CN1353755A - 用气单胞菌氨肽酶由多肽除去n末端丙氨酸残基的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了使用由海洋细菌解蛋白气单胞菌衍生的氨肽酶,由多肽(优选重组蛋白质)除去N末端丙氨酸残基的方法。因此,气单胞菌氨肽酶(AAP;E.C.3.4.11.10)可以用于(例如)由人生长激素(hST或hGH)、猪生长激素(pST)、和牛生长激素(bST)的衍生物除去N末端丙氨酰基残基,从而产生具有其天然氨基酸序列的蛋白质。可以在自由的溶液中进行酶反应,或者可以将AAP固定在固相支持物上,用于在体外进行反应。用于(例如)将Ala－hGH转变成hGH的有效方法包括:在大肠杆菌中表达Ala－hGH,回收包涵体,在去污剂中溶解并重新折叠,通过超滤除去去污剂,选择性沉淀,酶切割,然后进行两个柱层析步骤。
Description
优先权
本申请要求根据35U.S.C.§119授予1999年4月30日提交的美国临时申请流水号60/132,062的优先权。
发明领域
本发明描述了使用由海洋细菌解蛋白气单胞菌(Aeromonasproteolytica)衍生的氨肽酶，由多肽(优选重组蛋白质)除去N末端丙氨酸残基的方法。由此，气单胞菌氨肽酶(APP；E.C.3.4.11.10)可以用于(例如)由人生长激素(hST或hGH)、猪生长激素(pST)、和牛生长激素(bST)的衍生物除去N末端丙氨酰基残基，从而产生具有天然氨基酸序列的蛋白质。可以在自由的溶液中进行酶反应，或者可以将AAP固定在固相支持物上，用于在体外进行反应。用于(例如)将Ala-hGH转变成hGH的有效方法包括：在大肠杆菌中表达Ala-hGH，回收包涵体，在去污剂中溶解并重新折叠，通过超滤除去去污剂，选择性沉淀，酶切割，然后进行两种柱层析步骤。
发明背景
非常需要模拟或具有天然蛋白质相同结构的重组蛋白质，这些重组蛋白质可用于治疗性应用，作为疫苗和诊断性检验试剂盒的成分，以及作为结构/功能研究的试剂。一般使用哺乳动物、细菌、和昆虫的细胞来表达用于这些应用的重组蛋白质。然而，当需要大量蛋白质用于实验性或临床性研究时，而且蛋白质能够重新折叠成正确构象，一般使用细菌表达系统。具体而言，当最终的蛋白质产物不要求或不需要真核细胞的翻译后修饰(如糖基化)时，细菌系统与其它表达载体系统相比提供了显著的成本优势。
在细菌(诸如大肠杆菌)中表达的重组蛋白质常常隔绝在不溶性包涵体中。由包涵体收获的异源蛋白质常常保留额外的氨基酸残基，诸如位于氨基末端的甲硫氨酸。然而，由真核宿主细胞收获的天然或重组蛋白质常常不存在由ATG起始密码子编码的这一甲硫氨酸。然而，在大肠杆菌细胞质中产生的许多蛋白质的氨基末端受到酶的加工，诸如甲硫氨酸氨肽酶(Ben Bassat等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169：751-757，1987)，使得表达后一般由N末端切除甲硫氨酸。
蛋白质末端的氨基酸组成以许多不同方式存在差异(Berezovsky等人，蛋白质工程(Protein Engineering)12(1)：23-30，1999)。N-外肽酶活性的系统检验导致了“N末端规则”的发现：若下一个氨基酸是Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Thr、或Val，则切除N末端(f)Met；若下一个氨基酸是Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Ile、Leu、Lys、或Met，则起始(f)Met仍然作为成熟蛋白质的第一个氨基酸。有人提出氨基酸侧链的水合半径是这些发现的物理学基础(Bachmain等人，科学(Science)234：179-186，1986；Varshavsky，细胞(Cell)69：725-735，1992)。蛋白质半衰期(3分钟-20小时)受到N末端氨基酸化学结构的显著影响(Stewart等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270：25-28，1995；Griegoryev等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：28521-28532，1996)。随后使用定点诱变来确认‘N末端规则”，即监测改变了N末端氨基酸序列的重组蛋白质的寿命(Varshavsky，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Aead.Sci.USA)93：12142-12149，1996)。蛋白质N末端氨基酸序列的统计学分析提出，Met和Ala残基过度展示于第1位，而第+2位和第+5位优选Thr(Berezovsky等人，蛋白质工程(Protein Engineering)12(1)：23-30，1999)。然而，C末端偏倚显示，优选带电荷的氨基酸和Cys残基(Berezovsky等人，蛋白质工程(Protein Engineering)12(1)：23-30，1999)。
在有些情况中，保留N末端甲硫氨酸的重组蛋白质的生物学特征与不含N末端甲硫氨酸的天然种类不同。例如，与由天然来源纯化的hGH或以某种方式制备使得一级序列与天然hGH(不含N末端甲硫氨酸)相同的重组hGH相比，保留N末端甲硫氨酸的人生长激素(Met-hGH)能够促进非所需抗体的诱导。治疗性应用一般非常需要生产模拟天然蛋白质结构的重组蛋白质的低成本方法(Sandman等人，生物技术(Bio/Technology)13：504-506，1995)。
用于在细菌中制备天然蛋白质的一种方法是作为较大融合蛋白质的一部分表达所需蛋白质，该融合蛋白质在天然氨基酸序列起点的上游包含内切蛋白酶特异性切割的识别位点。这些识别和切割位点可以是能特异性切断靶向投递至膜或由细胞分泌的蛋白质的N末端信号肽的天然信号肽酶的识别位点。在其它情况中，可以将识别和切割位点导入融合蛋白质编码基因，使得重组蛋白质易于在体外或体内受到其它非天然内切蛋白酶的作用。例如，血液凝结因子Xa、胶原酶、和肠激酶可以用于由多种蛋白质释放不同的融合标签。然而，出于经济的考虑，在大剂量的制药学用途中一般排除内切蛋白酶的使用。
用于在细菌中制备天然蛋白质的另一种方法是使用甲硫氨酸氨肽酶(MAP)来处理由大肠杆菌衍生的重组蛋白质的N末端甲硫氨酸。例如，可以用MAP处理Met-hGH而产生hGH。美国专利4,870,017和5,013,662描述了大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶的克隆、表达、和由多种肽和Met-IL-2除去Met的用途。分析了由多种肽底物释放氨基酸的能力，揭示MAP只切割长度为至少3个氨基酸的肽的N末端甲硫氨酸。第2位和第3位氨基酸的性质也显得很重要。例如，由Met-Ala-Met、Met-Gly-Met、Met-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu(SEQ ID NO：1)、和Met-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys(SEQ ID NO：2)可以释放甲硫氨酸，但是由Met-Phe-Gly、Met-Leu-Phe、Met-Met-Met等不释放甲硫氨酸。由Leu-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu(SEQ ID NO：3)、Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu(SEQ ID NO：4)、或Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys(SEQ ID NO：5)不释放氨基酸。
WO84/02351描述了使用亮氨酸氨肽酶由融合蛋白质制备成熟(天然)蛋白质(诸如人生长激素或人胰岛素原)的方法。通过氨肽酶的逐步切割可以转变具有氨基酸序列(Ym...Y2Y1)-(Pro)p-(X1X2...Xn)的融合蛋白质(其中(Ym...Y2Y1)-(Pro)p是前序列，余下的是成熟蛋白质，m是大于2的整数，Y是任意氨基酸，若X1或X2是Pro则p是0，若X1或X2不是Pro则p是1，X是任意氨基酸，n是大于或等于4的整数)，若p＝1或X1＝Pro则除去氨基酸Ym...Y2，若X2＝Pro则除去基团Ym...Y2Y1，然后，若p＝1则以已知的方式用酶一步或两步切除两个氨基酸Y1-Pro，若X1＝Pro则只类似的切除Y1。
欧洲专利申请EP0204527A1公开了由通式为H-Met-X-Pro-Y-OH的蛋白质除去N末端甲硫氨酸而产生通式为H-X-Pro-Y-OH的蛋白质的方法，其中X是除脯氨酸以外的氨基酸，Y是肽链。优选使用氨肽酶M，但是也可以使用亮氨酸氨肽酶、氨肽酶PO、或氨肽酶P，由人白介素-2和人生长激素除去N末端甲硫氨酸。
气单胞菌氨肽酶(AAP)是由海洋细菌解蛋白气单胞菌分离的外肽酶，也可以用于促进由肽和蛋白质释放N末端氨基酸(Wilkes等人，欧洲生化杂志(Eur.J.Biochem.)34(3)：459-466，1973)。最偏爱的序列是X-//-Y，其中Y是疏水性残基，优选芳香族氨基酸，诸如苯丙氨酸。易于水解的残基包括所有疏水性、芳香族、和碱性氨基酸，还有脯氨酸。甚至在高酶浓度时，也没有由任何检验底物氨基末端除去天冬氨酰基、谷氨酰基、和半胱氨酸残基。但是，可以由寡肽底物释放天冬酰胺、谷氨酰胺、和氨乙基化半胱氨酸。甘氨酸一般耐受水解，但是根据相邻残基可以由有些底物缓慢释放。改变抗衡金属离子，诸如对于游离AAP酶为Cu2+和Ni2+，可以增强AAP对肽底物的活性(Prescott等人，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)114(2)：646-652，1983)。AAP是29.5kDa的金属酶，包含两个二硫键。
欧洲专利EP0191827B1和美国专利5,763,215描述了使用气单胞菌氨肽酶由在外源宿主中形成的真核蛋白质类似物依次除去N末端氨基酸。当将溶于1mL 10mM硼酸钠缓冲液(pH9.5)的8mg甲硫氨酰基-人生长激素(Met-hGH)与溶于Tris缓冲液(pH9.5)的0.4725mg/mL气单胞菌氨肽酶以900∶19的比例混和并于37℃温育时，在15分钟内完成对甲硫氨酸的切割。22小时后，略微切割新的N末端氨基酸亮氨酸。AAP由Met-pST、Met-干扰素、Met-IGF-1、Met-白介素-2(Met-IL-2)、和Met-脱辅基脂蛋白E除去N末端甲硫氨酸。然而，没有由成熟的超氧化物歧化酶除去N末端丙氨酸。
更复杂的方法可以用于生产具有天然氨基末端的重组蛋白质。例如，美国专利5,783,413描述了同时或相继使用(a)一种或多种氨肽酶，(b)谷氨酰胺环化转移酶，和(c)焦谷氨酰胺氨肽酶处理通式为NH2-A-谷氨酰胺-蛋白质-COOH的氨基末端延伸蛋白质而产生所需天然蛋白质。选自下组的第一种氨肽酶催化除去谷氨酰胺氨基末端的残基：二肽基氨肽酶I、气单胞菌氨肽酶、氨肽酶P、和脯氨酸氨肽酶。谷氨酰胺环化转移酶催化谷氨酰胺转变成焦谷氨酰胺，焦谷氨酰胺氨肽酶催化除去焦谷氨酰胺而产生所需蛋白质产物。
美国专利5,565,330和5,573,923公开了由多肽前体氨基末端除去二肽的方法，包括用来自粘菌Dictostelium descoideum的二肽基氨肽酶(dDAP)处理前体，dDAP的分子量为大约225kDa，最佳pH为大约pH3.5。当在自由的溶液中时和当固定在合适的固相支持物表面上时，dDAP加工包含二肽延伸的人胰岛素前体、人胰岛素类似物、和人生长激素。
需要加工重组蛋白质氨基末端氨基酸的更有效策略，来降低模拟天然蛋白质结构的治疗性蛋白质的生产成本。增加重组蛋白质的表达水平或促进重组蛋白质的下游处理的方法也将加速选择和开发用于大剂量临床试验的化学小分子和其它基于蛋白质的分子。
发明概述
本发明的一个目的是描述由重组蛋白质除去N末端丙氨酰基的方法，包括使所述重组蛋白质接触气单胞菌氨肽酶从而除去N末端丙氨酰基，并回收产生的重组蛋白质。
重组蛋白质优选真核起源，甚至更优选选自下组的重组蛋白质：人生长激素(hGH)、牛生长激素(bST)、猪生长激素(pST)、和人组织因子途径抑制剂(TFPI)，最优选hGH。
接触步骤优选在大约pH7-大约pH11之间的pH进行，甚至更优选在大约pH8-大约pH10之间的pH进行，最优选在大约pH8.0-大约pH9.5之间的pH进行。
接触步骤优选在选自下组的缓冲液中进行：硼酸盐、CHES、碳酸氢钠、磷酸钠、和Tris-HCl，更优选硼酸盐、磷酸盐、或Tris-HCl。
接触步骤优选使用固定化的氨肽酶进行。氨肽酶优选固定在层析树脂、层析表面、或层析凝胶上。
重组蛋白质优选流经装有固定了氨肽酶的层析树脂的层析柱。
接触步骤也可以使用未固定(如在自由的溶液中)的氨肽酶进行。
气单胞菌氨肽酶还可能加工在多肽N末端区域包含两个或更多距离很近的丙氨酰基残基的蛋白质。氨肽酶可能依次加工多肽的N末端，或者可能识别在暴露的多肽N末端残基近距离内的额外丙氨酸残基。可以在多种蛋白质和肽底物上评价关于丙氨酰基特异性识别和切割位点的共有序列的阐述。
气单胞菌氨肽酶还可能有助于在本申请公开的条件下进行的对蛋白质N末端区域非丙氨酰基残基的加工。可以在多种蛋白质和肽底物上评价关于这些识别和切割位点的共有序列的阐述。
本发明的另一个目的是描述使用气单胞菌氨肽酶，由通式为X-Y-Pro-Z的多肽前体除去氨基末端氨基酸，从而产生通式为Y-Pro-Z的多肽的方法，其中X是除脯氨酸外的一个或更多氨基酸，Y是任意氨基酸(除了脯氨酸)，Z是一个或多个氨基酸。
X优选丙氨酸。
Y优选选自下组的氨基酸：苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、和天冬氨酸，更优选苯丙氨酸。
更优选的是，X是丙氨酸且Y是苯丙氨酸。
多肽前体优选Ala-hGH。
定义
下面列出了缩写和相应含义，在本文中可交换使用：
g＝克
HPLC＝高效液相层析
kb＝千碱基
mb＝百万碱基
mg＝毫克
ml、mL＝毫升
RP-HPLC＝反相高效液相层析
ug，μg＝微克
ul、uL，μl、μL＝微升
下面列出了各种术语的定义和相应含义，在本文中可交换使用：
术语“aap”和“AAP”指气单胞菌氨肽酶。
术语“ap”和“AP”指氨肽酶。
术语“氨基酸”指所有天然存在的L-氨基酸，包括正亮氨酸、正缬氨酸、高半胱氨酸、和鸟氨酸。
术语“融合分子”指在表达后产生融合蛋白质的蛋白质编码分子或其片段。
术语“融合蛋白质”指包含一个或更多不是由该蛋白质衍生的额外肽区域的蛋白质或其片段。
术语“启动子”广义的指控制mRNA生成的调控序列。
术语“蛋白质片段”指氨基酸序列包含该蛋白质的氨基酸序列的子集的肽或多肽分子。
术语“蛋白质分子/肽分子”指包含5个或更多氨基酸的任何分子。
术语“重组(体)”指由核酸分子的人为操作(间接)产生的任何试剂(如DNA、肽、等等)。
术语“特异性结合”指抗体或肽的结合不受存在的无关分子的竞争性抑制。
术语“基本上纯化的”指含靶分子的天然制剂中存在或可能存在的一种或多种分子已被除去或浓度上有所降低。
图的简述图1-Ala-hGH和hGH的结构
人生长激素(右)是单链多肽(22kDa)，4个半胱氨酸形成2个二硫键。可以在体外用气单胞菌氨肽酶切割Ala-hGH(左)，从而产生正确的N末端序列。图2-由Ala-hGH产生hGH的过程
用于由Ala-hGH纯化hGH的一般过程包括：由细菌包涵体纯化Ala-hGH，Ala-hGH在去污剂中的重新折叠，除去去污剂，酸沉淀，氨肽酶处理，和通过阳离子和阴离子交换柱层析进行的纯化。图3-用AAP由Ala-hGH除去Ala的动力学
图3例示了用AAP由Ala-hGH除去Ala的动力学。在6ml的总体积中，Ala-hGH为3mg/ml，AAP为0.5、1.0、2.0、3.0、和4.0U/ml。于室温进行反应，在25小时内取样，并通过ES/MS分析产物。3种最高浓度的AAP在6小时内完成了大部分反应。图4-酶切割方法选项-柱模式
图4例示了稳流与连续流模式切割方法的比较示意图。图5-Ala-hGH切割的分批模式
图5例示了在分批模式中，Cu-AAP与Zn-AAP相比对Ala-hGH的增强切割的时间进程。图6-Ala-hGH切割的回流模式
图6例示了在柱回流模式中，Cu-AAP与Zn-AAP相比对Ala-hGH切割的时间进程。图7-切割效率的HPLC分析
图7例示了用AAP切割前的、不完全切割的、和反应完成后的Ala-hGH的HPLC图谱。图8-产物的RP-HPLC比较
图8例示了通过用AAP处理Ala-hGH而制备的hGH和hGH的两种商品化制剂(Humatrope和Zomacton)的HPLC图谱。图9-用AAP处理的Ala-hGH的产物的胰蛋白酶图谱分析
图9-12例示了典型的胰蛋白酶谱。图9例示的记录图展示了Ala-T1肽与T1肽的迁移率差异。图10-经胰蛋白酶消化的hGH中残余Ala-hGH的定量分析
图10显示的垂直展开记录图例示了Ala-T1与T1洗脱位置下的峰面积差异。图11-产物的胰蛋白酶谱比较
图11例示了用AAP处理Ala-hGH后纯化的hGH的胰蛋白酶谱与商品化hGH(Humatrope和Zomacton)的胰蛋白酶谱的比较。图12-终产物中Ala-hGH的残余水平(胰蛋白酶谱)
图12显示的垂直展开记录图例示了粗制hGH制剂、hGH的最终大量制剂、和两种商品化hGH(Humatrope和Zomacton)中Ala-T1的存在与否。图13-切割效率的ES/MS分析
图13例示了用AAP切割前的、不完全切割的、和反应完成后的Ala-hGH的ES/MS图谱。图8例示了通过用AAP处理Ala-hGH而制备的hGH和hGH的两种商品化制剂(Humatrope和Zomacton)的HPLC图谱。图14-产物的RP-HPLC、SE-HPLC、和ES/MS分析
图14例示了叠加在一起的Ala-hGH和hGH的ES/MS图谱(下图)与RP-HPLC和SE-HPLC柱上拆分的终产物的HPLC记录图。图15-产物的N末端测序分析
图15例示了由自动蛋白质测序仪在第1轮和第2轮释放的产物的记录图。苯丙氨酸(18.3min)是在第1轮(左图)中检测到的唯一显著残基。脯氨酸(14.2min)是在第2轮(右图)中检测到的唯一显著残基。丙氨酸(*)的量在这两轮中都可以忽略，说明最终的纯化产物中不含N末端丙氨酸残基。
发明详述
下面的实施例将详细例示本发明，但是可以理解，本发明不受这些特定实施例的限制。本领域技术人员在阅读了本公开书之后，显然能够提出不违背本发明精神和范围的各种其它实施例。所有这些实施例都属于所附权利要求书的范围之内。一般方法
用于克隆、表达、和鉴定蛋白质的一般方法可以在《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(T.Maniatis等人，冷泉港实验室，1982)及其参考文献(收入本文作为参考)和《分子克隆，实验室手册》第2版(J.Sambrook等，冷泉港实验室，1989)及其参考文献(收入本文作为参考)中找到。本领域熟知用于构建、操作、和分离抗体的一般和具体的条件和方案，参阅例如《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)(Harlow and Lane，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，1988)。试剂
气单胞菌氨肽酶和所有专业化学药品，除非特别注明，都购自Sigma化学药品公司(圣路易斯，MO)。
Humatrope由Eli Lilly处获得。Zomacton由Gentechnisch处获得。蛋白质纯化
可以使用多种层析法进行蛋白质纯化，诸如离子交换、凝胶过滤、疏水层析、或反相HPLC。《酶学方法》(Methods in Enzymology)第182卷“蛋白质纯化指南”(Murray Deutscher编，Academic出版社，圣地亚哥，加利福尼亚，1990)详细描述了这些和其它蛋白质纯化方法。还可以使用吸附在合适基质上的亲和试剂，诸如单克隆抗体或受体亚基，对折叠的蛋白质进行亲和纯化。
可以通过RP-HPCL、电喷射质谱术、和SDS-PAGE来分析纯化的蛋白质。可以通过氨基酸组成、RP-HPLC、和Bradford蛋白质测定技术来进行蛋白质定量。也可以通过与电喷射质谱术相结合的胰蛋白酶肽谱来确认蛋白质同一性。实施例1：制备丙氨酰基-人生长激素(Ala-hGH)
使用基于mini-Mu的染色体表达系统(Weinberg等人，基因(Gene)126：25-33，1993；美国专利5,395,763和5,514,483；1998年3月19日提交的美国专利申请09/044,369，都收入本文作为参考)，在大肠杆菌中表达Ala-hGH(图1)。Ala-hGH的表达水平为大约1.5-大约2.0g/L。
纯化、重新折叠、并处理Ala-hGH至纯度＞90％(纯度是根据Ala-hGH分析(通过RP-HPLC)和总蛋白质浓度(通过A280吸光率)确定的)。简而言之，使用以前描述的方法(WO98/29433)，分离包涵体，纯化并重新折叠Ala-hGH。于pH10使用酰基谷氨酸酯作为去污剂进行的重新折叠一般产率＞85％。然后通过在水(pH10)中的彻底超滤(10倍体积)，由重新折叠混和物除去去污剂。随后进行酸沉淀步骤，除去大部分重组大肠杆菌蛋白质。由此沉淀步骤回收Ala-hGH的平均回收率为大约80-85％。在用酶处理(优选固定化模式)前，将此半纯化的Ala-hGH在切割缓冲液10mM磷酸盐(pH8.0)中进行透析。酶切割步骤后，通过离子交换层析进一步纯化hGH至大量粉末。图2例示了一般过程的大纲。实施例2.在体外用自由溶液中的气单胞菌氨肽酶处理Ala-人生长激素(Ala-hGH)
在切割步骤前，将Ala-hGH的浓度在10mM硼酸盐(pH9.5)中调至3mg/ml。向此溶液中加入3U/ml气单胞菌氨肽酶，将反应于环境温度进行24-36小时或于37℃进行较短时间。可以通过RP-HPLC或由Ala-hGH释放的Ala氨基酸分析来监测切割反应的进程。在反应终点，通过加入2％乙酸(1∶1.5稀释，w/w)来结束反应。
图3例示了用AAP由Ala-hGH除去Ala的动力学。在6ml的总体积中，Ala-hGH为3mg/ml，AAP为0.5、1.0、2.0、3.0、和4.0U/ml。于室温进行反应，在25小时内取样，并通过ES/MS分析产物。3种最高浓度的AAP在6小时内完成了大部分反应。实施例3.在体外用固定化的氨肽酶处理Ala-人生长激素(Ala-hGH)制备固定化的氨肽酶
通过溴化氰(CNBr)化学法将气单胞菌氨肽酶(AAP)偶联到树脂上，诸如Sepharose 4B树脂。用冷水彻底清洗商品化的CNBr激活的Sepharose 4B树脂，然后悬浮于0.1M碳酸钠缓冲液(pH8.5)或10mM磷酸盐(pH8)。加入AAP(100U/g树脂)，并于4℃轻轻搅动过夜。用水清洗后，用0.5-1M乙醇胺包被树脂，室温2小时。然后用水清洗树脂，并用酶切割缓冲液平衡，诸如10mM磷酸盐(pH8)。通过Sigma建议的标准测定法，使用N-L-亮氨酰基对硝基苯胺作为底物，测量这一固定化酶的活性。平均活性通常为10-20U/ml树脂床。在体外切割Ala-人生长激素(hGH)
分批模式：
将固定化的氨肽酶以1∶1悬浮于硼酸盐或磷酸盐缓冲液中。向装有5ml溶于磷酸盐或硼酸盐缓冲液的Ala-hGH的7ml试管中，加入1ml树脂。由此得到总共6ml，蛋白质浓度3mg/ml。将混和物于20-40℃摇动10-24小时。在反应结束时，过滤除去树脂，并通过RP-HPLC分析产生的溶液。使用CentriCon微量离心设备离心余下的溶液。使用氨基酸分析仪对滤出液分析释放的丙氨酸。在干燥变成粉末用于质谱分析前，将残余液用2％乙酸换4-5次。
表1例示了在分批模式中温度对使用固定化AAP切割Ala-hGH的影响。反应在环境温度加速，并在54小时后基本上完成。
表1.在分批模式中温度对固定化AAP切割Ala-hGH的影响
温度 时间(小时) ％切割
4-6℃ 16 48
54 65
89 75
环境 16 82
54 ＞97
89 ＞97
回流模式：
将溶于10mM硼酸盐(pH9.5)或10mM磷酸盐(pH8.0)的Ala-hGH在预先固定了气单胞菌氨肽酶的Sepharose柱上进行回流。根据蛋白酶的浓度，贮液瓶的体积为100-700ml。通常Ala-hGH的浓度为5-10mg/ml。流速为2-4ml/min。于20℃进行大约24小时。通过RP-HPLC来监测反应。通过质谱和N末端测序来确认切割效率。然后通过离子交换层析进一步纯化终产物。
表2例示了在回流模式中流速对使用固定化AAP于28℃切割Ala-hGH的影响。较短的停留时间一般与极高水平的未切割底物有关。
表2.在回流模式中于28℃对Ala-hGH的切割
流速 流速 停留时间 ％未切割*
(ml/min) (ml/hr) (hr) 胰蛋白酶消化物
0.119 7.14 7.14 0.92
0.167 10.03 5.08 1.18
0.262 15.72 3.24 2.11
0.400 24.00 2.13 (1.65)
0.573 34.38 1.48 2.26
0.867 52.02 0.98 2.17*实验于28℃在柱体积为51ml、缓冲液为10mM磷酸盐(pH8)的层析柱中使用8mg/mi Ala-hGH进行(HPLC)。
表3例示了在回流模式中流速对使用固定化AAP于20℃切割Ala-hGH的影响。较短的停留时间与极高水平的未切割底物直接有关。
表3.在回流模式中于20℃对Ala-hGH的切割
流速 流速 停留时间 ％未切割*
(ml/min) (ml/hr) (hr) 胰蛋白酶消化
0.117 7.02 7.26 1.34
0.164 9.84 5.18 2.12
0.255 15.27 3.34 3.83
0.404 24.21 2.11 4.54
0.567 34.87 1.46 5.20
0.849 50.94 1.00 14.99
1.23 73.64 0.69 21.27实验于20℃在柱体积为51ml、缓冲液为10mM磷酸盐(pH8)的层析柱中使用8mg/ml Ala-hGH进行(HPLC)。*大约1％是随未切割的Ala-T1肽共洗脱的半胱氨酸加合物。
直流模式：
将溶于10mM硼酸盐(pH9.5)或10mM磷酸盐(pH8.0)的Ala-hGH(浓度为8mg/ml)加到预先固定了气单胞菌氨肽酶的Sepharose柱(柱床体积50ml)上。将流速调至15ml/hr，所以停留时间将是大约3小时。通过RP-HPLC、胰蛋白酶消化、质谱、或N末端测序来确认切割效率。收集洗脱液并处理以用于下游层析纯化。
表4例示了在直流模式中流速对使用固定化AAP于28℃切割Ala-hGH的影响。在这些条件下，大部分Ala-hGH受到了AAP的加工。
表4.在直流模式中于28℃的切割
流速 停留时间 ％未切割产物*
(ml/hr) (hr) (基于胰蛋白酶消化产物)
7.14 7.14 ＜0.92
10.03 5.08 ＜1.18
15.72 3.24 ＜2.11
24 2.13 NA
34.4 1.48 ＜2.26
52.02 0.98 NA*所有胰蛋白酶数据都基于未切割Ala-hGH与加工杂质的组合。估计未切割Ala-hGH的真实值为报导值的大约50％。实施例4.稳流与连续流切割方法之间的比较
可以在低得多的流速以一次流经进行柱模式切割，条件是符合总的停留时间。1#运行是典型的回流模式。2#运行的流速是1#运行的1/10。然而，2#运行流经一次需175分钟，而1#运行流经一次只需18分钟。两次运行的总停留时间大致相同，大约180分钟。图4例示了这两种模式。
表5.流速对活性的影响运行 柱 流速 流经 每次流经的 总的停留时间# 体积 (ml/hr) 次数 停留时间 (即接触时间)
(ml)1 57 192 10 18min 180min2 57 19.8 1 175min 175min
表6例示了在回流模式中流经次数对使用固定化AAP于28℃切割Ala-hGH的影响。在这些条件下大部分Ala-hGH受到了AAP的加工。
表6.于28℃在磷酸盐缓冲液中回流
时间(hr) 流经次数 ％切割 分析方法
2.92 1.06 ＞93 RP-HPLC
5.73 2.08 ＞96.1 胰蛋白酶谱
15.57 5.66 ＞98.6 胰蛋白酶谱
17.73 6.45 ＞98.6 胰蛋白酶谱
20.4 7.42 ＞98.6 胰蛋白酶谱
23.4 8.8 ＞98.8 胰蛋白酶谱
24.4 8.87 ＞98.8 胰蛋白酶谱
39.7 14.44 ＞99.2 胰蛋白酶谱
*[Ala-hGH]＝9.2mg/ml；上样量500ml
表7例示了温度和停留时间对切割Ala-hGH的影响。温度相差10度显得影响切割效率。若需要较高的％切割，则可能要求较长的停留时间。
表7.温度和停留时间对稳流切割方法的影响
运行# 温度 流速 停留时间 ％切割*
℃ ml/hr min
1A 20 0.28 182 ＞98.5
1B 30 0.28 182 ＞99.1
2A 20 0.51 100 ＞95.8
2B 30 0.51 100 ＞98.3
*通过肽谱法来分析切割产物。实施例5.用铜增强AAP的丙氨酰基加工活性
在用于体外处理Ala-hGH的固定化系统中检验了用Cu2+或Ni2+替代AAP的天然催化辅助因子Zn2+的影响。可以由AAP纯化过程中的步骤直接制备Cu-AAP，或者用铜取代商品中存在的锌抗衡金属从而进行转变。可以对游离的酶或固定化的形式进行转变。由Zn-AAP Sepharose制备固定化Cu-AAP
如下所述固定Cu-AAP。将含10ml树脂床体积的20ml树脂浆(样品A)置于250mi烧结玻璃漏斗中，真空抽滤至近乎干燥。向树脂中加入20ml50mM Tricine/50mM KCl(pH7.5)和20ml 1，10-邻二氮杂菲，混和20分钟。除去溶液，并置于含1，10-邻二氮杂菲的新鲜缓冲液中，再混和2小时。除去缓冲液，用水和HEPES(pH7.5)清洗树脂浆。将获得的树脂分装两管，每管12ml。向B管中加入溶于50mM HEPES(pH7.5)的0.2mMCuCl2；向C管中加入溶于50mM HEPES(pH7.5)的0.2mM ZnCl2。将两管轻轻摇动3小时。用水彻底清洗树脂浆，并保存于所需缓冲液中，诸如硼酸盐(pH9.5)。
表8.金属修饰的AAP对Leu-pNA的活性
样品 金属AAP 活性U/ml床
底物：Leu-pNA
A(原样) Zn-AAP 8.94
B Zn-AAP 8.59
C Cu-AAP 5.47
在分批和回流柱模式中比较Cu-AAP与Zn-AAP切割Ala-hGH的速率。在分批切割试验中，向2.056ml 10mM硼酸盐缓冲液(pH9.5)中加入0.5ml 1∶1树脂浆(B或C)，然后加入Ala-hGH至终浓度0.8mg/ml。在24小时内跟踪反应，用0.45μm滤器过滤采集的样品以除去固定化酶从而终止反应。然后通过RP-HPLC分析滤出液，测定经切割的Ala-hGH部分。
在回流柱切割试验中，将1cm×5cm柱装填Cu-AAP树脂(B)或对照AAP树脂(B)。用10mM磷酸盐平衡这些柱，将50ml 4.75mg/ml Ala-hGH在这些柱上以2CV/hr的流速进行回流。于3hr、6hr、18hr、和28hr采集流出液，并如上所述终止反应用于分析。
图5例示了在分批模式中，Cu-AAP与Zn-AAP相比对Ala-hGH的增强切割的时间进程。图6例示了在柱回流模式中，Cu-AAP与Zn-AAP相比对Ala-hGH的时间进程。
在检验的所有反应条件下，Cu2+替代的AAP对Ala-hGH的活性最高(图5和图6)，但是Cu-AAP水解显色底物N-亮氨酰基-对硝基苯胺(pNA)的活性较低(表8)。实施例6.用气单胞菌氨肽酶处理Ala-hGH产生的产物的详细结构分析Ala-hGH的纯化
溶解/重新折叠
将包涵体(IB)浆加到预先混和的溶液中，该溶液含34.5g碳酸氢钠、156g基于氨基酸(如肌氨酸和/或谷氨酸)的去污剂、和826ml水。将溶解的IB溶液于室温搁置20分钟，加入100mM胱氨酸溶液(pH10.0)。将溶液于室温搅动15小时，然后冷却至4℃。经获得的重新折叠混和物浓缩至4升，然后在水(pH10.0)中进行透析。
酸性沉淀
将透析后的溶液用水(pH10.0)稀释至Ala-hGH浓度达到大约2.5mg/ml。于4-6℃使用蠕动泵加入2％乙酸至pH达到大约pH5.6。将酸化溶液再搅动30分钟。然后使用Sorvall RC5C离心机于4℃以6000rpm离心30分钟。倒出上清液，然后在10mM磷酸钠(pH8.0)中进行透析。将蛋白质浓度调至8mg/ml。
酶切割
通过溴化氰(CNBr)化学法(Hermanson，1992)将气单胞菌氨肽酶偶联到树脂上，诸如Sepharose 4B树脂。通过Sigma建议的标准测定法，使用N-L-亮氨酰基对硝基苯胺(Leu-pNA)作为底物，测量这一固定化酶的活性。将溶于10mM磷酸盐(pH8.0)的冷的Ala-hGH溶液(8mg/ml)流经装备有水套并维持于25℃的固定化酶柱。将流速调至大约8ml/hr，以确保Ala-hGH与固定化酶之间有足够接触时间。然后，在对阳离子柱上样前，将切割池的缓冲液换成3M尿素/0.05M乙酸(pH5.0)(缓冲液A)。
阳离子柱
将阳离子样品加到装有CM Sepharose树脂的2.2×20cm Amicon柱上。总的上样量为2.0g Ala-hGH。加样后，用1CV(柱床体积)的缓冲液A进行清洗，然后用总共54CV的0-0.2M NaCl梯度进行洗脱。流速为4CV/hr。以0.2CV的级分收集洗脱液，并用Gilson全色素检测仪于280nm监测洗脱液。通过阳离子交换HPLC分析收集液，并合并纯度＞95％的收集液。
阴离子柱
将阳离子合并液加到装有Pharmacia Q-Sepharose树脂的1.6×20cm Amicon柱上。加样后，用1CV的缓冲液A进行清洗。进行40CV溶于0.05M Tris-HCl(pH7.5)的0-0.15M NaCl线性梯度洗脱。如上所述收集洗脱液。通过阴离子交换HPLC分析收集液，并合并纯度＞98％的收集液。切割产物的结构分析
用于分析切割反应的最方便方法是RP-HPLC。然而，唯一可靠的定量分析是肽消化法。在这种方法中，对Ala-T1的检测极限是0.25％。
氨基酸分析
切割反应后，用配备了截留分子量10kDa的滤膜的Centricon离心溶液。可以用氨基酸分析仪测量滤出液中的丙氨酸浓度。然后可以根据由反应释放的丙氨酸的量来计算切割程度。另外，检测到任何其它氨基酸都指示存在非特异性切割。
RP-HPLC分析
在Vydac 214ATP54柱上，使用正丙醇(NPA)/0.25M磷酸盐(pH6.5)(26∶74)作为流动相，通过无梯度洗脱法来分析Ala-hGH和hGH。于40℃进行分离。这种方法主要用于监测通过酶切割Ala-hGH形成hGH。它还作为第二种工具，用于决定由阳离子交换柱收集哪些收集液。
图7和图8例示了典型的HPLC图谱。图7例示了用AAP切割前的、不完全切割的、和反应完成后的Ala-hGH的HPLC图谱。图8例示了通过用AAP处理Ala-hGH而制备的hGH和hGH的两种商品化制剂(Humatrope和Zomacton)的HPLC图谱。
使用胰蛋白酶的肽谱
用0.5N NaOH将hGH溶液调至pH7.5。将此溶液用50mM Tris碱(pH7.5)稀释至终浓度2mg/ml。然后加入15ml溶于50mM Tris碱(pH7.5)的1mg/mL胰蛋白酶溶液。将样品混和，并于37℃温育4小时，然后用50ml 0.5M HCl终止反应。将一部分经消化溶液加到RP-HPLC上，并通过溶于0.1％TFA的乙腈梯度对肽进行拆分。
这种方法为评价hGH一级和二级结构的完整性提供了信息。最重要的是，这是用于分析切割溶液中和最终产物中痕量水平未切割Ala-hGH的最好方法。hGH与Ala-hGH的胰蛋白酶消化产物之间的唯一差异是N末端八肽，即T1与Ala-T1。这两种肽是使用无梯度RP-HPLC法拆分的基线。T1： FPTIPLSR (SEQ ID NO：6)Ala-T1： AFPTIPLSR (SEQ ID NO：7)
图9-12例示了典型的胰蛋白酶谱。图9例示的记录图展示了Ala-T1肽与T1肽的迁移率差异。图10显示的垂直展开记录图例示了Ala-T1与T1洗脱位置下的峰面积差异。图11例示了用AAP处理Ala-hGH后纯化的hGH的胰蛋白酶谱与商品化hGH(Humatrope和Zomacton)的胰蛋白酶谱的比较。图12显示的垂直展开记录图例示了粗制hGH制剂、hGH的最终大量制剂、和两种商品化hGH(Humatrope和Zomacton)中Ala-T1的存在与否。
电喷射质谱(ES/MS)
根据hGH(22，125)和Ala-hGH(22，195)的峰强度进行测量。存在其它峰指示有非特异性酶切割。
图13例示了用AAP切割前的、不完全切割的、和反应完成后的Ala-hGH的ES/MS图谱。图8例示了通过用AAP处理Ala-hGH而制备的hGH和hGH的两种商品化制剂(Humatrope和Zomacton)的HPLC图谱。
图14例示了Ala-hGH和hGH的叠加ES/MS图谱(下图)与终产物进行RP-HPLC和SE-HPLC柱拆分的记录图。
N末端测序
通过标准方法进行N末端蛋白质测序。Ala(存在于Ala-hGH)与Phe(存在于hGH)作为N末端氨基酸的相对量指示切割程度。通过N末端序列分析也可以检测到内部切割。
图15例示了由自动蛋白质测序仪在第1轮和第2轮释放的产物的记录图。苯丙氨酸(18.3min)是在第1轮(左图)中检测到的唯一显著残基。脯氨酸(14.2min)是在第2轮(右图)中检测到的唯一显著残基。丙氨酸(*)的量在这两轮中都可以忽略，说明最终的纯化产物中不含N末端丙氨酸残基。实施例7.在体外使用氨肽酶处理丙氨酰基组织因子途径抑制剂(Ala-TFPI)
使用溶液中的AAP可以将由大肠杆菌分离的Ala-TFPI(US5,212,091)加工成TFPI。将正确重新折叠的Ala-TFPI在10mM磷酸盐(pH8.0)或10mM硼酸盐(pH9.5)中调至0.5-3mg/ml。向此溶液中加入3U/ml气单胞菌氨肽酶，将反应于环境温度进行24-36小时或于37℃进行较短时间。可以通过HPLC或由Ala-TFPI释放的Ala氨基酸分析来监测切割反应的进程。在反应终点，通过加入2％乙酸(1∶1.5稀释，w/w)来结束反应。通过胰蛋白酶切肽片段的HPLC分析和分离产物的ES/MS来测定切割程度。
还可以如上所述使用固定化的AAP来将Ala-TFPI加工成TFPI。通过胰蛋白酶消化肽片段的HPLC分析和分离产物的ES/MS来测定切割程度。
完整收入本文引用的所有参考文献、专利、或专利申请作为参考，就像本文所写。
序列表<110>Jacob Tou
Douglas Taylor<120>用气单胞菌氨肽酶由多肽除去N末端丙氨酸残基的方法<130>S03108-00-US<150>60/132,062<151>1999-04-30<160>7<170>FastSEQ for Windows Version4.0<210>1<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>用于检验大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶的底物特异性的合成肽<400>1
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
1 5 10<210>2<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>用于检验大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶的底物特异性的合成肽<400>2Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Gln Cys1 5 10<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>用于检验大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶的底物特异性的合成肽<400>3Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>用于检验大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶的底物特异性的合成肽<400>4Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>用于检验大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶的底物特异性的合成肽<400>5Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Gln Cys1 5 10<210>6<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>T1是天然人hGH的N末端胰蛋白酶消化肽<400>6Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>Ala-T1是Ala-hGH的N末端胰蛋白酶消化肽<400>7Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg1 5
Claims (21)
1.由重组蛋白质除去N末端丙氨酰基的方法，包括使所述重组蛋白质接触气单胞菌氨肽酶从而除去N末端丙氨酰基，并回收产生的重组蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白质是真核起源的。
3.权利要求2的方法，其中所述重组蛋白质选自下组：人生长激素(hGH)、牛生长激素(bST)、猪生长激素(pST)、和人组织因子途径抑制剂(TFPI)。
4.权利要求1的方法，其中所述接触步骤是在大约pH7-大约pH11之间的pH进行的。
5.权利要求4的方法，其中所述接触步骤是在大约pH8-大约pH10之间的pH进行的。
6.权利要求5的方法，其中所述接触步骤是在大约pH8.0-大约pH9.5之间的pH进行的。
7.权利要求1的方法，其中所述接触步骤是在选自下组的缓冲液中进行的：硼酸盐、CHES、碳酸氢钠、磷酸钠、和Tris-HCl。
8.权利要求7的方法，其中所述缓冲液是硼酸盐。
9.权利要求7的方法，其中所述缓冲液是磷酸钠。
10.权利要求7的方法，其中所述缓冲液是Tris-HCl。
11.权利要求1的方法，其中所述氨肽酶是固定化的。
12.权利要求11的方法，其中所述氨肽酶固定在层析树脂、层析表面、或层析凝胶上。
13.权利要求12的方法，其中所述重组蛋白质流经装有固定了氨肽酶的层析树脂的层析柱。
14.权利要求1的方法，其中所述氨肽酶是未固定的(在自由的溶液中进行)。
15.由权利要求1的方法制备的不含N末端丙氨酸的重组蛋白质。
16.使用气单胞菌氨肽酶，由通式为X-Y-Pro-Z的多肽前体除去氨基末端氨基酸，从而产生通式为Y-Pro-Z的多肽的方法，其中X是除脯氨酸外的一个或更多氨基酸，Y是除脯氨酸外的任意氨基酸，Z是一个或多个氨基酸。
17.权利要求16的方法，其中X是丙氨酸。
18.权利要求16的方法，其中Y是选自下组的氨基酸：苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、和天冬氨酸。
19.权利要求18的方法，其中Y是苯丙氨酸。
20.权利要求16的方法，其中X是丙氨酸且Y是苯丙氨酸。
21.权利要求19或20的方法，其中多肽前体是Ala-hGH。
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