KR890004352B1 - 단백질 아미노-종결잔기의 선택적인 화학적 제거방법 - Google Patents
단백질 아미노-종결잔기의 선택적인 화학적 제거방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용 없음.
Description
본 발명은 단백질의 아미노-종결잔기를 선택적, 화학적으로 제거하는 방법에 관한 것이다.
유기적으로 변질된 원핵세포에서 단백질을 생물학적으로 합성하면 아미노 말단에 N-포르밀-메티오닌이 결합된 단백질이 발현된다. 천연 단백질에 N-포르밀-메티오닌을 가하면 단백질의 생물학적활성, 구조적 안정성, 항원성 등이 변할 수 있으므로 가능하다면 이를 제거하는 것이 가장 바람직하다.
아미노-종결 메티오닌과 목적하는 천연 펩티드 사이를 분해하면, 이론적으로는 목적하는 천연 펩티드를 제조하기 위해 선택하는 방법에 보다 많은 융통성이 제공되지만, 사실상 선택적인 분해를 성취하기 위한 실제적인 방법의 수는 매우 제한되어 있다.
예를들어, 메티오닌이 존재하지 않는 천연 단백질에 있어서, 시아노겐브로마이드 중재된 분해(메티오닌이 선택적 분해위치임)는 천연 단백질의 생성에 매우 효과적인 방법인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 사실상 메티오닌이 존재하지 않으면 적절한 크기의 펩티드와 단백질이 거의 생성되지 않는다. 따라서, 가장 중요한 목적은 생물학적 합성으로 제조된 천연 단백질의 생성과 함께 아미노-종결 메티오닌을 분리시킬 수 있는 방법을 발견하는 것이다.
아미노-종결 메티오닐 단백질로부터 천연 단백질을 생성시킬 수 있다는 것을 입증하는 중요하고도 예기치 않은 발견은 생물학적 합성 발현 생성물의 α-아미노그룹, 예를들어 Nα-메티오닐-(인체 성장호르몬)이 포르밀화 되지 않는다는 사실이다. 이러한 사실은 시아네이트를 사용한 발현 생성물의 화합적 개질을 통해 처음으로 발견되었으며, 그후 자동화된 에드만 서열분석(Edman sequence analysis)으로 확인되었다. 이. 콜리 발현 유기체는 개시 메티오닌을 분해할 수 없지만, 아마도 효소적으로 Nα-포르밀그룹을 분리시킨다. 따라서, 아미노-종결 메티오닌 발현 생성물의 α-아미노그룹은(적어도 잠재적으로)분해에 직접 사용할 수 있다.
아미노-종결 메티오닐 발현 생성물에 유리 α-아미노그룹이 존재하는 것은 메티오닐을 제거하기 위한 기타의 방법에 대한 가능성을 제공한다. 하나의 방법은 페닐 이소티오시아네이트를 사용하는 선택적인 에드만형 아미노 종결 서열분해인데, 이를 실제로 이용하는데 필요한 조건은 천연 단백질중에 리신 잔기가 존재하지 않는 것이다. 그러나, 리신이 존재하지 않는 단백질은 극히 드물다.
또하나의 가능한 방법은 엑소펩티다아제를 사용하는 것인데, 원칙적으로 이들은 단계적인 아미노산 분해를 수행한다. 합성적인 연구에서 엑소펩티다아제의 성공적인 사용에 관한 기록은 많은 이유때문에 거의 존재하지 않는다. 이러한 이유에는 엑소펩티다아제의 불균일한 특성, 비용, 변성에 대한 민감성 등이 포함되며, 가장 중요한 이유는 변화하는 기질에 대한 특이적 및 비특이적 작용의 광범위한 변이성이다.
신규한 화학적 공정을 나타내는 신규한 방법이 발견되었는데, 이는 선택적인 아미노-종결 분해를 성취시켜 목적한 말단 펩티드 생성물을 제조하는데 유용한 신규의 화합물을 제공한다. 본 발명은 이러한 방법 및 이러한 방법에 유용한 화합물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 하기 일반식의 화합물에 관한 것이다.
H-X-Pro-펩티드
상기식에서, X는 천연 생성 아미노산 잔기이고 ; 펩티드는 생물학적 활성 펩티드 또는 단백질을 정의하는 아미노산 잔기의 서열이다.
본 발명은 일반식이 H-X-Pro-펩티드(여기에서, X 및 펩티드는 상기에서 정의한 바와같다)인 화합물로부터 생물학적 활성 펩티드 또는 단백질을 정의하는 아미노산 서열을 갖는 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 하나의 양태로서 H-X-Pro-펩티드를 약산성 조건하에 비양성자성 용매중에 둔다. 또하나의 양태로서, H-X-Pro-펩티드를 산성, 중성 또는 알칼리성 조건하에 비양성자성 용매중에 둔다. 또하나의 양태로서, H-X-Pro-펩티드를 산성, 중성 또는 알칼리성 조건하에 완충된 수성 매질중에 둔다. 두가지 양태중 어느 하나에 있어서, 펩티드를 분해 및 제거하여 H-X-Pro 잔기의 디케토피페라진을 형성한다.
본 발명의 물질을 제공하며 새로이 발견된 방법에는 일반식이 H-X-Pro-펩티드(여기에서, X 및 펩티드는 상기에서 정의하는 바와같다)인 화합물의 의도적인 생물학적 합성 제조방법이 포함된다. 이러한 화합물은 현재 통상적인 제조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 이는 발현 생성물로서 직접 수득하거나 발현생성물 전구체를 처리하여 간접적으로 수득할수 있다.
화합물 H-X-Pro-펩티드는 용어 "펩티드"로 명명되는 목적화합물을 수득하는데 대단히 유용하며, 이러한 화합물은 재조합 방법을 통하여 직접적으로 제조할 수 없었다. 화합물 H-X-Pro-펩티드를 본 발명의 방법에 따라 처리하면 중간체 디케토피페라진을 거쳐 목적생성물(펩티드)이 형성된다. 비양성자성 용매중에서의 분해는 일반적으로 하기의 순서로 도식화된다 :
상기 도식에서, 그룹 Y는 천연생성 아미노산의 측쇄이다.
H-X-Pro-펩티드에서 그룹 X는 천연 생성 아미노산의 잔기를 나타낸다. 그러나, X로 나타낸 아미노산 잔기는 프롤린이 아닌것이 바람직한데, 왜냐하면 Pro-Pro 서열은 단지 매우 느린 속도로 목적한 디케토피페라진 중간체를 형성하기 때문이다. 가장 빈번하게는, 재조합 DNA 방법을 통하여 H-X-Pro-펩티드를 제조한다. 발현 생성물로서 이러한 화합물을 직접 제조하는 경우, 그룹 X는 메티오닐이며, 따라서 본 발명에 있어서 X는 메티오닐이 가장 바람직하다. 그러나, 그룹 X가 메티오닐이 아닌 경우, 화합물은 생물학적 합성으로 제조할 수 있다. 그러나, 발현 생성물은 H-X-Pro-펩티드를 제조하기 위한 다수의 방법중 어느 하나로 먼저 처리하였다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "Pro"는 천연생성 아미노산인 프롤린의 아미노산 잔기를 나타낸다.
"펩티드"로 명명되는 그룹은, 예를들어, 프로인슐린, 인체 성장 호르몬, 소의 성장 호르몬, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 성장호르몬 방출인자, 인슐린 유사 성장인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 단백질 c등을 포함하는 광범위한 생물학적 활성 펩티드 및 단백질 뿐만 아니라 적절히 변형된 형태의 인지된 생물학적 활성 펩티드 및 단백질중 어느 하나의 아미노산 잔기 서열을 나타낸다.
H-X-Pro-펩티드의 예로는 Met-Pro-(인체 성장 호르몬) ; Ala-Pro-(α-인터페론) ; Met-Pro-(인터류킨-2) ; Met-Pro-(γ-인터페론) ; Met-Pro-(소의 성장 호르몬) ; Met-Pro-(조직 플라스미노겐 활성인자) ; Ser-Pro-(인체 성장 호르몬) ; Asp-Pro-(인체 성장 호르몬) ; Met-Pro-(성장 호르몬 방출인자) ; Met-Pro-(단백질 c) ; Leu-Pro-(인슐린 유사 성장인자)등이 있다.
목적하는 최종 생성물 펩티드에 특별히 정의 한 아미노산 잔기 2개를 가하여 구성한 상기 예의 화합물은 달리 수득할 수 없는 광범위한 생물학적 활성 폴리펩티드와 단백질을 생성시킨다. 그들의 아미노 말단에서 서열에서 프롤린 잔기가 뒤따르는 천연 아미노산 잔기로 구성된 디펩티드를 함유하는 화합물은 디펩티드의 용이한 분해 및 목적하는 최종 생성물의 생성을 허용하도록 구성되었다. 마지막 위치에서 두번째의 프롤린은 아미노 말단 디펩티드상에 시스-배위를 형성함으로써 프롤린 카보닐을 공격하기 위해 보다 바람직한 위치에 말단 α-아미노를 고정시킨다 [참조 : Gisin, B.F., and Merrifield, R.B., J.Am.chem.Soc.94, 3102-3106(1972)]. 이 부위에서의 친핵성 공격은 이탈그룹으로서 목적하는 펩티드의 방출과 함께 에너지학상 유리한 사이클릭 아미노산-프롤린 디케토피페라진의 형성에 의해 수행된다. 비양성자성 용매중 반응의 필수적인 특징은 약산에 의한 그의 촉매현상이다. 하나의 의문점, 본 발명 방법의 양태에 대한 가능성의 핵심 및 예상할 수 없는 대답은 목적하는 최종 생성물의 아미노-말단 잔기가 목적하는 최종 생성물이 안정하고 가용성인 조건하에서 적합한 이탈그룹으로 작용하여 디케토피페라진을 형성시키겠느냐는 것이다. 비록 출판된 고체상펩티드 합성에 대한 문헌의 양은 방대하나, 디케토피페라진 형성은 가수분해가 관능화된 수지 에스테르 결합인 합성의 디펩티딜 단계에서만 기록되어 있는 것으로 보인다. 아미드 가수분해가 필요한 X-Pro 서열에서의 디케토피페라진 형성에 대한 기록의 부재는 에스테르와 비교하여 아미드의 증가된 산 안전성에 대해 일반적으로 받아들여진 원리로 보아 놀라운 일은 아니다. 이런 침묵은 본 발명에 따른 방법의 잠재적 성공을 강력하게 반대하고 있다.
본 발명에 따른 방법의 첫번째 양태에 따른 H-X-Pro-펩티드 화합물의 처리는 비양성자성 용매, 바람직하게는 물이 거의 존재하지 않는 비양성자성 용매에서 수행한다. 통상적으로, 이러한 조건은 물의 첨가를 확실히 피함으로써 얻을 수 있다. 비양성자성 용매의 예는 1-메틸피롤리디논(NMP), N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 포름아미드, 헥사메틸포스포르아미드(HMPA) 등이다. 바람직한 용매는 NMP,DMP, 및 DMSO이며, 그중에서도 NMP가 가장 바람직하다.
비양성자성 용매중에서의 반응은 약산성 조건하에 아세트산, 인산, 아인사, 황산, 트리플루오로아세트산, 포름산, 말레산, 타르타르산, 그리신 등을 사용하여 수행한다. 대단히 바람직한 산은 아세트산이다.
또한, 분해반응은 완충 수성 매질에서 수행할 수 있다. 물이 반응매질인 경우, 인산염 완충제 속에서 반응시키는 것이 바람직하다.
비양성자성 용매속에서 수행할 경우, 본 발명의 방법은 일반적으로 약 15 내지 약 50℃, 바람직하게는 약 25 내지 약40℃의 온도에서 수행한다. 산의 농도는 보통 약 0.1 내지 약 1M, 바람직하게는 약 0.25 내지 약 0.5M, 가장 바람직하게는 0.30 내지 약 0.35M, 특히 약 0.33M이다.
수성 매질에서 수행할 경우에는 다소 높은 온도가 필요하다. 따라서, 예를들면 온도는 일반적으로 약 25 내지 약 60℃, 바람직하게는 약 35 내지 약 50℃이다. 반응온도의 선택은 "펩티드"의 안정성 및 H-X-Pro-펩티드중의 세번째 아미노산의 특성에 의존한다. 안정성 및 세번째 아미노산 잔기의 특성에 부합하는 가능한한 높은 온도가 바람직하다. 완충제의 농도는 일반적으로 약 0.1 내지 약 2M, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 1M, 가장 바람직하게는 약 0.8 내지 약 1M범위이다. 바람직한 완충염은 인산염이다. 보다 높은 pH 값에서 분해수율은 단지 조금밖에 증가하지 않으며 바람직하지 못한 부작용의 가능성은 보다 많아지므로 약 8의 pH가 바람직하다 [참조 : Mckerrow, J.H., and Robinson, A.B., Analytical Biochem. 42, 565-568(1972)].
분해반응은 디케토피페라진의 형성을 주기적으로 탐지하면서 수행한다. 적절하다고 생각될 때에 반응을 종결시키고, 기존의 분리방법을 사용하여 반응 혼합물로부터 분해 생성물을 회수한다.
다음은 본 발명을 설명하기 위한 실시예이다. 이들 실시예는 본 발명의 광범위한 영역을 제한하기 위한 것이 아니다.
본 발명의 모델로서 유용한 선택된 펩티드는 고체상 합성방법으로 제조한다. 이들의 순도는 고속 액체 크로마토그라피로 확인한다. 분해하기 전에, 펩티드를 무정형 동결건조 고체로서 보관한다. 실험적 매개변수의 수는 다양하다. 분해에 대한 이들의 효과는 본 명세서에 기록되어 있다.
다음에는 유기 및 수성 매질을 각각 사용한 최적 조건이 기술되어 있으며, 이를 "-NH2"가 펩티드의 c-말단에 아미드 잔기의 존재를 나타내는 펩티드 Met-Pro-Gly-Gly-NH2에 적용시킨다.
A. 유기 분해 조건
4Å 분자체애 1주일 동안 보관하여 무수상태로 만든 N-메틸피롤리디논 1ml에 Met-Pro-Gly-Gly-NH210mg을 용해시킨다. 혼합물을 일정하게 교반하면서 25℃로 유지하고, 빙초산(HOAc)을 0.33M농도로 가하여 반응을 개시한다. 역상 크로마토그라피 분석으로 측정되는 메티오닐-프롤린 디케토피페라진 형성의 출현과 출발 펩티드의 소멸로 분해속도를 탐지한다. 크로마토그라피는 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)중의 울트로스피어 C18(Ultrosphere C18) 0.46×25㎝ 컬럼을 사용하여 아세토니트릴 경사로 용출시켜 수행한다. 각 분석 시점에서 0.1% 트리플루오로아세트산으로 10배 희석하여 반응을 정지시킨다. 디케토피페라진 피크를 수집하고, 이의 동일성을 아미노산 및 질량 스펙트럼 분석으로 확인한다.
하기의 표 1 내지 8의 선택된 매개변수를 변화시키면서 유기 분해 조건을 사용하여 수득한 결과를 나타낸다.
표 1은 25℃의 온도하에 DMF중에서 분해를 수행할 경우, 다양한 산 농도에서의 디케토피페라진 형성정도를 기록한 것이다. 감지할 수 있는 반응속도를 기록하였는데, 이는 약산의 농도에 의존하는 것으로 나타난다.DMSO 중에서의 유사한 약산 처리는 분해속도의 저한를 나타낸다. DMSO 중에서 분해온도를 40℃로 상승시키면, 표 2에서 알 수 있는 바와같이, 25℃의 온도하에 DMF 중에서 수행할 경우와 반응속도가 비슷한 것으로 나타난다.
[표1]
산의 농도
(25℃에서 Met-PrO-Gly-Gly-NH2로 부터 메티오닌-프롤린 디케토피페라진의 형성)
[표2]
산의 농도
(40℃에서 Met-Pro-Gly-Gly-NH2로부터 메티오닌-프롤린 디케토피페라진의 형성)
상기에서 알 수 있는 바와같이, 명백한 최적 산농도는 약 0.25 내지 0.5M이다.
표 3은 단지 세번째 잔기의 측쇄만을 변화시킨 일련의 펩티드에 대한 온도효과를 연구한 결과이다. 이 위치에서의 증가된 입체장애는 반응속도를 지연 시키는 것이 확실하다. 그러나, 모든 경우에서 다소간의 분해가 나타난다.
[표3]
온도 효과
(두가지 온도하에 1M아세트산/DMF 중에서의 메티오닌-프롤린 디케토피페라진의 형성)
aN.D., 측정되지 않음
bMPGG-NH2=Met-Pro-Gly-Gly-NH2
MPTG-NH2=Met-Pro-Thr-Gly-NH2
MPPG-NH2=Met-Pro-Pro-Gly-NH2
MPFG-NH2=Met-Pro-Phe-Gly-NH2
중요한 인자는 비양성자성 용매의 선택이다. 용매는 목적하는 최종 생성물을 생성하기 위한 분해를 수행하고 동시에 궁극적인 펩티드 생성물에 대해 최소한의 분해효과를 나타내면서 디케토피페라진의 형성을 촉진시키거나, 적어도 억제시키지 않는 용매이어야 한다. 표 4 내지 8은 유기 분해 조건하에서 사용하기 위한 각종 용매의 특성에 대한 정보를 알아내기 위해 수행한 연구들로부터의 결과이다.
표 4는 유기 분해 조건에 적용시킨 경우, 많은 단맥질 및 펩티드의 안정성 정보를 나타낸다. 선택된 단백질 또는 펩티드를 특정한 반응 매질에 기술한 시간 동안 적용시킨 후에도 유지되는 역상 고속 액체 크로마토그라피(HPLC)로 측정된 %양이 제공되며, 이는 DMF에 비하여 DMSO가 비교적 우수한 것을 나타낸다.
[표4]
단백질안정성
abPP=소의 췌장 폴리펩티드
GRF=성장 호르몬 방출인자
A(SO- 3)4=인슐린 A-쇄 S-설포네이트
B(SO- 3)4=인슐린 B-쇄 S-설포네이트
b잔류하는 상대 %는 비처리한 외부 대조군에 대해 측정한 것이다.
표 4와 유사한 표 5는 메티오닐 인체 성장 호르몬을 사용한 안정성 결과로서, 여기에서 NMP는 DMF에 비하여 DMSO와 보다 유사한 것으로 나타난다.
[표5]
메티오닐 인체 성장 호르몬의 안정성
a역상 HPLC로 측정
b음이온 교환 HPLC로 측정
표 6은 Met-Pro-Gly-Gly-NH2의 분해에 대한 각종 용매의 효과를 연구한 결과이다.
[표6]
용매 효과
(Met-Pro 디케토피페라진 형성 작용으로서의 Met-Pro-Gly-Gly-NH2의 소멸)
a잔류하는 출발물질의 양을 나타냄
bN.D., 측정되지 않음
c40℃에서 측정
상기에 따라 대단히 바람직한 용매는 NMP, DMP, 및 DMSO, 모든 비양성자성 유기 용매이다.
표 7은 DMF 또는 DMSO를 용매로서 사용한 각종 펩티드에 대한 온도효과를 연구한 결과이다.
[표7]
온도 효과
(1MHOAc 및 40℃하에 선택된 두가지의 용매중에서 메티오닌-프롤린 디케토피페라진의 형성)
aMPGG-NH2=Met-Pro-Gly-Gly-NH2
MPTG-NH2=Met-Pro-Thr-Gly-NH2
MPPG-NH2=Met-Pro-PrO-Gly-NH2
MPFG-NH2=Met-Pro-Phe-Gly-NH2
표 7 및 상기의 기타 표에 기재된 데이파로부터 알수 있는 바와같이, DMF는 DMSO에 비하여 디케토피페라진 형성에 대한 효과가 보다 크며, 분해를 수반하지만, 또한 생성물 단백질 또는 펩티드에 대한 분해효과도 보다 크다. 특정한 펩티드 또는 단백질 생성물에 대한 반응조건을 선택하는데 있어서 가장 좋은 결과를 얻기 위하여 균형을 잘 맞추어 선택하여야 한다.
표 8은 그룹 펩티드가 인체 성장 호르몬인 본 발명의 화합물과 유사한 모델 펩티드에 유기 분해 조건을 적용시켜 수득한 결과를 나타낸 것이다. 인체 성장 호르몬의 처음 2개의 아미노산을 Phe-Pro이므로 인체 성장호르몬이 특이한 위치를 제공하는 것은 중요하다. 따라서, 본 발명의 화합물 X-Pro로부터 디케토피페라진을 형성할 수 있으며, 얻어진 인체 성장 호르몬의 개시 Phe-Pro로부터 계속되는 디케토피페라진 형태를 발견할 수 있다. 따라서, 표 8은 Met-Pro-Phe-Pro-Thr-Ile-NH2를 Phe-Pro-Thr-Ile-NH2와 비교한다. 결과는 후자로부터 보다 느린 속도의 디케토피페라진 형성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 화합물인 화합물 Met-Pro-인체 성장 호르몬의 처리조건을 정확히 결정하여 단일 디케토피페라진의 형성을 최대화하고, 이차적인 디케토피페라진의 형성을 최소화하면서 분해를 수반할 수 있다. 이러한 관점에서, NMP는 디케토피페라진 형성의 정도가 DMSO에서보다 상당히 높고, 보다 후기에 DMF에서 성취된 정도와 거의 동일하므로 가장 바람직한 용매이다. 성장 호르몬의 DMF에 대한 안정성에 비하여 NMP에 대한 안정성이 증가된 사실(표 5)을 고려해 보면, 적어도 본 발명에서 NMP가 바람직한 용매라는 것이 확실하다.
[표8]
성장호르몬 모델 펩티드로부터 디케토피페라진의 형성
Met-Pro-Phe-Pro-Thr-Ile-NH2
Phe-Pro-Thr-Ile-NH2
B. 유기 분해 조건
Met-Pro-Gly-Gly-NH2의 가장 적당한 수성 분해는 1mg의 펩티드를 pH가 8.0인 1M인산나트륨 완충제에 용해시켜 수행한다. 분해를 촉진시키기 위하여, 온도를 55℃에서 24시간동안 유지시킨다. 분해정도는 유기 분해에서 기술한 방법으로 측정한다.
다음의 표 9 내지 12는 산성, 중성 또는 알칼리성 조건을 사용하여 완충 수성 매질중에서 얻은 결과를 나타낸 것이다.
표 9는 펩티드 Met-Pro-Gly-Gly-NH2를 기질로서 사용하여 pH 7.0에서 행한 분해결과를 기재한 것이다. 상이한 완충염을 두가지 사용하여 상이한 두 농도 및 상이한 세 온도에서 검사한다. 결과로부터, 인산염 완충제가 아세테이트보다 바람직하며, 또한 1.0M의 농도가 가장 우수한 결과를 나타내는 것을 알 수 있다.
[표9]
pH 7.0에서 Met-Pro-Gly-Gly-NH2로부터 메티오닐-프롤린 디케토피페라진의 형성에 대한 상이한 완충제 시스템 및 농도의 효과
* 100℃에서의 메티오닌-프롤린 디케토피페라진 형성은 2시간만에 측정한다.
40℃ 및 25℃에서의 형성은 72시간만에 측정한다.
40℃의 온도하에 완충 수성 매질중에서 Met-Pro-Gly-Gly-NH2로부터 메티오닌-프롤린 디케토피페라진의 형성에 대한 pH의 효과는 표 10에 기재되어 있다. 인산나트륨을 완충염으로서 사용한다. 결과로부터 알칼리성 pH가 바람직한 것을 알 수 있다. 탈아미드화 및 탈황화와 같은 바람직하지 못한 부반응은 높은 pH에서 촉진되므로 pH는 약 8이 바람직하다.
[표10]
40℃의 온도하에 1.0M의 인산나트륨중에서 메티오닌-프롤린 디케토피페라진 형성에 대한 pH의 효과
표 11은 pH 8.0 및 40℃의 온도하에서 Met-Pro-Gly-Gly-NH2로부터의 분해수율에 대한 상이한 완충염의 효과에 대한 검사결과를 기재한 것이다. 인산나트륨이 바람직한 완충제이다.
[표11]
pH 8.0 및 40℃의 온도하에서 Met-Pro-Gly-Gly-NH2로부터 메티오닌-프롤린 디케토피페라진의 형성에 대한 상이한 완충염의 효과
표 12는 N-종결로부터 세번째 잔기의 측쇄만이 변화된 일련의 펩티드에서 메티오닌-프롤린 디케토피페라진의 형성에 대한 온도의 효과에 관하여 기재한 것이다. 상기의 표 3에 기재된 연구의 경우와 같이, 세번째 잔기 위치에서의 증가된 입체장애가 반응을 지연시키는 것이 확실하다. 그러나, 두 경우를 제외한 모든 경우에서 다소간의 분해가 일어났음을 알 수 있다. 온도를 40℃에서 55℃로 증가시키면, 시험한 네가지의 테트파펩티드에서 모두 분해의 정도 및 속도가 현저히 증가된다.
[표12]
온도효과
(pH 3.0하에 1.0M인산염 완충제 중에서 두가지 온도하에서의 메티오닌-프롤린 디케토피페라진 형성)
aMPGG-NH2=Met-Pro-Gly-Gly-NH2
MPTG-NH2=Met-Pro-Thr-Gly-NH2
MPPG-NH2=Met-Pro-Pro-Gly-NH2
MPFG-NH2=Met-Pro-Phe-Gly-NH2
펩티드 및 단백질의 대표적인 샘플링시에 상기의 분해방법을 통해 수득한 생성물은 고속 음이온 교환 및 역상 크로마토그라피로 분석한다. 음이온 교환 크로마토그라피는 30%의 아세토니트릴을 함유하는 pH 8.0의 0.05M트리스 완충제중에서 모노 큐 칼럼(Mono Q column)을 사용하여 수행한다. 염화나트륨의 선형경사를 이용하여 용출시킨다. 역상 분석은 pH 7.0 및 45℃의 온도하에 0.1M인산 암모늄중에서 아세토니트릴 경사를 이용하여 조르박스 C8(Zorbax C8)(기공크기 : 150Å)상에서 수행한다.
Claims (25)
- H-X-Pro-펩티드(애기에서, X는 천연생성 아미노산 잔기이고 ; 펩티드는 생물학적 활성 펩티드 또는 단백질을 정의하는 아미노산 서열이다)를 a) 비양성자성 용매중의 약산성 조건 또는 b) 완충 수성 매질중의 산성, 중성 또는 알칼리성 조건하에 처리하여 펩티드를 분해 및 분리하면서 H-X-Pro잔기의 디케토피페라진을 형성함을 특징으로 하여 일반식이 H-X-Pro-펩티드인 화합물로부터 생물학적 활성 펩티드 또는 단백질을 정의하는 아미노산 서열을 갖는 화합물을 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 비양성자성 용매가 N-메틸피롤리디논, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸 설폭사이드, 포름아미드 또는 헥사메틸포스포르아미드인 방법.
- 제 2항에 있어서, 비양성자성 용매가 N-메틸피롤리디논인 방법.
- 제 1항에 있어서, 아세트산, 인산, 아인산, 황산, 트리플루오로아세트산, 포름산, 말레산, 타르타르산 또는 글리신을 가하여 약산성 조건을 유도하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 산이 아세트산인 방법.
- 제 1항에 있어서, 약 15 내지 약 50℃의 온도에서 반응을 수행하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 산의 농도가 약 0.1 내지 약 1M인 방법.
- 제 7항에 있어서, 약 0.33M의 아세트산을 사용하여 반응을 수행하는 방법.
- 제 1항에 있어서, H-X-Pro-펩티드를 완충 수성 매질중의 중성 또는 알칼리성 조건하에 처리하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 완충염이 인산염, 아인산염 또는 아황산염인 방법.
- 제 10항에 있어서, 완충염이 약 0.1 내지 약 2.0M의 농도로 존재하는 인산염인 방법.
- 제 11항에 있어서, 인산염의 농도가 약 0.8 내지 약 1M인 방법.
- 제 1항 또는 제 9항 내지 제 12항중 어느 한 항에 있어서, 약 7내지 9의 pH에서 반응을 수행하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 약 8의 pH에서 반응을 수행하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 약 25 내지 60℃의 온도에서 반응을 수행하는 방법.
- 제 1항 또는 제 9항에 있어서, X가 Met인 방법.
- 제 1항 또는 제 9항에 있어서, 펩티드가 프로인슐린, 인체 성장 호르몬, 소의 성장 호르몬, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 성장 호르몬 방출인자, 인슐린 유사 성장인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 단백질 또는 상기한 것들중 어느 하나의 개질된 생물학적 활성 형태를 정의하는 아미노산 잔기의 서열인 방법.
- 제 17항에 있어서, 펩티드가 인체 성장 호르몬인 방법.
- 제 17항에 있어서, 펩티드가 소의 성장 호르몬인 방법.
- 제 15항에 있어서, 약 35℃ 내지 약 50℃의 온도에서 반응을 수행하는 방법.
- 다음 일반식의 화합물.H-X-Pro-펩티드상기식에서, X는 천연생성 아미노산 잔기이고, 펩티드는 생물학적 활성 펩티드 또는 단백질의 서열을 정의하는 아미노산 잔기의 서열이다.
- 제 21항에 있어서, X가 Met인 화합물.
- 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 펩티드가 프로인슐린, 인체 성장 호르몬, 소의 성장 호르몬, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 성장 호르몬 방출인자, 인슐린 유사 성장인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 단백질 c 및 상기한 펩티드들 중 어느 하나의 변형된 생물학적 활성형으로 이루어진 그룹중에서 선택된 펩티드를 정의하는 아미노산 잔기의 서열인 화합물.
- 제 23항에 있어서, 펩티드가 인체 성장 호르몬인 화합물.
- 제 23항에 있어서, 펩티드가 소의 성장 호르몬인 화합물.
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