JPS62171699A - 蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、メチオニンの付加された蛋白質からＮ−末端
メチオニンを脱離する方法に関する。

従来の技術 蛋白質が細胞内で生合成される際には、そのアミノ末端
はｍＲＮＡの開始コドンＡＵＧに対応するメチオニン（
原核生物ではホルミルメチオニン）から始まってい、る
ことか知られている。しかしながらこのメチオニンは以
後のプロセシングによって取り除かれてしまうので、完
成された成熟蛋白質分子にはもはや存在しないのが通例
である。

一方、最近の遺伝子組換え技術の急速な進歩は、有用な
蛋白質を微生物や動物細胞、例えば大腸菌を用いて産生
ずることを可能にした。しかしながら、本手法によって
産生される蛋白質には、上記メチオニンが残存している
例が見い出されている。

例えば、大腸菌で発現させた第１図で示されるアミノ酸
配列を有する非グリコジル化ヒトインターロイキン−２
では天然型ヒトインターロイキン−２と同じくアラニン
ではじまる分子種（ｒＩＬ−２）に加えアミノ末端にさ
らにメチオニンの付加した分子種（Ｍｅｔ−ｒＩ　Ｌ　
−２）の存在が認められており、さらにインターフェロ
ン−αにおいては、メチオニンの付加率は５０％［ジャ
ーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ（Ｊ、　Ｉ
ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、）。

１、３８１（１９８１）］、ヒト成長ホルモンにおいて
は約１００％［ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、　２９３
．４０８（１９８１）コにも達している。

発明が解決しようとする問題点 同じ蛋白質であっても、アミノ末端にメチオニンの付加
した分子種とそうでない分子種とは蛋白質の高次構造、
生物活性、安定性が相互に異なる可能性があり、さらに
メチオニンのアミノ末端への付加が抗原性の増加をもた
らす可能性もありうるものと考えられる。従って、産業
利用上の観点から、この開始コドンに対応するアミノ末
端メチオニンの除去法を確立することは意義あることと
考えられる。

この課題を解決するため、臭化シアン（ＢｒＣＮ）分解
によってメチオニンを取り除く方法が提案［サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　１９８．１０５６（１９７７）
］されているが、この場合は所望の成熟蛋白質中にメチ
オニン残基が存在しないことが前提となる上、過酷な化
学反応を蛋白質に付す該方法によっては、決して満足す
る結果は得られない。

なお特表昭６０−５０００４３号は、複数のアミノ酸か
らなる前配列順序もしくは信号配列順序を有する融合蛋
白質を、アミノペプチダーゼで分解する成熟蛋白質の製
造方法を開示しているが、該方法によってはアミノ末端
のメチオニンのみを切断することはできず、上記の課題
を解決するため゛の手段とはなり得ない。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、遺伝子工学的に製造される蛋白質におけ
るアミノ末端のメチオニンのみを切断することによる、
天然型のアミノ酸配列を有する蛋白質の製造法を提供す
べく鋭意研究したところ、メチオニンの付加した蛋白質
にアミノペプチダーゼを作用させることにより当該蛋白
質のアミノ末端のメチオニンのみを特異的に切断しうる
ことを見出し、これに基づいてさらに研究した結果、本
発明を完成した。

本発明は、式 ％式％（１） ［式中、ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を、Ｙはペプチド鎖
を示す。コで表わされるメチオニンの付加した蛋白質に
アミノペプチダーゼを作用させ、弐Ｈ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙ
−ＯＨ（ＩＩ） ［式中、ＸおよびＹは前記と同意義を有する。］で表わ
される蛋白質を製造することによるメチオニンの付加さ
れた蛋白質からＮ−末端メチオニンを脱離する方法であ
る。

式（１）中、Ｘで表わされるアミノ酸は、Ｐｒｏ以外の
アミノ酸であればいずれでもよく、例えば必須アミノ酸
であるＡｌａ、　Ｐｈｅ、　Ａｒｇ、　Ｔｈｒ、　ｌｌ
ｅ、　Ｇｉｎ。

Ｓｅｒ、　Ｇｌｙ、　Ｌｅｕなどが挙げられ、とりわけ
Ａｌａ。

Ｐｈｅ、　Ａｒｇ、　Ｔｈｒが好ましい。

Ｙで表わされるペプチド鎖は、２以上の任意のアミノ酸
かるなる任意のアミノ酸数を有するペプチドであればい
ずれでもよく、アミノ酸数として約４００以下のものが
好ましい。該ペプチド鎖の分子量は、約２００〜５０，
０００であることが好ましい。

実用的な面からは、上記ペプチド鎖はアミノ酸数約２０
〜３００のもの、あるいは分子量が約２００〜３Ｂ、Ｏ
ＤＤのものが好ましく、遺伝子工学手法により製造され
たポリペプチドや化学合成で製造されたペプチドのＹに
対応する部分のペプチド鎖が挙げられる。

さらに具体的には、本発明の製造法で製造される式（Ｉ
Ｉ）で表わされる蛋白質として、ヒトインターロイキン
−２（ヒトＩＬ−２）などのリンホカイン；成長ホルモ
ン（例、ヒトもしくはウマ成長ホルモン）、ウシプロラ
クチン、ウシもしくはニワトリすい臓ホルモンなどのホ
ルモン；ウシすい臓塩基性トリプシンインヒビター、イ
ヌ顎下腺プロテアーゼインヒビターなどの酵素阻害物質
；サブスタンスＰ；ヒト血漿アルブミンなどの血中蛋白
質酸物などに加え、デスルホビプリオ　ブルガリス（Ｄ
ｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）フラボ
トキシン、ブタ心筋アスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼ、ウサギ骨格筋トリオースリン酸イソメラーゼ、
パパイヤパパイン、ストレプトコッカス　ピオゲネス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）プロ
テアーゼ、ミクソバクター（Ｍｙｘｏｂａｃｔｏｒ）４
９５β−リティクプロテアーゼ、コレラ毒素β鎖、ウシ
、アカガエルもしくはヒトカリジンＩ、ヒト血清超低密
度リボ蛋白質Ｃ−■、ウシ乳αＳ１カゼインＢバリアン
ト、大腸菌り一アスパラギナーゼなどが挙げられるが、
化学合成などにより製造される公知または新規のポリペ
プチド（ｎ）でもよい。

本願明細書において、蛋白質あるいはポリペプチドと称
する場合、複数のアミノ酸からなるペプチドおよび蛋白
質を包含し、非グリコジル化またはグリコジル化ポリペ
プチドのいずれでもよい。

上記蛋白質（ｎ）としては、なかでもヒトインターロイ
キン−２およびヒト成長ホルモンが好ましい。

上記ヒトインターロイキン−２とは天然のヒトインター
ロイキン−２と同様の生物学的もしくは免疫学的活性例
えばインターロイキン−２レセプターや抗インターロイ
キンー２抗体との結合能を有するものであればいずれで
もよく、具体的には第１図で示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドや、その生物学的もしくは免疫学的活
性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメント
でもよく、例えば、アミノ末端部分の１個のアミノ酸を
欠くフラグメント（ヨーロッパ特許出願公開第９１５３
９号）、アミノ末端部分の４個のアミノ酸を欠くフラグ
メント（特開昭６０−１２６０８８号）、カルボキシル
末端部分の数個のアミノ酸を欠くフラグメントなどが挙
げられ、さらに第１図で示されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドの構成アミノ酸の一部が欠損しているか他
のアミノ酸に置換されたもの、例えば１２５位のシステ
ィン残基がセリン残基に置換されたもの（特開昭５９−
９３０９３号公報）でもよい。

アミノペプチダーゼとしては、例えば公知のアミノペプ
チダーゼＭ　［Ｅ　Ｃ３，４，１１，２，メソッズ・イ
ン暴エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）、　　１９．５１４（１９ツ１）］、
ロイシンアミノペペプチダーゼ　Ｅ　Ｃ３，４，１１，
１，ザ・エンザイムズ（ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ）、　３
．８１（１９７１）］、アミノペプチダーゼＰＯ［蛋白
質　核酸　酵素　垣、　１２２０（１９８３）、共立出
版］、アミノペプチダーゼＢ　［Ｅ　Ｃ３，４，１１，
８；、ザ・エンザイムズ、　３．　［２（１９７１）］
、アミノペプチダーゼＰ（Ｅ　Ｃ３，４，１１，９）；
バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｍ、）、　３２．６５８（１９
６８）］などが挙げられ、これらアミノペプチダーゼは
、市販品として人手でき、あるいは上記文献記載の方法
で製造できる。

本発明の製造法においては、とりわけアミノペプチダー
ゼとしてアミノペプチダーゼＭを用いるのが好ましい。

本発明においては、ポリペプチド（Ｉ）にアミノペプチ
ダーゼを作用させることによりポリペプチド（ｎ）が製
造される。

原料として用いるポリペプチド（Ｉ）は、精製品でも、
精製過程で得られる部分精製品でもよく、ポリペプチド
（ＩＩ）が共存していてもよい。

またポリペプチド（１）は非グリコジル化ポリペプチド
であることが好ましい。

反応は、緩衝液を用いることが好ましく、緩衝液は無機
酸（例、リン酸、酢酸など）または有機酸（例、酢酸な
ど）と無機塩基（例、ナトリウム、カリウム、アンモニ
ウムなど）との塩からなるもので、該酵素反応を阻害し
ないものであればいずれでもよい。

反応のｐＨは約４〜１０の間、とりわけ約６〜９の間が
酵素およびポリペプチドの安定性の面でより好ましい。

反応時間は約１〜１００時間の間であればいずれでもよ
い。反応温度は約４〜７０℃で行なわれ、約１５〜７０
℃が好ましく、とりわけ約３０〜５０℃の間が好ましい
。　　″　゛反応に用いるアミノペプチダーゼの量は基
質であるポリペプチド（１）に対して約１／１００（１
〜１ｉｔ（モル比）であればよいが約１／１００〜１１
５量（モル比）程度が収率３反応時間、経済性の面から
好ましい。市販のアミノペプチダーゼをそのまま用いる
場合は、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ、プロク
ターゼなどが混在しているので、これらの混在する酵素
をクロマトグラフィー等通常の分離手段により分離する
か、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦ”Ｐ）、パラ
クロロマーキュリ−安息香酸（Ｐ’ＣＭＢ）等の阻害剤
を添加してその活性を阻害するか、これら両操作を組合
せて処理することが好ましい。

本発明の製造法においては、アミノペプチダーゼを固定
化して用いてもよい。

固定化に用いる担体としてはアミノペプチダーゼと結合
し得るものであればいかなるものでもよいが、水に不溶
性でかつ高い親和性を有するポリマーが特に有利に用い
られる。このようなポリマーとしては、たとえばセルロ
ースもしくはその誘導体、架橋デキストランもしくはそ
の誘導体、アガロースもしくはその誘導体およびポリア
クリルアミドなどのホモポリマーや、アガロースとポリ
アクリルアミドとのコポリマーなどが挙げられる。

アミノペプチダーゼと担体とを共有結合させるには、ア
ミノペプチダーゼと担体とを直接結合させてもよいが、
スペーサーを介して結合させることもできる。アミノペ
プチダーゼと担体とを直接結合させるに際しては担体を
アミノペプチダーゼと結合し得るように活性化する。こ
のためには臭化シアンなどのハロゲン化シアンを用いる
方法などが挙げられる。また、スペーサーを介して結合
させるに際しては、たとえば式　Ｈ２Ｎ−（ＣＨ，）ｎ
−ＮＯ３（式中ｎは１〜１０の整数）、　ｔｌ、Ｎ−（
Ｃ）ｉ−）ｎ−ＣＯＯＨ（式中ｎは１−１０の整数）　
、　ＩＩＪ　　（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＩＩＣ
Ｏ（Ｃ１ｌｔ）ｎ　　Ｃ０ＯＨ（式中ｍは１〜３の整数
、ｎは正の整数）などで表わされるスペーサーを予め担
体に導入したものを担体として、！＝エチルー３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの水溶
性カルボジイミドを用いてアミノペプチダーゼと結合さ
せる方法を用いることができる。また、同じくスペーサ
ーを介して結合させるに際して、スペーサーのカルボキ
シル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどでエステル
化して得られる活性エステル誘導体などの活性基を導入
した担体を用いることもできる。さらに、スペーサーに
アルデヒド基を導入し、水素化シアノホウ素ナトリウム
などを用いて還元的アミノ化反応を行い、アミノペプチ
ダーゼと担体とを結合させることもできる。

担体とアミノペプチダーゼとを共有結合させるには、た
とえば活性化した担体または活性基を導入した担体とｐ
Ｈ約２〜１２．好ましくは約ｐＨ３〜１１で、温度約０
〜５０°Ｃ１好ましくは約４〜３０℃で混合し、約１０
分〜２４時間、好ましくは約２〜１６時間ゆっくりと攪
拌してカップリング反応を行わせる。本反応に際して、
アミノペプチダーゼが担体と非特異的にイオン吸着する
ことを防止するため、当該反応を阻害しない塩類（たと
えばＮａＣ１、ＮａｔＨＰＯ２など）を添加してもよい
。

カップリング反応を行ったゲルをろ別あるいは遠心分離
法で集め、グリシンやエチルアミンなどの一部アミンな
どを用いて未反応の活性基をブロックしたあと、リン酸
緩衝液などでよく洗浄し、アミノペプチダーゼと結合し
た担体、すなわち固定化アミノペプチダーゼを得ること
ができる。

本固定化アミノペプチダーゼは、先のアミノペプチダー
ゼ単独の場合とほぼ同様に使用できるが、例えば、原料
として用いるポリペプチド（１）は精製品でも、精製過
程で得られる部分精製品でもよい。反応は緩衝液を用い
ることが好ましく、緩衝液としてはリン酸、酢酸、ホウ
酸などとナトリウムまたはカリウム、アンモニウムとの
塩からなるもので、該酵素反応を阻害しないものであれ
ばいずれでもよい。反応のＩ）Ｈは約４〜１０の間、な
かんずく約６〜９の間が酵素およびポリペプチドの安定
性の面でより好ましい。反応時間は約１〜２００時間の
間であればいずれでもよいが、約１〜１００時間が好ま
しい。反応温度は約４〜７０℃であり、約１５〜７０℃
の間が好ましく、なかでも約３０°〜５０℃の間が好ま
しい。

反応の進行は、例えば、反応液の一部をアミノ酸分析計
で分析し、遊離されたメチオニンを定１するか、反応液
の一部をファースト・プロティン・液体クロマトグラフ
ィー（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＬｉｑｕｉｄＣｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：　ＦＰＬＣ）など等電点の差
異に基ずく分析手段で分析することにより追跡すること
ができ、また生成物はアミノ末端アミノ酸配列分析やア
ミノ酸分析により確認することもできる。

反応生成物は、所望により抽出、塩析１分配、再結晶、
クロマトグラフィーなど公知の蛋白質やペプチドの精製
手段に付すことができる。

本発明により製造されるポリペプチド（Ｉｆ）はそのア
ミノ末端にＭｅｔを有さず、また天然の生理活性ポリペ
プチドと同一のアミノ酸配列を有するものとして得られ
るので、天然のポリペプチドと同様の活性を有し低毒性
で安全に医薬品や診断用薬剤として使用できる。

本発明方法により、メチオニンの付加した蛋白質からＮ
−末端メチオニンを特異的に除去することができる。

また、本発明方法において用いられるアミノペプチダー
ゼを固定化して用いると、該酵素は繰り返し用いること
ができるので効率が良い。

本願明細書および図面において、アミノ酸を略号で表示
する場合、Ｉ　ＵＰＡＣ−Ｉ　ＵＢ　　Ｃｏｍｍ１−ｓ
ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｊｃａｌ　Ｎｏｍｅｎ
ｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣
用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。また
、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明
示しなければＬ一体を示すものとする。

ｃｒｙ　　：　　グリシン Ａｌａ　　：　　アラニン Ｖａｌ　　：　　バリン Ｌｅｕ：　　ロイシン ｌｉｅ：　　イソロイシン Ｓｅｒ：　　セリン Ｔｈｒ　　：　　スレオニン Ｃｙｓ　　：　　システィン Ｍｅｔ　　：　　メチオニン ｃｔｙ　　：　　グルタミン酸 Ａｓｐ　　：　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　：　　リジン Ａｒｇ　　：　　アルギニン Ｈｉｓ　　：　　ヒスチジン Ｐｈｅ　　：　　フェニールアラニン Ｔｙｒ　　：　　チロシン Ｔｒｐ　　：　　）リプトファン Ｐｒｏ：　　プロリン Ａｓｎ　　：　　アスパラギン Ｇｉｎ　　：　　グルタミン Ａｓｐ　　＆　　Ａｓｎ　　：　　アスパラギン酸およ
びアスパラギン Ｇｌｕ　　＆　　Ｇｉｎ　　：　　グルタミン酸および
グルタミン 以下の実施例および参考例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

なお参考例２に開示した形質転換体、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｎ４８３０
／ｐＴＢ２８５は財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に昭和
６０年４月２５日からＩ　Ｐ　Ｏ１４４３７として寄託
され、また昭和６０年４月３０日から通商産業省工業技
術院微生物工業技術研究所（ＦＲｒ）にＦＥＲＭ　　Ｐ
−８１９９として寄託され、該寄託はブダペスト条約に
基づく寄託に切換えられて、受託番号１？’ＥＲＭ　　
ＢＰ−８５２として同研究所（ＦＲＩ）に保管されてい
る。

また、参考例４において用いられた形質転換体エシェリ
ヒア・コリに１２χｔ７７６／ｐＨＧＨ１０７（Ａ　Ｔ
Ｃｏ　　３１５３８）は、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション・カタログ・オプ・バクテリア・フ
ァージズ・アンド・アールディーエヌエイ・ベクターズ
（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉａ、　Ｐｈａｇｅｓ　ａｎｄｒＤＮＡ　Ｖｅｃｔ
ｏｔｓ）第１６版、　１９８５年に掲載されており、財
団法人発酵研究所（［ＦＯ）に昭和６１年４月２３日か
らＩＦＯ１４５０５として寄託されている。

また、インターロイキン−２の生物活性の測定はインタ
ーロイキシン−２依存性細胞を用いる日沼らの方法［バ
イオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）、　１０
９．３６３（１９８２）］に従って行った。

以下の実施例および参考例においては、遺伝子工学手法
により製造されたヒトｒＬ−２につき、そのアミノ末端
がＨ−Ｍｅｔ　−Ａ　１ａ−Ｐｒｏであるもの（第１図
で示されるポリペプチドのアミノ末端にメチオニンを有
するもの）をＭｅｔ−ｒ　Ｔ　Ｌ　−２と、そのアミノ
末端がＨ−Ａ’１ａ−Ｐｒｏであるもの（第１図で示さ
れるポリペプチド）をｒｌＬ−２と略称する。

また、以下において、組換え型ヒト成長ホルモンをｒｈ
ＧＨと略称することもある。

実施例１　アミノペプチダーゼＭによるＭｅｔ　−ｒ　
ＩＬ−２からｒＩＬ−２への変換 参考例２（ｖｉｉ）で得たＭｅｔ−ｒ　Ｉ　Ｌ　−２の
４．２ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　
４　ｍｌ中、０．１７ｍｇのＤＦＰおよびＰＣＭＢ処理
［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、）、　９４．６１９（１９８３）コアミノ
ペプチダーゼＭと３７℃で反応させた。

０時間、５時間、２Ｑ時間および４４時間の各時間に反
応液からサンプリングし、反応液中の遊離のアミノ酸を
日立製８３５型アミノ酸分析計により、Ｍｅｔ　−ｒＩ
Ｌ−２の挙動をＦＰＬＣで分析した。その結果、第１表
に示すように反応液中にはメチオニンの経時的な増加が
観察された。

第　　ｌ　　表 反応時間　　　遊離したアミノ酸 （時間）　　　（モル１モルＭｅｔ−ｒｌＬ−２）（ｌ
　　　　　　　　Ｍｅｔ　　（０）５　　　　　　　　
Ｍｅｔ　　（０，１３）２０　　、　　　　　　Ｍｅｔ
　　（０，３４）４４　　　　　　　　Ｍｅｔ　　（０
，４７）一方、ＦＰＬＣにおいては、第２図に示すよう
に、Ｍｅｔ−ｒ　Ｉ　Ｌ　−２・であるピーク２の経時
的な減少を、新らたに生成したピークｌの経時的な増加
が観察された。反応２０時間でのピーク２からピーク１
への変換率は約４０％であった。そこで、新らたに生成
したピークｌがｒＩＬ−２であり、ピーク２が未反応の
Ｍｅｔ−ｒ　Ｉ　Ｌ　−２であることを確認するため、
反応２０時間の反応液１．９ｍｌを用いて、ＦＰＬＣに
よりピークｌおよびピーク２画分を分取した。次に、Ｆ
ＰＬＣで用いたポリバッファーを除去するため、トリフ
ルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とする高速液
体クロマトグラフィーを行なった。

カラム、ウルトラボアＲＰ　Ｓ　Ｃ（１，０Ｘ　２５ｃ
ｍ、アルテックス社製）；カラム温度、２５℃：溶出溶
媒Ａ、Ｑ、Ｌ％トリフルオロ酢酸−４５％アセトニトリ
ル：溶出溶媒Ｂ、０．１％トリフルオロ酢酸−６６％ア
セトニトリル；溶出プログラム、０分、１００％Ａ−１
２分、１００％Ｂ：　溶出速度３．０ｍｌ／ｍｉｎ、こ
のクロマトグラフィーによって得られたピーク画分をそ
れぞれ凍結乾燥に付し、白色粉末を得た。ＦＰＬＣにお
けるピークｌおよびピーク２から得られたものを、それ
ぞれＰＩおよびＰ２となずけた。

Ｐｉの収量は０．２８ＤＣ１４％）、Ｐ２の収量は０．
７２ｍｇ（３６％）であった。

次に得られたＰＩおよびＰ２について蛋白化学的分析を
行った。Ｐ　１　（２１μｇ、１．４ｎｍｏｌ）および
Ｐ２　（２６μｇ、　１．７ｎｍｏｌ）を用い、気相プ
ロテインシークエンサー（アプライド・バイオシステム
ズ社製４７０Ａ型）を用いる自動エドマン分解法により
ＰＩおよびＰ２のアミノ末端アミノ酸配列を決定した。

フェニルチオヒダントインアミノ酸（Ｐ　Ｔ　Ｈ−アミ
ノ酸）はミクロパック５Ｐ−ＣＩ８カラム（パリアン社
製）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより同定し
た。各ステップで検出されたＰＴＨ−アミノ酸を第２表
に示す。

第　　２　　表 ２　　Ｐｒｏ　（０，７１）　　Ａｌａ　（０，７３）
３　　Ｔｈｒ　（０，４７）　　Ｐｒｏ　（０，５３）
４　　Ｓｅｒ　（０，２３）　　Ｔｈｒ　（０，２２）
カルボキシル末端アミノ酸の分析は次のようにして行っ
た。すなわちＰＩおよびＰ２をヒドラジン分解用ガラス
管にとり、無水ヒドラジンを加えて減圧下に封管したの
ち１００℃で６時間加熱した。

得られたヒドラジン分解物をベンズアルデヒド処理した
のち、遊離アミノ酸を日立製８３５型アミノ酸分析計に
より測定した。その結果、ＰｌおよびＰ２ともにスレオ
ニンのみが検出され、回収率はそれぞれ５１．０％およ
び４８．０％であった。このことがらＰｉおよびＰ２の
カルボキシル末端アミノ酸はスレオニンと同定された。

アミノ酸組成分析は４％チオグリコール酸を含む定沸点
塩酸を加えて減圧下に封管後、１１０℃で２４．４８．
７２時間、加水分解し、日立製８３５型アミノ酸分析計
により実施した。シスチンおよびシスティンは過ギ酸酸
化したのち、減圧下定沸点塩酸中で２４時間加水分解し
てアミノ酸分析計によりシスティン酸として定量した。

アミノ酸分析値は２４．４８および７２時間の加水分解
で得られた値を平均して求めた。ただし、セリンおよび
スレオニンの値は加水分解時間を０時間に外挿して求め
た。

その結果を第３表に示す。

第　　３　　表 組　成　比　　　　ｃＤＮＡ塩基配列 Ａｓｐ　＆　Ａｓｎ　　１２．０　１２．０　１２．０
　　　　　１２Ｔｈｒ　　　　　１２．７　１２．６　
１２．５　　　　　１３Ｓｅｔ　　　　　　７．６　７
．７　７．７　　　　　　８Ｇｌｕ　＆　Ｇｉｎ　　１
８．３　１８．２　１８．２　　　　　１８Ｐｒｏ　　
　　　　４．７　４．７　４．７　　　　　　５Ｇｌｙ
　　　　　　２．３　２．２　２．１　　　　　　２Ａ
ｌａ　　　　　　５．１　５．１　５．０　　　　　　
５）１−Ｃｙｓ　　　　　２．６　２．５　２．５　　
　　　　３Ｍａｌ　　　　　　４．１　４．１　３．９
　　　　　　４Ｍｅｔ　　　　　　３．７　４．６　４
．５　　　　　　４１ｉｅ　　　　　　８．１　８．１
　８．０９Ｌｅｕ　　　　　２０．８　２０．９　２０
．８　　　　　２２Ｔｙｒ　　　　　　３．１　３．２
　３．０　　　　　　３Ｐｈｅ　　　　　　５．９　６
．０　５．９　　　　　　６Ｌｙｓ　　　　　１０．９
　１１．１　１１．０　　　　　１１Ｈｉｓ　　　　　
　３．１　３．３　３．１　　　　　　３Ａｒｇ　　　
　　　４．０　４．０　３．９　　　　　　４Ｐ１およ
びＰ２の単一性をレムリの方法［ネイチｙ（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、　２２２．６８０−６８５（１９７０）］に従い
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　
−ＰＡＧＥ）により分析した。アクリルアミド濃度は１
５％で行ない、ＰＩおよびＰ２はそれぞれ７μｇを負荷
した。第３図に示すように２−メルカプトエタノールで
の還元および非還元のいずれの条件下でもＰＩおよびＰ
２は単一バンドを示した。アミノ末端アミノ酸配列分析
、アミノ酸組成分析および５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分析結果から、ＰＩはｒｌＬ−２を
、Ｐ２はＭｅｔ−ｒＩＬ−２を含んでいることが確認さ
れた。

次にＰｉおよびＰ２のＩＬ−２活性を８沼らの方法［前
出］に従って測定した。その結果、ＰＩの比活性は３５
９００Ｕ／ｍｇ、　Ｐ　２の比活性は３７０００Ｕ／ｍ
ｇであり、Ｍｅｔ−ｒ　Ｔ　Ｌ　−２からｒＩＬ−２へ
の変換反応の原料として用いたＭｅｔ−ｒ　Ｉ　Ｌ　−
２の比活性３５８００Ｕ／ｍｇと同程度であった。

なお、Ｍｅｔ−ｒ　Ｉ　Ｌ　−２に対するＤＦＰおよび
ＰＣＭＢ処理アミノペプチダーゼＭｆｆｉを上記の５倍
量用いて同様に反応させ、反応の経時変化をＦＰＬＣお
よび反応液中の遊離のメチオニンの分析により追跡した
。その結果、反応２，５，２０．および４４時間でＭｅ
ｔ−ｒＩＬ−２１モルにつき、０．１？、　０゜２９、
０．６９および０．９８モルの遊離のメチオニンが検出
され、ＦＰＬＣでそのメチオニン量に対応する、−ＩＬ
−２のピークが観察された。この結果から、Ｎｅｔ−ｒ
　Ｉ　Ｌ　−２に対する酵素量を増やすことにより、Ｍ
ｅｔ−ｒ　Ｉ　Ｌ　−２からｒｌＬ−２へほぼ１００％
変換させることが可能であることが明らかである。

実施例２　アミノペプチダーゼＭ−セルロファインによ
るＮｅｔ−ｒｌ　Ｌ　−２からｒｒＬ−２への変換 参考例１で得たアミノペプチダーゼＭ−セルロファイン
０．５ｍｌに参考例２（ｖｉｉ）で得たＭｅｔ−ｒ　Ｉ
　Ｌ　−２を１　、０５ｍｇ含む１．０ｍｌの０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加え、攪拌しながら３
７℃で４時間反応させた。反応終了後、反応液をカラム
から溶出し、１ｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）用いて、反応液をカラムから十分に回収した。得
られた反応夜中の遊離のアミノ酸の分析およびＦＰＬＣ
による分析を、実施例１に記載の方法で実施した。アミ
ノ酸分析の結果、メチオニンの遊離はＭｅｔ　−ｒ　Ｉ
　Ｌ−２１モルあたり０．１モルであった。一方、ＦＰ
ＬＣにおいては、ｒｌＬ−２の生成が認められた。

また、アミノペプチダーゼＭ−セルロファイン量を多く
し、反応時間を長くするとＭｅｔ−ｒｌＬ　−２からｒ
ＩＬ−２への変換率が大巾に改善された。

すなわち、６ｍｌの５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６，
０）に溶解したＭｅｔ−ｒＩＬ−２ｌｏｍｇにアミノペ
プチダーゼＭ−セルロファイン１０ｍ１を加え、攪拌し
ながら３０℃で４００時間反応せた。反応４０時間に、
反応液をＦＰＬＣで分析した結果、ｒＩＬ−２の溶出位
置にピークが観察され、面積比から算出された変換率は
約５０％であった。このｒＩＬ−２の溶出位置に認めら
れるピークがｒＩＬ−２であることを確認するため、こ
のピーク画分を分取し、実施例１と同様の方法で、ウル
トラポアＲＰＳＣカラムを用いるＨＰＬＣにより、試料
中に含まれているポリバッファーを除去したのち、実施
例１と同様の方法で、蛋白化学的分析を実施した。５ザ
イクルまてのアミノ末端アミノ酸配列は、ＡＬａ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−であり、アミノ酸組成は
、ｃＤＮＡの塩基配列から予想される組成値とよく一致
した。また、比活性は３４４０００／ｍｇであった。こ
れらの結果から、Ｍｅｔ−ｒｌＬ−２をアミノペプチダ
ーゼＭ−セルロファインと反応させることにより、ｒｔ
Ｌ−２に変換できることが明らかになった。

上記アミノペプチダーゼＭ−セルロファインは、繰り返
し用いることができた。たとえば、繰り返し３０回使用
した後も、Ｎｅｔ−ｒＩＬ−２からｒＩＬ−２への変換
率に低下は認められなかった。

実施例３　アミノペプチダーゼＭ−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ−
１５によるＮｅｔ−ｒｌＬ−２からｒｌＬ−２への変換
： 参考例３で得たアミノペプチダーゼＭ−Ａｆｆｉ−Ｇｅ
ｌ−１５１，５ｎ＋１に参考例２（ｖｉｉ）で得たＭｅ
ｔ−ｒｔＬ−２１，０５ｍｇを含む１．０ｍｌの０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加え、攪拌しながら
３７℃で４時間反応させた。反応終了後、反応液をカラ
ムから溶出し、１ｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
４，０）によりカラムを洗浄し、反応液を回収した。反
応液中の遊離のアミノ酸の分析およびＦＰＬＣによる分
析を実施例１に記載の方法で実施した。アミノ酸分析の
結果、遊離されたメチオニンはＮｅｔ−ｒＩＬ−２１モ
ルあたり０．０５モルであった。一方、ＦＰＬＣにおい
てはｒｌＬ−２に相当するピークｈく観察された。

実施例４　市販の固定化アミノペプチダーゼＭによるＭ
ｅｔ−ｒｌＬ−２からｒｌＬ−２への変換： 市販の固定化アミノペプチダーゼＭ（アガロースに固定
、　０．５０／ゲル１ｍ１）はピアス社（アメリカ）よ
り購入して使用した。固定化アミノペプチダーゼＭ　１
．０ｍｌに参考例２（ｖｉｉ）で得たＮｅｔ−ｒｌＬ−
２１，０５＋ｎｇを含む１．０ｍｌの（１，０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加え、攪拌しながら３７℃で
４時間反応させた。反応終了後、反応液をカラムから溶
出し、１ｍｌの００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
より反応上ンー山二Ｉ払−−半心１−面＋１ＶＩナー　
瓜ちれた反応’＆中の遊離のアミノ酸の分析およびＦＰ
ＬＣによる分析を、実施例１に記載の方法で実施した。

アミノ酸分析の結果、メチオニンの遊離はＮｅｔ−ｒｌ
Ｌ−２１モルあたりＱ、０５モルであった。一方、ＦＰ
ＬＣにおいては、ｒＩＬ−２に相当するピークが認めら
れた。

実施例５　アミノペプチダーゼＭによるＭｅｔ　−ｒｈ
ＧＨからｒｈＧＨへの変換： 参考例４で得た！Ａｅｔ　−ｒｈＧ　Ｈ１，ｏｍｇを１
．ｏｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中、
ＤＦ’ＰおよびＰＣＭＢ処理アミノペプチダーゼＭ３８
μｇと３７℃で反応させた。０，５．２４および４８時
間に反応液から０．２ｍｌずつサンプリングし、反応液
中の遊離のアミノ酸を分析した。その結果、第４表に示
したように、メチオニンの経時的な増加か認められた。

第　　４　　表 反応時間　　遊離したアミノ酸 ＯＭｅｔ　（０） ５　　　　　　　Ｍｅｔ　（０，０４）２４　　　　　
　　Ｍｅｔ　（０，２４）また、メチオニン以外の遊離
のアミノ酸は検出されなかった。次に、この４４時間の
反応液をＭｏｎｏ　Ｐカラム（ファルマシア社製）を装
備したＦＰＬＣに負荷したところ、Ｎｅｔ−ｒｈＧＨの
ピーク以外にｈＧＨと思われるピークが新たに出現した
。

このピーク画分を分取し、実施例１で述べた方法に従い
、蛋白化学的分析を実施した。その結果、生成物のアミ
ノ末端アミノ酸配列はＰｈｅ−Ｐｒｏ−であり、カルボ
キシル末端アミノ酸はフェニルアラニンであり、アミノ
酸組成はｈＧＨのｃＤＮＡの塩基配列から予想される組
成値とよく一致した。これらの結果は、Ｍｅｔ−ｒｈＧ
ＨをＤＦＰおよびＰＣＭＢ処理アミノペプチダーゼＭと
反応させることにより、Ｍｅｔ−ｈＧＨのアミノ末端メ
チオニンのみを遊離させ、ｒｈＧＨに変換することがで
きることを示している。

実施例６　アミノペプチダーゼＭ−セルロファインによ
るＭｅｔ−ｒｈＧＨからｒｈＧＨへの変換： ２ｍｌのＯ，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に参考
例４で得たＭｅｔ−ｒｈＧＨ１，１ｍｇを溶解し、次い
でアミノペプチダーゼＭ−セルロファイン３ｍｌを加え
、攪拌しながら４８時間反応させた。反応の０．２４お
よび４８時間に０．２ｍｌずつサンプリングし、遊離の
アミノ酸をアミノ酸分析計により調べた。

その結果、反応２４時間および４８時間ではそれぞれ９
％および１２％のメチオニンが検出され、メチオニン以
外の遊離のアミノ酸は検出されなかった。この結果は、
Ｍｅｔ　−ｒｈＧ　ＨをアミノペプチダーゼＭ−セルロ
ファインと反応させることにより、アミノ末端メチオニ
ンのみが遊離し、ｒｈＧＨに変換したことを示している
。

参考例１　　固定化アミノペプチダーゼＭの製造方法 アミノペプチダーゼＭ０．５１ｍｇを１ｍｌの０．２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、ホルミル・セル
ロファイン（セルロース誘導体）（生化学工業）［予め
グラスフィルター上で蒸留水及び０．２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７’、０）で洗浄］１ｍｌを加えて、室温で３０
分間攪拌した。次に、水素化シアノホウ素ナトリウム２
０ｍｇを加えて、攪拌しながら４℃で２００時間反応せ
た。反応終了後、ゲルをグラスフィルターでろ過し、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄した。次に、
ゲルを０．０５Ｍモノエタノールアミン・塩酸（ｐＨｇ
、ｏ）１　ｍｌ中に入れ、４℃で３時間反応させた後、
グラスフィルターでろ過し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で洗浄した。このようにして、アミノペプチ
ダーゼＭ−セルロファイン０．６ｍｌを得た。ろ液及び
洗液を透析後、ＢＩＯ−ＲＡＤ社のプロティン・アツセ
イキ・ソトを用いて、ウシ血清アルブミンを基準に蛋白
量を測定した結果、アミノペプチダーゼＭのホルミルセ
ルロファインへの結合効率は６５％と算出され、ゲル１
ｍｌに結合しているアミノペプチダーゼＭは０．５５ｍ
ｇと算出された。アミノペプチダーゼＭ・セルロファイ
ンの酵素活性をメソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、　１９
．５１４（１９７１）に記載の方法に従い、アラニル−
ｐ−ニトロアニリド氷解活性を指標にして測定した結果
、ゲル１ｍｌあたり０．５９０であった。ＩＵは３７６
Ｃ，ｐＨ７，０の条件下で、１分間あたり１ミクロモル
のｐ−ニトロアニリンを遊離する酵素潰で表わしている
。

参考例２　　非グリコジル化ヒトインターロイキン−２
の製造 （ｉ）　　発現用プラスミドの構築 ヒトＩＬ−２遺伝子を有するプラスミドｐ　Ｉ　ＬＯＴ
１３５−８　［特願昭５８−２２５０７９号（昭和５８
年１１月２８日出願）（特開昭６０−１１５５２８号に
反応。）明細書実施例１（ｖｉｉ）参照］を制限酵素Ｈ
ｇ１Ａ［で切断した。

得られた１２９４ｂｐＤ　Ｎ　Ａ断片をＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼで平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
、恥旦Ｒ１リンカ−ｄＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧ
ＧＣＡを結合させた。得られたＤＮＡをＥｃｏＲｌで消
化し、翻訳開示コドン＾ＴＧおよびヒ）ＩＬ−２遺伝子
を有するＤＮＡ断片を得た。

このＤ　Ｎ　Ａ断片を、あらかじめＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ
１部位を消化したｐｔｒｐ７８１［ヌクレイツク・アン
ス・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
）、旦、　３０７７（１９８３）］にＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて挿入した。かくして得られた発現用プラスミ
ドｐＴＦ　ｌはｔｒｐプロモーターの下流に翻訳開示コ
ドンとヒトＩＬ−２遺伝子を有する（第４図）。

プラスミド［）ＴＦ　ｌを制限酵素５ｔｕｌで切断し、
Ｂａｍ旧リンカ−と結合させた。このプラスミドＤＮＡ
を制限酵素Ｂａｍ旧およびＥｃｏＲＩで処理し、ついで
ＥｃｏＲｌ−Ｂａｍ旧部位にλＰＬプロモーターを有す
るプラスミドｐＴ８２８Ｌに挿入した。かくして得た発
現用プラスミドをｐＴＢ２８５と命名した（第５図）。

（１１）形質転換体の製造 上記で得たプラスミドＩ）ＴＢ２８５でエシェリヒア・
コリＮ４８３０をコーエンらの方法［プロシーディンゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス
（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳ
Ａ、　６９．２１１０（１９７２）］に従い形質転換し
、上記プラスミドを含有する形質転換体エシェリヒア　
コリＮ４８３０／Ｉ）ＴＢ２８５を得た。

（ｉｉｉ）　　形質転換体の培養 形質転換体エシェリヒア・コリ　Ｎ４８３０／１）ＴＢ
２８５（ＩＦＯ１４４３７，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８５２
）を２５０ｍ１容フラスコ内のバクト・トリプトン（デ
ィフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）１％、バクト・イ
ーストエキス（ディフコ・ラボラトリーズ、アメリカ）
０．５％１食塩０．，５％およびアンピシリン５０μｇ
／ｍｌを含む液体培地（ｐＨ７，０）５０ｍｌに接種し
て３７℃で一晩回転振盪培養した。この培養液をカザミ
ノ酸０．５％、グルコース０．５％およびアンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含むＭ９培地２．５９の入った５２容
ジャーファーメンタ−に移し３５℃で６時間、ついで４
２℃でさらに３時間通気攪拌培養して培養液２．５９を
得た。この培養液を遠心分離し、菌体を集め、−８０℃
で凍結して保存した。

（ｉＶ）　　抽出 凍結菌体２０ｇを７Ｍ塩酸グアニジンＯ，１Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＩｌＣＩを含む抽出（ｐＨ７，０）ＬＱＱｍｌに均
一に懸濁し、４°Ｃ１時間攪拌した後、２８．０００Ｘ
ｇで２０分間遠心分離し上清を得た。

（ｖ）　　インターロイキン−２蛋白質の部分精製得ら
れた上清を０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣ１緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）に対して透析後１９．ＯＯＯＸｇで１０分間
遠心分離して得た上清を０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
緩衝液（ｐＨ８，５）で平衡化したＤＥ５２（ＤＥＡＥ
−セルロース、ワットマン社製、イギリス）カラム（５
０ｍｌ容）に通して蛋白を吸着後、ＮａＣｌａ度直線勾
配（０〜０．１５Ｍ　　ＮａＣ１，１９）を作成して、
ｒｌＬ−２を溶出させ、活性画分を得た。

（ｖｉ）　　インターロイキン−２蛋白質の精製上記で
得られた活性画分をＹＭ−５メンプラン（アミコン社製
、アメリカ）を用いて、５ｍｌに濃縮し、０．１Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（［）Ｈ８，０）　−１Ｍ　ＮａＣ１緩
衝液で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシ
ア製、スウェーデン）カラム（５００ｍｌ容）を用いて
ゲルろ過を行った。活性画分４０ｍ１をＹＭ−５メンプ
ランで３ｍｌに濃縮した７得られたａ補液を、ウルトラ
ポアＲＰＳＣ（アルテックス社製、アメリカ）カラムに
吸着させ、トリフルオ・ロ酢酸−アセトニトリル系を溶
出溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行った。カ
ラム、ウルトラポアＲＰＳＣ（４、６ｘ　７５＋ｎｍ）
　；カラム温度、３０℃：溶出溶媒Ａ、　０．１％トリ
フルオロ酢酸−９９，９％水；溶出溶媒Ｂ、　０．１％
トリフルオロ酢酸−９９，９％アセトニトリル；溶出プ
ログラム、０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−２５分（５５
％Ａ＋４５％Ｂ）−３５分（４５％Ａ＋５５％Ｂ）−４
５分（３０％Ａ＋７０％Ｂ）−４８分（１００％Ｂ）；
溶出速度、　Ｑ、３ｍ１７ｍ１ｎ；検出波長、　２３０
ｎｍ０本条件下で保持時間約３９分の活性画分、ｒｌＬ
−２およびＭｅｔ−ｒ　Ｉ　Ｌ　−２の混合物１０ｍ１
を集めた。

（ｖｉｉ）　　ｓｐ−ｓｐｗカラムによるｒｌＬ−２と
Ｍｅｔ−ｒｌＬ−２との分離 （ｖｌ）で得られたｒＩＬ−２およびＭｅｔ−ｒ　Ｉ　
Ｌ　−２の混合物である非グリコジル化ヒトインターロ
イキン−２を含む、０．００５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ５，０，蛋白質濃度１．（１３ｎ＋ｇ／ｍ１）
０．５ｍｌを０．０２５Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ（７，４
）で平衡化した高速液体クロマトグラフィー用５Ｐ−５
ＰＷカラム（０，７５Ｘ　７，５ｃｍ；東洋曹達社製）
にのせ０．０２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用い
て蛋白質を溶出した。カラム温度は３５℃に、緩衝液の
流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎに設定した。

クロマトグラフシステムはバリアン社製５５００型液体
クロマトグラフを用いた。

その結果、非グリコジル化インターロイキン−２は２つ
のピーク（ピークＡおよびピークＢ）として溶出された
。それぞれのピークを分取しアミノ末端アミノ酸の分析
を行った結果、ピークＡはＭｅｔ−ｒ　Ｉ　Ｌ　−２を
、ピークＢはｒＩＬ−２をそれぞれ９９．５％以上の純
度で含んでいることが確認された。　ピークＡの両分を
凍結乾燥して白色粉末を得た。

参考例３　固定化アミノペプチダーゼＭ（アミノペプチ
ダーゼＭ−Ａｆｒｉ−Ｇｅｌ−１５）の製造方法ニ アミノペプチダーゼＭ０．４９ｍｇを０，１Ｍ重炭酸ナ
トリウム（ｐＨ８，１）に溶解し、予め冷蒸留水で洗浄
したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ−１５（アガロース誘導体０Ｂｉ
ｏ−ＲａｄＬａｂｓ）　１　ｍｌを加えて、４℃で５時
間攪拌しながら反応させた。反応終了後、ゲルをグラス
フィルター上でろ過し、Ｑ、１Ｍ重炭酸ナトリウム（１
）Ｈ８，１）で洗浄した。次にゲルを１ｍｌの１Ｍモノ
エタノールアミン・塩酸（ｐＨ８，０）中に入れ、４℃
で１時間攪拌しながら反応させたのち、グラスフィルタ
ー上でろ過し、６ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐ
Ｈ８，１）でゲルを洗浄した。このようにして１．６ｍ
ｌのアミノペプチダーゼＭ　−Ａｆ　ｒ　ｉ　−Ｇｅｌ
−１５を得た。

ＡｆＴｉ−Ｇｅｌ−１５へのアミノペプチダーゼＭの結
合効率は、ろ液および洗液のｐＨを塩酸で１．５〜２．
０まで下°げてそれらの波長２８０ｎｍにおける吸光度
を測定することにより求めた。その結果、結合効率は５
７％と算出され、ゲル１ｍｌあたりに結合しているアミ
ノペプチダーゼＭは０．１７ｍｇと算出された。

また、得られたアミノペプチダーゼＭＡｆｆｉ−Ｇｅ１
１５の酵素活性を参考例１に記載の方法に従い、アラニ
ル−ｐ−ニトロアニリド氷解活性を指標にして測定した
結果、０．４２０／ゲル１ｍｌであった。

参考例４Ｍｅｔ−ｒｈＧＨの製造： （ｉ）　　生産菌 ＡＴＣＣより分譲されたヒト成長ホルモン遺伝子を有す
る形質転換体エシェリヒア・コリ　Ｋ１２χ１７７６／
ｐＨＧＨ１０？（ＡＴＣｏ　　３１５３Ｂ）を使用した
。

（ｉｉ）培養 形質転換体エシェリヒア・コリ　Ｋ１２χ１７７６／ｐ
ＨＧＨ１Ｇ？（ＡＴＣＣ３１５３８，ＩＦＯ１４５０５
）を２Ｑ容マイヤーのバクト・トリプトン１％、バクト
・イースト０．５％１食塩０．５％、テトラサイクリン
・塩酸１０ｍｇ／ｉ２．アンピシリン・ナトリウム１０
ｍｇ／１２．チミン２０　ｍｇ／Ｑおよびジアミノピメ
リン酸１００　ｍｇ／１２を含む液体培地（ｐＨ７，０
）　Ｉ　Ｑに接種して３７℃で一晩回転振盪培養した。

この培養液を、リン酸ｌ水素ナトリウム１．６８％、リ
ン酸２水素カリウム０．３０％、塩化アンモニウム０．
１０％１食塩０．０５％、消泡剤２００ｍｇ／１２．グ
ルコース１．００％。

カザミノ酸１．００％、硫酸マグネシウム２４６ｍｇ／
１２．テトラサイクリン・塩酸１０ｍｇ／Ｑ、アンピシ
リン。

ナトリウムｔｏｍｇ＃！、チミン２０　ｍｇ、／Ｑおよ
びジアミノピメリン酸１００ｍｇ＃２を含む液体培地（
ｐＨ６，８）２０Ｑの入った５０ｆ２容ジャーファーメ
ンタ−に移し、３７℃で１０時間通気攪拌培養した。こ
の培養液を遠心分離し、菌体を集め、−８０℃で凍結し
て保存した。

（ｉｉｉ）　　Ｍｅｔ−ｒｈＧＨの精製：上記（ｉｉ）
で得られた凍結菌体を、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第
２９３巻４０８〜４１１頁（１９８１年）に記載の方法
と同様の方法に付し、Ｍｅｔ−ｒｈＧＨを精製した。す
なわち、凍結菌体（５３ｇ）を、７Ｍグアニジン・塩酸
抽出、透析、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏ−ｐｅａｒｌ　６５０
　Ｓ（東洋曹達）カラムクロマトグラフィー、セファク
リルＳ　−２００（ファルマシア、スエーデン）ゲルろ
過、セファデックスＧ−２５（ファルマシア、スエーデ
ン）ゲルろ過により精製し、２３ｍｇの精製Ｍｅｔ７　
ｒｈＧ　Ｈを得た。

このようにして得られた標品を実施例１と同様の蛋白化
学的分析に付したところ、５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動において単一の挙動を示した。また、アミ
ノ酸組成は、１モルのメチオニンがさらに付加されてい
る点以外については、天然型ｈＧＨのアミノ酸組成と良
く一致した。該標品のアミノ末端アミノ酸配列はＭｅｔ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−であり、カルボキシル末端アミノ酸
はＰｈｅであった。

これらの結果は、ネイチャー第２８１巻５４４頁（１９
７９年）および第２９３巻４０８頁（１９８１年）に記
載のそれらと良く一致した。このことは、上記で得た標
品はＭｅｔ−ｒｈＧＨであることを示している。

発明の効果 本発明方法により、メチオニンの付加した蛋白質のメチ
オニンのみを特異的に除くことができる。

したがって例えば、遺伝子工学手法により製造されたメ
チオニンの付加した蛋白質を原料に、天然のアミノ酸配
列を有する蛋白質を工業的に有利に製造することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で製造されたアミノ末端が）Ｉ−Ａｌａ
−Ｔ’ｒｏであるヒトＩＬ−２（ｒｌＬ−２）のアミノ
酸配列を示す。第２図および第３図は実施例１に開示し
たＰＰＬＣおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果をそ
れぞれ示す。第４図および第５図は参考例２（Ｉ）に開
示するプラスミドｐＴＦ１およびｐＴ　Ｂ　２８５の構
築図をそれぞれ示す。 Ｊ　　　宙　　　−−ご　　　０　　　二４　　　−　
　　　工　　　　）−１（Ｊ！Ｅ−１弗　３ 遺元 ｒｌＬ−と

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式 Ｈ−Ｍｅｔ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙ−ＯＨ ［式中、ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を、Ｙはペプチド鎖
   を示す。］で表わされるメチオニンの付加した蛋白質に
   アミノペプチダーゼを作用させ、式Ｈ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙ
   −ＯＨ ［式中、ＸおよびＹは前記と同意義を有する。］で表わ
   される蛋白質を製造することを特徴とするメチオニンの
   付加された蛋白質からＮ−末端メチオニンを脱離する方
   法。