JPS63284196A - 選択的ペプチド結合開裂法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はペプチド結合の選択的な開裂方法に関するもの
である。

「従来技術」 化学物質による選択的なペプチド結合の開裂は、アミノ
酸配列の決定において測り知れない価値が認められてい
る。メチオニンは臭化シアンの作用に鋭敏なため、アミ
ノ酸開裂部位として最も有用である。第２に好適な開裂
の標的はトリプトファンであり、それに関して多くの試
薬が知られている。２５年以上に及ぶ研究にもかかわら
ず、どのトリプトファン試薬も恒常的に、メチオニンの
場合に得られる開裂効率および選択性に匹敵するもので
はない。

タンパク質の選択的な開裂方法は、タンパク質の半合成
および遺伝子工学によるタンパク質合成の進歩に伴って
その重要度が高まってきた。これらの分野では、殆んど
独占的に臭化シアンが用いられていた。合成を目的とす
る場合、メチオニンがペプチドにとって本質的な（固有
の）残基であると、臭化シアンの使用は制限される。あ
る種のペプチド、特に心室性排泄増加因子（ＡＮＦ）、
成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、およびインシュリン
様成長囚子−Ｉ（ＩＣＦ−１）は唯１個のメチオニンを
含有しており、トリプトファンを含有していない。個々
のペプチドの生理学上の意義および臨床上の利用性を決
定するためには、各ペプチドの確実な合成源が必要とさ
れる。今日、この程度の分子量のペプチドを最も高収率
に生産する方法は、大腸菌（Ｅ　、ｃｏｌｉ）内で合成
された融合タンパク質を選択的に開裂することからなる
。

トリプトファン不含の天然ペプチドの直前にトリプトフ
ァンを先行させた融合タンパク質を細菌合成することに
よって選択的に開裂可能な部位が得られる。トリプトフ
ァンのペプチド結合の化学的な開裂は、酸化的ハロゲン
化によって行なわれる。より詳しくは、総論［フォンタ
ナ、Ａ３、サビゲ、Ｗ、Ｅ、　、およびザンボニン、Ｍ
、（１９８’０）「ペプチドおよびタンパク質の配列決
定法」」（バール、Ｃ１編）、エルスピア−／ノースオ
ランダ　バイオメディカル　プレス、３０９−３２２］
を参照。ＢＮＰＳ−スカトール［２−（２−ニトロフェ
ニルスルフェニル）−３−メチル−３−ブロモイントレ
ン］の作用によってほぼ６０％の開裂収率が達成された
。より最近では、ＤＭＳＯとＨＢｒとの酢酸中温合物に
よる選択的開裂が推奨されている［サビゲ、Ｗ、Ｅ、お
よびフオンタナ、Ａ、　（＋９７７）メソッズ・イン・
エンザイモロジー、４７．４５９−４６９］。これらの
方法のいずれにおいてもトリプトファンでの修飾は選択
的でない。

メチオニンスルホキシドの生成は、はぼ定量的なレベル
で起こる。非可逆的に修飾されたアミノ酸、例えばメチ
オニンスルホン、システィン酸および／または臭化チロ
シンも少ないが認められている。

トリプトファン開裂の過程で起きる副反応の程度はＮ−
クロロスクシンイミド（ＮＣ９）を用いると最小になる
ことが報告された［シエヒター、Ｙ０、パッチョーニク
、Ａ、およびバーシュタイン、Ｙ。

（１９７６）バイオケミストリー１５．５０７１−５０
７５］。元々検出された他の修飾は、メチオニンの、そ
のスルホキシドへの変換のみであった。

しかしながら、ＮＣＳを用いた継続研究で、かなりのレ
ベルのシスティン酸およびメチオニンスルホンが観察さ
れた［リシウェ、Ｍ、Ｗ、　、およびサンプ、Ｍ、　Ｔ
、　（１９７７）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー、２５２．４９７６−４９８０］。これら
の副反応物は、アミノ酸の配列決定を混乱させるかもし
れないが、利用が成功しないわけではない［フアツジ、
Ｈ，Ｖ、　、ボンド、Ｍ、Ｗ、　、ファンカピラ、Ｍ、
Ｗ、およびフッド、Ｌ、Ｅ、（１９８３）、メソッズ・
イン・エンザイモロジー、９１，３１８−３２４］。こ
れらの試薬をタンパク質合成工程に使用するには、一層
厳格な条件が適用される。

概念上、酢酸中でのＤＭＳＯおよびＨＢｒによるトリプ
トファンの開裂は最も興味深い。開裂は安価で入手容易
な試薬によって選択的に行なわれる。より重要な点は、
メチオニンが即座に再生され得る機会があることである
。メチオニンスルホキシドは、ジメチルスルホキシドの
添加により濃塩酸中で還元され得る［サビゲ、Ｗ、Ｅ、
およびフォンタナ、Ａ、　（１９７７）メソッズ・イン
・エンザイモロジー、４７．４５３−４５９］。しかし
ながら、強酸性条件はペプチド構造に破壊的な影響を及
ぼすので、トリプトファンの開裂およびメチオニンスル
ホキシドの還元にはこれらの方法は殆んど用いられない
。基本的には、適当な溶媒が見つかれば、ＤＭＳＯ−促
進トリブトファン開裂の後、素早＜ＤＭＳ−誘導メチオ
ニン再生成を行うことができる。

トリプトファンにおける効率的な開裂は、酢酸中ＤＭＳ
Ｏおよび４Ｎ塩酸では達成されない［サビゲ、Ｗ、Ｅ、
およびフォンタナ、Ａ、　（１９７７）メソッズ・イン
・エンザイモロジー、４７．４４４２−４５３３゜ＨＢ
ｒのようなより強力なハロゲン化剤が必要である。しか
し、残念ながら、その存在は、システィン酸レベルの増
加という望ましからぬ結果をももたらす。

従って、望ましからぬ副生成物、特に非可逆的な副生成
物の生成を最小限度に止めてトリプトファンの位置で効
率良く開裂する方法の開発が極めて重要である。

そのような方法は、本発明によって完成された。

本発明方法では、従来法と同様にＤＭＳＯおよびＨＣＩ
を使用する。しかしながら、酢酸の代わりにトリフルオ
ロ酢酸を用いて開裂を行う。トリプトファンでの開裂は
かなりのレベルで起きるが、非可逆的な副生成物の生成
は最小限度であり、特にシスティンからシスティン酸へ
の変換およびメチオニンからメチオニンスルホンへの変
換は最小限度に止まっている。

このように、本発明の目的は、ペプチドまたはタンパク
質を、！またはそれ以上のトリプトファン残基の位置で
選択的に開裂する方法であって、トリフルオロ酢酸中、
濃度約０．０５ｍＭ〜約５０１１Ｍの該ペプチドまたは
タンパク質を、濃度約０゜０１Ｍ〜約１Ｍの有機スルホ
キシド、濃度約０゜０１Ｍ〜約２Ｍの塩素イオン、およ
び約１０Ｍを超えない濃度の水で処理することからなる
方法を提供することにある。

上記の如く、本発明の目的は、ペプチドまたはタンパク
質を１またはそれ以上のトリプトファン残基１の位置で
選択的に開裂する方法にある。この方法は、例えば構造
解析の如く、多くの具体的な応用方法に適用することが
できる。しかしながら、本発明方法の代表的な応用例と
して、組換えＤＮＡ発現法で得られた何部体物質からＩ
ｔｃ、ｓタンパク質を生産する大規模な商業上の利用が
考えられる。

前駆体は、所望の成熟生成物のアミノ末端に位置して該
成熟生成物と余分なペプチドとを結合しているトリプト
ファン残基を含有するように特別の修復を行なったもの
である。通常、この余分なペプチドは発現を効率的にし
、かつ／または精製を容易にするために含有させる。

加えて、この前駆体は、トリプトファン残基によってそ
れぞれ連結された、成熟生成物の複数の配列を含有して
いてよい。

以上の記載から当然分かるように、所望の成熟生成物は
トリプトファン残基を含んでいないことが重要である。

この基準に適合する生物活性な成熟生成物には例えば、
インシュリン様成長因子−１（Ｉ　ＧＦ−Ｉ）、インシ
ュリン様成長因子−１１（ＩＧＦ−■）、成長ホルモン
放出因子（ＧＲＦ）、心室性ナトリウム排泄増加因子（
Ａ　Ｎ　Ｆ　）、プロインシュリン、インシュリンＡ−
鎖、インシュリンロー鎖、形質転換成長因子−α（Ｔ　
Ｇ　Ｆ−α）等がある。

本発明方法は、溶媒としてトリフルオロ酢酸を用いて行
う。開裂にとって水は不可欠であり、理想的にはトリプ
トファン残基１モルあたり、少なくとも１モルで表され
る量、存在させるべきであるが、大過剰の水は有害であ
る。従って、通常の行程では、反応混合物に必要量の濃
塩酸を添加すると、十分量の水が加えられることになる
ので、実質上、無水のトリフルオロ酢酸を用いることが
極めて好ましい。”実質上無水の”という語句は微量の
水も存在しないよう、特に測定する必要があることを意
味するものではない。単に、積極的には水を加えないこ
とを意味するにすぎない。

トリフルオロ酢酸に、開裂に付されるタンパク質または
ペプチドと、有機スルホキシドおよび塩素イオンを加え
る。試薬の添加順序は任意である。

しかしながら、理想的には、まず、タンパク質またはペ
プチドをトリフルオロ酢酸に溶解させた後、有機スルホ
キシドを加え、次いで、塩素イオンを加える。

トリフルオロ酢酸に加えるペプチドまたはタンパク質の
量は、一般に約０．０５ｍＭ〜約５０ｍＭである。好ま
しくは約０　、１　ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましく
は、約０．３　ｍＭ〜約３ｍＭ、最も好ましくは、約０
　、５　ｍＭ〜約１．５　ｍＭである。至適濃度は約１
ｍＭである。

タンパク質またはペプチドを、トリフルオロ酢酸中で有
機スルホキシドおよび塩素イオンと反応させる。反応性
のスルホキシド部分以外の部分が本発明方法の条件下で
不活性でさえあれば、広範囲に及ぶ有機スルホキシドの
内、どれを用いてもよい。代表的なスルホキシドには、
ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、エチル
メチルスルホキシド、ジフェニルスルホキシド、メチオ
ニンスルホキシド等を挙げることができる。好ましいス
ルホキシドは、それぞれ１〜３個の炭素原子を有するア
ルキル基からなるジアルキルスルホキシドである。本発
明方法にはジメチルスルホキシドが極めて好ましい。

通常、濃度域的０．０１Ｍ〜約１Ｍで、有機スルホキシ
ドを反応混合物を加える。好ましい濃度は約０．０５Ｍ
〜約０　、５　Ｍ、最適濃度は約０．１Ｍである。

伐る必須試薬は塩素イオンである。塩素イオンは広範な
供給源にから得られる。それは、例えば、無機塩、有機
塩、および塩化水素として加えることができる。塩素イ
オンは８、反応溶媒、即ちトリフルオロ酢酸に溶ける形
で存在していることが好ましい。従って、塩酸またはテ
トラエチルアンモニウムクロライドのような有機性塩を
用いろことが好都合である。開裂を好都合かつ成功裏に
、しかも経済的に行うことができるので、本発明方法に
とって塩化水素は好ましい試薬である。塩化水素を用い
る場合、それを混合物に気体状で導入してもよく、ある
いは塩化水素水として加えてもよい。一般に、混合物中
に存在する塩素イオンの濃度は約０．０１Ｍ〜約２Ｍ、
好ましくは約０．０５Ｍ〜約０．５Ｍの範囲である。最
適濃度は約０１１Ｍである。　前記の如く、本発明方法
には水が必要であるが、最良の成果を挙げるためには、
水の量を注意深くコントロールしなければならない。

反応の完結のためにタンパク質またはペプチド中のトリ
プトファン残基数に基いて化学量論的に表される最の水
を存在させる必要がある。当然、反応程度を低くする場
合には、それに対応してより少量の水を用いるとよい。

水の量が実質上過剰であることは、本発明方法の成功に
極めて有害である。従って水の濃度は通常、約１０Ｍを
越えるべきでない。

本来、ｆｌ　ＣＩの約４倍の水を含ａしている濃塩酸を
用いることによって所望の水濃度にすると便利である。

しかしながら、気体状の塩化水素または他の塩素イオン
供給源を用いる場合には、それに対応して、所望の濃度
に達するよう、反応混合物に水を加える必要がある。

本発明方法は、約り℃〜約４５℃の広範囲の温度域の任
意の温度で行うことができる。室温程度の温度で反応を
行うことが好ましい（約２０〜２５℃）。

通常、開裂は極めて急速に起きる。反応は長時間、例え
ば６時間行うこともできるが、僅か５分間で完了し得る
。したがって、一般に、約３０分間から約９０分間、反
応させる。

開裂反応の完了後、所望の生成物を既知の回収方法で回
収することができる。従来法と異なり、生成物は、シス
ティンの非可逆的酸化物であるシスティン酸またはメチ
オニンの非可逆的なメチオニンスルホンを、たとえ含有
していても極く僅かしか含有していない。本発明の開裂
条件下で幾分のメチオニンスルホキシドが生成されるが
、既知の多くの還元反応の手法のいずれかによって容易
に還元することができる。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

これらは本発明を制限する三とを意図したものではない
。

実施例１　選択したヘキサペプチドの処理以下のへキサ
ペプチドを調製した。

（１）　ｔｌ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｎｔｌｔ　（ＦＷＧＰＥＴ−Ｎｌｌｔ）（
２）　ｔｌ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
−Ｔｈｒ−Ｎｔｌ＝　（ＦＣＧＰＥＴ−Ｎｌｌ−）（３
）　Ｈ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｎ［Ｉｔ　（ＦＭＣＰＥＴ−Ｎｌｌｔ）それぞれ
、Ｔｒｐ開裂、Ｃｙｓ酸化およびＭｅｔ酸化の程度を評
価するために本発明方法に従って各ペプチドを処理した
。

反応の具体例を以下に示す。

Ｆ”ＷＧＰＥＴ　　ＮＨ？（６，３２ｍｇ）を無水トリ
フＡ４０酢酸（ＴＰＡ）７．６ｉ０に溶かした（　ｌ　
ｉｇ／ｚ＆；１．４ＩＩ＋Ｍ）。このペプチド溶液を６
部に分割した。

１部にはＤＭＳＯおよび塩酸の０ずれも加えなかった（
対照）。他の５つのペプチド溶液には種々の量のＤＭＳ
Ｏ（０，０１Ｍ〜ＩＭ）と濃塩酸（０，０１Ｍ〜ＩＭ）
を加えた。この溶液を激しく混合した後、室温で撹拌せ
ずに６０分間放置した。素早くＮ、で乾燥し、０．１％
水性ＴＦＡで希釈して反応を終結させた。化学修飾の程
度をアルテックス・ウルトラスフェア−０ＤＳ逆相カラ
ム（０，４６Ｘ２５ｃｍ＞を用い、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）で評価した。クロマトグラフィー
は、０゜１％ＴＦＡ中、４５℃において漸増量（１）　
ＣＨ３Ｎの線状グラディエンドを溶離液として行った。

定量は２１４ｎｍにおける測定値のピーク部分の値に基
いて行なわれた。Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ／　Ｔ　Ｆ　Ａ　／　
ＨＣＩ処理ＦＷＧＰＥＴ−ＮＨ２から、合成ＧＰＥＴ−
ＮＨ１標準とクロマトグラフィーにおけろ保持時間が同
一であるペプチドが得られた。　様々な混合比の試薬と
前記の各ペプチドを用いて得られた結果を表１および表
２に示す。また、前記３つのへキサペプチドを用い、本
発明方法および幾つかの従来技術の方法に従って得られ
た結果を表３に示す。

実施例２　インシュリンＢ鎖Ｓ−スルフォネートの処理 インシュリンＢ鎖Ｓ−スルフォネート（３，８４ｍｇ）
を無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）３．４５ｉ（！に溶
かした。この溶液にＤＭＳＯ３４５ｇＱおよび濃塩酸３
４．５μａを加えた。この溶液を激しく混合した後、室
温で撹拌せずに２時間おいた。混合物を素早＜Ｎ、で乾
燥することにより反応を終結させた。試料を！０％ＨＯ
Ａｃに溶かし、セファデックスＧ−１０カラム上で精製
した。純化ペプチドを凍結乾燥し、次いで、アミノ酸配
列決定に付した。システィン酸レベルは１．６％と測定
された。

実施例３　　ＧＲＦ（１−４５）、Ｌｙｓ４１１−ＯＨ
からＧＲＦ（１−４５）、Ｌ　ｙ　Ｓ　４　Ｓ、Ｍｅｔ
”（０）　−０８への酸化 成長ホルモン放出因子類似体［ＧＲＰ（１−４５）、Ｌ
　ｙｓ”　−ＯＨ］（１、２５ｍｇ）を無水トリフルオ
ロ酢酸（ＴＰＡ）１ｘ１２に溶かした。このペプチド溶
液から１０μ１７をとり、０．１％水性ＴＦ’Ａで０．
０５ｉｇＧＲＦ類似体／酎に希釈した。この溶液を未処
理対照として用いた。このペプチド／ＴＦＡ溶液にＤＭ
ＳＯ１００顧、次いで、濃塩酸１０μＱを加えた。この
溶液を激しく混合した後、室温で撹はんせずに６０分間
放置した。混合物を０．１％水性ＴＦＡで２０倍希釈す
ることにより反応を終結させた。化学修飾の程度をＶｙ
ｄａｃＣＩ８逆棺カラム（０，４６Ｘ　１５ｃａ＋）を
用い、高速液体クロマトグラフィー（Ｉ−ＩＰＬＣ）で
評価した。クロマトグラフィーは、０．１％ＴＦＡ中、
４５℃において漸増量のＣＨ，Ｈの線状グラディエンド
を溶離液として行った。定量は２１４ｎｍにおける測定
値のピーク部分の値に基いて行なわれた。修飾したＧＲ
Ｆ類似体はクロマトグラフィーにおいて合成ＧＲＦ類似
体標準、Ｍｅｔ！７（０）　−０ト１と同一の保持時間
を有していた。非修飾物質中には測定可能な未処理ＧＲ
Ｆ類似体が存在せず（対照と比較して）、さらに、修飾
した物質は、対照物質に匹敵する品質を有していた。上
記の方法により、ＧＲＦ類似体はほぼ定量的にそのメヂ
オニンスルホキシド誘導体に変換された。

実施例４　グルカゴンの酸化および開裂グルカゴン（３
，３５ｊｌ！２）を無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０
．２７ｍ１２に溶かした。このペプチド溶液を分割し、
１部をＤＭＳＯ中ＩＭにし、他を０．１Ｍ（好適）にし
た。次いで、濃塩酸を加えて０．１Ｍにした。この溶液
を激しく混合した後、室温で撹拌せずに６０分間放置し
た。０．１％水性ＴＦＡで２０倍希釈することによって
反応を終結させた。化学修飾の程度をアルテックス・ウ
ルトラスフェア−０ＤＳ逆相カラム（０，４６Ｘ２５ｃ
＋ｎ）を用い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）で評価した。クロマトグラフィーは、０．１Ｍりん酸
アンモニウム、ｐＨ２，６中、４５℃において漸増量の
ＣＨ，ＣＮの線状グラディエンドを溶離液として用いて
行った。定量は２１４ｎ−における測定値のピーク面積
の値に基いて行なわれた。

グルカゴンの開裂および酸化の収率を、予測される開裂
産物であるＨ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（０）−Ａｓｎ−Ｔｈｒ
−ＯＨ［ＬＭ（０）ＮＴ］およびＨ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ　
−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＯＨ（（ＬＭＮＴ）の合成標準品に
対する分析によって定型した。好ましい条件下において
、６４％の開裂が得られ、そのうち酸化されたＬＭ（０
）ＮＴか全開裂産物の３７％を占めていた。

実施例５　キメラＩＧＦ−１の酸化および開裂ＩＣＦ−
１顆粒（１１，７部ｇ）［ウィリアムス、Ｄ。

Ｃ１、ファン　フランク、Ｒ，Ｍ、、ムス、Ｗ、Ｌ。

、およびバーネット、Ｊ、Ｐ、（１９８２）サイエンス
、２１５巻、６８７−６８９参照］を無水トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）１．ｌ５ｉｆｆに溶かした。

この溶液にＤＭＳＯ１１，５μｇおよび濃塩酸１１゜５
μＱを加えた。最初、この溶液を激しく混合した後、室
温で６０分間放置した。Ｎ、で急速に乾燥することによ
って反応を終結させた。ペプチドを５０％ＨＯＡｃに溶
かし、セファデックスＧ−１０カラムを用いて精製した
。凍結乾燥した後、純化試料をそのＳ−スルフォネート
誘導体に変換した。酸化処理の効果を２本（４Ｘ０．６
ｃｍ）のデュポン　リライアンスＣ８，３μ逆相カート
リツジ（連続）を用い、高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）で評価した。クロマトグラフィーは、０．１
Ｍの（ＮＨ−）＊ＨＰＯ４、ｐＨ７中、４５℃において
漸増量のＣＨ，ＣＮの線状グラディエンドを溶離液とし
て行った。修飾されたＩＧＦ−１は生合成されたＩＣＦ
−１およびＩＧＦ−１，Ｍｅｔ”（０）比較標準品と同
じ保持時間を有していた。未精製顆粒からのＩＧＦ−１
の収率は２．９％であった。酸化形のＭｅｔ（０）ＩＧ
Ｆ−１は開裂産物の５４％を占めていた。

特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、１またはそれ以上のトリプトファン残基の位置でペ
   プチドまたはタンパク質を選択的に開裂する方法であっ
   て、トリフルオロ酢酸中、濃度約０．０５ｍＭ〜約５０
   ｍＭの該ペプチドまたは該タンパク質を濃度約０．０１
   Ｍ〜約１Ｍの有機スルホキシド、濃度約０．０１Ｍ〜約
   ２Ｍの塩素イオンおよび濃度約１０Ｍを超えない水で処
   理することからなる方法。 ２、実質上無水のトリフルオロ酢酸中で開裂を行うこと
   からなる請求項１に記載の方法。 ３、塩素イオンの供給源として塩化水素を用いて開裂を
   行うことからなる請求項１または２に記載の方法。 ４、塩化水素および水の全供給源として濃塩酸を用いて
   開裂を行うことからなる請求項３に記載の方法。 ５、ペプチドまたはタンパク質の濃度が約０．３ｍＭ〜
   約３ｍＭである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６、ペプチドまたはタンパク質の濃度が約０．５ｍＭ〜
   約１．５ｍＭである請求項５に記載の方法。 ７、有機スルホキシドが、それぞれ炭素原子数１〜３個
   のアルキル基からなるジアルキルスルホキシドである請
   求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８、有機スルホキシドがジメチルスルホキシドである請
   求項７に記載の方法。 ９、ジメチルスルホキシドの濃度が約０．０５Ｍ〜約０
   ．５Ｍである請求項８に記載の方法。 １０、塩化水素の濃度が約０．０５Ｍ〜約０．５Ｍであ
   る請求項３に記載の方法。 １１、反応混合物中の水の含有量が、少なくとも、ペプ
   チドまたはタンパク質中のトリプトファン残基数に基く
   化学量論的な当量を達成する上で必要な量である請求項
   １〜１０項のいずれかに記載の方法。