
のアミドもしくはエステルであり、またはＲ1 は、Ｒが
ＨでなければＯＨである］の変性ヒトインシュリンか
ら、上記Ｒおよび／またはＲ1 により規定された糖およ
び／またはアミノ酸もしくはペプチドを酵素的に分離し
て天然ヒトインシュリンを生成させ、その後にヒトイン
シュリンを媒体から単離することを特徴とするものであ
る。
糖残基もしくはそのエステルであり、Ｒ1 は酵素的に分
離しうる糖残基もしくはそのエステル、またはアミノ酸
もしくはペプチド、または該アミノ酸もしくはペプチド
のアミドもしくはエステルであり、またはＲ1 は、Ｒが
ＨでなければＯＨである］の変性ヒトインシュリンか
ら、上記Ｒおよび／またはＲ1 により規定された糖およ
び／またはアミノ酸もしくはペプチドを酵素的に分離し
て天然ヒトインシュリンを生成させ、その後にヒトイン
シュリンを媒体から単離することを特徴とするものであ
る。
【００１０】式（Ｉ）により示される変性ヒトインシュ
リンは、デス（Ｂ３０）インシュリンへ式 II ：
リンは、デス（Ｂ３０）インシュリンへ式 II ：
【００１１】
【化３】
【００１２】の化合物を結合させるか、或いはデス（Ｂ
２９，Ｂ３０）インシュリンへ式 III：
２９，Ｂ３０）インシュリンへ式 III：
【００１３】
【化４】
【００１４】［式中、ＲおよびＲ1 は上記両化合物にお
いて上記した意味を有する］の化合物を結合させること
によって有利に製造することができる。
いて上記した意味を有する］の化合物を結合させること
によって有利に製造することができる。
【００１５】デス（Ｂ３０）インシュリンは、Ｂ３０ア
ミノ酸以外は全ゆる点でヒトインシュリンと同一の動物
インシュリンを適当な酵素たとえばカルボキシペプチダ
ーゼＡによって、またはアクロモバクター・リチクス
（Achromobacter lyticus ）からのリシルエンドペプチ
ダーゼによって処理することにより別途に製造すること
ができる。
ミノ酸以外は全ゆる点でヒトインシュリンと同一の動物
インシュリンを適当な酵素たとえばカルボキシペプチダ
ーゼＡによって、またはアクロモバクター・リチクス
（Achromobacter lyticus ）からのリシルエンドペプチ
ダーゼによって処理することにより別途に製造すること
ができる。
【００１６】しかしながら、デス（Ｂ３０）インシュリ
ン残基はその場で生成させることもでき、この場合Ｂ３
０アミノ酸の除去および化合物IIの結合は、単一の酵素
たとえばトリプシンにより、いわゆるトランスペプチダ
ーゼ反応で達成される。
ン残基はその場で生成させることもでき、この場合Ｂ３
０アミノ酸の除去および化合物IIの結合は、単一の酵素
たとえばトリプシンにより、いわゆるトランスペプチダ
ーゼ反応で達成される。
【００１７】同様に、デス（Ｂ２９，Ｂ３０）インシュ
リンは、ジペプチダーゼを用いて、或いはプロリン−リ
ジンペプチド結合を特異的に開裂させるペプチダーゼを
用いて、適当な動物インシュリンから製造することがで
きる。
リンは、ジペプチダーゼを用いて、或いはプロリン−リ
ジンペプチド結合を特異的に開裂させるペプチダーゼを
用いて、適当な動物インシュリンから製造することがで
きる。
【００１８】化合物IIは、前記で調製されたデス（Ｂ３
０）インシュリンのＢ２９−リジンへ、たとえばトリプ
シンを用いて或いはたとえばリシルエンドペプチダーゼ
のようなトリプシン状の作用を有する任意その他の酵素
によって結合させることができる。キャリヤ結合した酵
素を使用することもでき、そしてこの場合には、酵素と
変性インシュリンを含む溶液とを、反応が完結した後に
簡単に分離することができる。
０）インシュリンのＢ２９−リジンへ、たとえばトリプ
シンを用いて或いはたとえばリシルエンドペプチダーゼ
のようなトリプシン状の作用を有する任意その他の酵素
によって結合させることができる。キャリヤ結合した酵
素を使用することもでき、そしてこの場合には、酵素と
変性インシュリンを含む溶液とを、反応が完結した後に
簡単に分離することができる。
【００１９】基Ｒおよび／またはＲ1 とヒトインシュリ
ンとの間の共有結合は、酵素的に開裂させることができ
る。
ンとの間の共有結合は、酵素的に開裂させることができ
る。
【００２０】この条件は、基Ｒおよび／またはＲ1 を形
成するアミノ酸または糖の選択の際に考慮しなければな
らない重要な事項である。
成するアミノ酸または糖の選択の際に考慮しなければな
らない重要な事項である。
【００２１】Ｒ1 がアミノ酸からなる場合、好ましくは
選択は１個のアミノ酸残基についてまたはジ−もしくは
トリペプチドについて行なわれる。これらは、たとえば
疎水性アミノ酸（たとえばフェニルアラニンまたはトリ
プトファン）および／または帯電アミノ酸（たとえばア
ルギニンもしくはリジン）からなるものであってよい。
疎水性アミノ酸を使用する場合、精製は疎水性条件下で
著しく促進されるのに対し、極性もしくはイオン化条件
下における分離および精製は、たとえば帯電アミノ酸を
結合させることにより改善される。
選択は１個のアミノ酸残基についてまたはジ−もしくは
トリペプチドについて行なわれる。これらは、たとえば
疎水性アミノ酸（たとえばフェニルアラニンまたはトリ
プトファン）および／または帯電アミノ酸（たとえばア
ルギニンもしくはリジン）からなるものであってよい。
疎水性アミノ酸を使用する場合、精製は疎水性条件下で
著しく促進されるのに対し、極性もしくはイオン化条件
下における分離および精製は、たとえば帯電アミノ酸を
結合させることにより改善される。
【００２２】基Ｒおよび／またはＲ1 として本発明に使
用しうる糖は単糖類、二糖類、または多糖類である。特
に、たとえばグルコース、フラクトース、マンノース、
ガラクトース、シュークロース、マルトースおよびラク
トースのような単糖類および二糖類が好適である。それ
らの強い極性により、インシュリンと結合した糖は当該
蛋白質の分離および精製に対し極めて好ましい作用を示
す。
用しうる糖は単糖類、二糖類、または多糖類である。特
に、たとえばグルコース、フラクトース、マンノース、
ガラクトース、シュークロース、マルトースおよびラク
トースのような単糖類および二糖類が好適である。それ
らの強い極性により、インシュリンと結合した糖は当該
蛋白質の分離および精製に対し極めて好ましい作用を示
す。
【００２３】ヒトインシュリンを製造するには、一般式
（Ｉ）を有する変性ヒトインシュリンから残基Ｒおよび
／またはＲ1 を酵素的に除去せねばならない。前記残基
の選択は、どの酵素或いはどの酵素の組合せがこの目的
に適しているかを決定する。すなわち、残基の種類を考
慮して使用酵素を選択するのが好ましい。
（Ｉ）を有する変性ヒトインシュリンから残基Ｒおよび
／またはＲ1 を酵素的に除去せねばならない。前記残基
の選択は、どの酵素或いはどの酵素の組合せがこの目的
に適しているかを決定する。すなわち、残基の種類を考
慮して使用酵素を選択するのが好ましい。
【００２４】基Ｒ1 が１種もしくはそれ以上のアミノ酸
から構成される場合、これは有利にはカルボキシペプチ
ダーゼを用いて除去することができる。カルボキシペプ
チダーゼはカルボキシ末端から出発するペプチド鎖から
１種類のアミノ酸を順次に除去しうるエキソペプチダー
ゼであり、すなわち或る種のアミノ酸に対して選択性を
示す。
から構成される場合、これは有利にはカルボキシペプチ
ダーゼを用いて除去することができる。カルボキシペプ
チダーゼはカルボキシ末端から出発するペプチド鎖から
１種類のアミノ酸を順次に除去しうるエキソペプチダー
ゼであり、すなわち或る種のアミノ酸に対して選択性を
示す。
【００２５】カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）は疎
水性アミノ酸を開裂し、そしてこれは特に芳香族アミノ
酸たとえばフェニルアラニン、チロシンおよびトリプト
ファンに対して大なる選択性を示す。他方、カルボキシ
ペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）は、好ましくは塩基性アミノ
酸を開裂する。基Ｒ1 における適当に選択されたアミノ
酸との組合せにおいて、ＣＰＡおよび／またはＣＰＢは
本発明の方法に使用するための極めて適する蛋白質分解
酵素であるが、他のカルボキシペプチダーゼまたはジペ
プチル−カルボキシペプチダーゼも同じ目的に適してい
る。
水性アミノ酸を開裂し、そしてこれは特に芳香族アミノ
酸たとえばフェニルアラニン、チロシンおよびトリプト
ファンに対して大なる選択性を示す。他方、カルボキシ
ペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）は、好ましくは塩基性アミノ
酸を開裂する。基Ｒ1 における適当に選択されたアミノ
酸との組合せにおいて、ＣＰＡおよび／またはＣＰＢは
本発明の方法に使用するための極めて適する蛋白質分解
酵素であるが、他のカルボキシペプチダーゼまたはジペ
プチル−カルボキシペプチダーゼも同じ目的に適してい
る。
【００２６】基Ｒ1 がエステル結合を介して結合された
糖よりなる場合、この糖の開裂はエステラーゼにより達
成することができ、また基Ｒがエーテル結合を介して結
合された糖よりなる場合、この種のＯ−グリコシド化合
物に対し特異的な酵素たとえばガラクトシダーゼのよう
な酵素を開裂用に使用することができる。
糖よりなる場合、この糖の開裂はエステラーゼにより達
成することができ、また基Ｒがエーテル結合を介して結
合された糖よりなる場合、この種のＯ−グリコシド化合
物に対し特異的な酵素たとえばガラクトシダーゼのよう
な酵素を開裂用に使用することができる。
【００２７】さらに、本発明はまた、一般式（Ｉ）を有
する変性ヒトインシュリンにも関する。
する変性ヒトインシュリンにも関する。
【００２８】以下、実施例により本発明をさらに説明す
る。
る。
【００２９】以下の実施例においては、Ｅ．Ｗ．Ｓｃｈ
ｍｉｔｔ等（Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ′ｓ Ｚ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｅ、第３５９巻、第７９９頁
（１９７８））により記載された方法で豚インシュリン
から製造されるデス（Ｂ３０）インシュリン、いわゆる
デス（ａｌａ）インシュリン（ＤＡＩ）を各場合におい
て原料として使用した。
ｍｉｔｔ等（Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ′ｓ Ｚ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｅ、第３５９巻、第７９９頁
（１９７８））により記載された方法で豚インシュリン
から製造されるデス（Ｂ３０）インシュリン、いわゆる
デス（ａｌａ）インシュリン（ＤＡＩ）を各場合におい
て原料として使用した。
【００３０】
【実施例】実施例 １〜６ ＤＡＩに対するジ−およびトリペプチドの結合 種々の基質（ジ−およびトリペプチド、ならびにトリペ
プチドの塩酸塩）を結合させる操作を、種々の酵素系
（トリプシンおよびキャリヤ結合したトリプシンならび
にリシルエンドペプチダーゼ）を用いて行なった。
プチドの塩酸塩）を結合させる操作を、種々の酵素系
（トリプシンおよびキャリヤ結合したトリプシンならび
にリシルエンドペプチダーゼ）を用いて行なった。
【００３１】この結合操作は次のようにして行なう： （ａ） 緩衝剤（緩衝媒質）は次のものから構成する。
【００３２】−ジメチルホルムアミドとエタノールと
の１：１混合物（いわゆる有機フラクション）、および− 濃度０．５モル・ｌ-1のトリスＨＣｌ緩衝液の所定
量。
の１：１混合物（いわゆる有機フラクション）、および− 濃度０．５モル・ｌ-1のトリスＨＣｌ緩衝液の所定
量。
【００３３】（ｂ） 秤量した所定量の基質をこの緩衝
液中に所定量のＤＡＩと共に溶解させる。
液中に所定量のＤＡＩと共に溶解させる。
【００３４】（ｃ） この混合物を濃ＮａＯＨ（１モル
・ｌ-1）によって所望ｐＨまで上昇させる。
・ｌ-1）によって所望ｐＨまで上昇させる。
【００３５】（ｄ） 所定量の結合酵素（ｂｏｎｄｉｎ
ｇ ｅｎｚｙｍｅ）を加え、その後結合反応を開始さ
せ、次いで３７℃にてこれを継続させる。
ｇ ｅｎｚｙｍｅ）を加え、その後結合反応を開始さ
せ、次いで３７℃にてこれを継続させる。
【００３６】（ｅ） 反応期間の終了後、反応生成物を
クロマトグラフィーによって分離し、結合生成物の収率
をクロマトグラムから決定し、それを理論値の％として
表記する。
クロマトグラフィーによって分離し、結合生成物の収率
をクロマトグラムから決定し、それを理論値の％として
表記する。
【００３７】実施例１〜６における反応条件および収率
を第１表に示す。
を第１表に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】実施例 ７ 結合反応の生成物のクロマトグラフ分離 ペプチド結合したＤＡＩとエステル結合したＤＡＩとの
クロマトグラフ上の挙動につき比較を行なった。
クロマトグラフ上の挙動につき比較を行なった。
【００４０】この目的で、ＤＡＩとｔｈｒ−Ｏ−メチ
ル，ｔｈｒ−Ｏ−ｔＢｕ，ｔｈｒ−ｐｈｅ−Ｏ−メチル
およびｔｈｒ−ｐｈｅ−ｐｈｅとの結合反応の生成物
を、実施例１〜４に記載した方法で調製した。
ル，ｔｈｒ−Ｏ−ｔＢｕ，ｔｈｒ−ｐｈｅ−Ｏ−メチル
およびｔｈｒ−ｐｈｅ−ｐｈｅとの結合反応の生成物
を、実施例１〜４に記載した方法で調製した。
【００４１】結合反応の条件は次の通りであった：ＤＡ
Ｉ濃度１４ｇ・ｌ-1、基質濃度０．０６モル・ｌ-1、ト
リプシン濃度２．５ｇ・ｌ-1、媒体中の有機フラクショ
ン６７％、ｐＨ６．４、および反応時間３０分。
Ｉ濃度１４ｇ・ｌ-1、基質濃度０．０６モル・ｌ-1、ト
リプシン濃度２．５ｇ・ｌ-1、媒体中の有機フラクショ
ン６７％、ｐＨ６．４、および反応時間３０分。
【００４２】結合生成物を分析用ＨＰＬＣカラム（Micr
o-bondapak, 10μm, waters）で分離し、そして保持値
（Ｒｆ）を測定した。この分離の結果を、ＤＡＩのＲｆ
値（２２００秒）と結合反応の生成物のＲｆ値との差
（ΔＲｆ）として第２表に示す。尚、分析用ＨＰＬＣカ
ラムの溶媒としては０．５ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓを用
い、アセトニトリルのグラジエント（２０〜４０％）に
て、１ｍｌ／分及び３５℃の条件で溶出させた。
o-bondapak, 10μm, waters）で分離し、そして保持値
（Ｒｆ）を測定した。この分離の結果を、ＤＡＩのＲｆ
値（２２００秒）と結合反応の生成物のＲｆ値との差
（ΔＲｆ）として第２表に示す。尚、分析用ＨＰＬＣカ
ラムの溶媒としては０．５ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓを用
い、アセトニトリルのグラジエント（２０〜４０％）に
て、１ｍｌ／分及び３５℃の条件で溶出させた。
【００４３】
【表２】第 ２ 表 ＤＡＩに結合したもの ΔＲｆ（秒） ｔｈｒ−Ｏ−メチル ２２０ ｔｈｒ−Ｏ−ｔＢｕ １０００ ｔｈｒ−ｐｈｅ−Ｏ−メチル １４００ ｔｈｒ−ｐｈｅ−ｐｈｅ １７００実施例８ ＤＡＩ−ｔｈｒ−ｐｈｅ−ｐｈｅからの結合基ｐｈｅ−
ｐｈｅの除去 結合反応の生成物すなわち結合生成物ＤＡＩ−ｔｈｒ−
ｐｈｅ−ｐｈｅから未変換ＤＡＩを疎水性カラムで分離
した後、０．８５ｍｇ・ｍｌ-1の結合生成物を含有する
２３ｍｌのフラクションが得られた。この結合生成物を
凍結乾燥し、次いで０．２モル・ｌ-1の重炭酸アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ８．５）中へ約２．８ｍｇ・ｍｌ-1の
最終濃度において溶解させた。この溶液へ２μｌのカル
ボキシペプチダーゼを加えた（２．３Ｅ）。反応を、同
容量の０．５モル・ｌ-1のクエン酸を添加して３０分後
に停止させた。次いで、この物質を結晶化させた。
ｐｈｅの除去 結合反応の生成物すなわち結合生成物ＤＡＩ−ｔｈｒ−
ｐｈｅ−ｐｈｅから未変換ＤＡＩを疎水性カラムで分離
した後、０．８５ｍｇ・ｍｌ-1の結合生成物を含有する
２３ｍｌのフラクションが得られた。この結合生成物を
凍結乾燥し、次いで０．２モル・ｌ-1の重炭酸アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ８．５）中へ約２．８ｍｇ・ｍｌ-1の
最終濃度において溶解させた。この溶液へ２μｌのカル
ボキシペプチダーゼを加えた（２．３Ｅ）。反応を、同
容量の０．５モル・ｌ-1のクエン酸を添加して３０分後
に停止させた。次いで、この物質を結晶化させた。
【００４４】検査の結果、結合生成物は、アミノ酸分析
により示されるように完全にヒトインシュリンまで変換
されていることが示された。結晶化の後、フェニルアラ
ニン以外の他のアミノ酸は、アミノ酸分析のときに上澄
液中には見出されなかった。
により示されるように完全にヒトインシュリンまで変換
されていることが示された。結晶化の後、フェニルアラ
ニン以外の他のアミノ酸は、アミノ酸分析のときに上澄
液中には見出されなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 99:26
Claims (1)
- 【請求項１】 式： ［式中、ＲはＨであり、Ｒ１はアミノ酸もしくはペプチ
ド、またはアミノ酸もしくはペプチドのアミドもしくは
エステルであり、該アミノ酸もしくはペプチドのα−ア
ミノ基はペプチド結合を介してスレオニンのカルボキシ
ル基と結合している］を有することを特徴とする変性ヒ
トインシュリン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8201650 | 1982-04-21 | ||
| NL8201650A NL8201650A (nl) | 1982-04-21 | 1982-04-21 | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58069862A Division JPS58189149A (ja) | 1982-04-21 | 1983-04-20 | ヒトインシユリンの半合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05339290A JPH05339290A (ja) | 1993-12-21 |
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