CN1715409A - 制备药用级重组人尿胰蛋白酶抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

从尿液中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂(Humanurinary trypsin inhibitor，h－UTI)已经在临床中得到广泛地应用。本发明描述如何在甲醇酵母中构造可以分泌表达重组人尿胰蛋白酶抑制剂(Recombinant human urinary trypsin inhibitor，rh－UTI)融合蛋白的工程菌株，以及经过发酵、粗纯化、酶切、精纯化和一系列性质对比试验，最终确定了产量、纯度及药效学特征均合乎规模生产和临床应用要求的工程菌株以及rh－UTI生产制造工艺。

Description

制备药用级重组人尿胰蛋白酶抑制剂的方法

技术领域

本发明描述了采用重组DNA技术在甲醇酵母(Pichia pastoris)中生产制备一种目前是从人尿液中提取的糖蛋白类药物------人尿胰蛋白酶抑制剂(Human urinarytrypsin inhibitor，h-UTI)，特别是该生产用甲醇酵母工程菌株的构造、发酵，表达产物的纯化、性质确证以及药效试验等。

背景技术

1909年Bauer和Reich等就报道了人尿中存在一种胰蛋白酶抑制剂，也就是所谓的人尿胰蛋白酶抑制剂(Human urinary trypsin inhibitor，h-UTI)，但直到1977年Sumi等才成功地纯化出尿液中的这种糖蛋白分子。h-UTI是人血浆中的间-α-胰蛋白酶抑制剂(Inter-α-trypsin inhibitor，I-α-TI)降解产物。研究证实：人血浆中的I-α-TI蛋白是由三条重链(H1、H2、H3，MW75～80kDa)蛋白分子和一条轻链蛋白Bikunin分子(MW 25kDa)经硫酸软骨素分子共价连接而成的丝氨酸蛋白酶抑制剂复合分子，它代谢转变后，其中连接有硫酸软骨素分子的Bikunin分泌到尿液之中，成为h-UTI。因此Bikunin也可以说就是h-UTI的前身，也有称h-UTI为尿抑素(Ulinastatin)。由于h-UTI分子内有N-糖基化和O-硫酸软骨素分子修饰，所以，自人尿中提取的h-UTI分子是一种高度糖基化修饰的蛋白，许多研究表明：h-UTI的质谱分子量约为25～26kDa，而SDS-PAGE电泳显示分子量大约在35～45kDa之间，但是通过分子筛测得的分子量却与人血白蛋白相当，约67kDa左右(Kaczmarczyk，A.，Proteins of the Inter-α-inhibitorFamily---Biosynthesis，Plasma Clearance and Interaction with Extracellular MatrixComponents ISSN 0282-7476，Printed in Sweden by Nina Tryckeri，Uppsala 2003)。

早在1985年，日本就将从人尿中提取的h-UTI用于临床实践，而国内1994年广州天普(Techpool)生化医药股份有限公司也将提取的h-UTI用于临床。h-UTI的主要适应症为急性胰腺炎，慢性胰腺炎的急性发作，急性循环衰竭，肿瘤、休克和外科手术中辅助用药，防治顺铂化疗时对肾功能的损伤，AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗等。该提取成分临床疗效明确、副反应小、生产成本低，但是作为从尿中提取的一类药物，如何避免各种病毒污染和保证产品的质量稳定性也是一大技术难题。

能采用基因重组的手段获得重组人尿胰蛋白酶抑制剂(Recombinant HumanUrinary trypsin inhibitor，rh-UTI)是一项能将基础和应用研究有机结合的工作，但是，早年有报道称h-UTI糖蛋白分子中的硫酸软骨素分子是h-UTI发挥胰蛋白酶抑制剂作用的必要部分(Selloum，L.，etal.，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，368：47～55，1987)，因此，在非哺乳动物细胞表达系统(如，E.coli，酵母)中产生的rh-UTI能不能形成正确的糖基化修饰是非常关键的。但是，德国的Bayer Aktiengesellschaft公司1995年申请的美国专利(US5407915，Human bikunin variants as proteinase inhibitors，and medicamentscontaining these)就很好地证明了糖基化并非是其活性所必须的，该专利中还描述了啤酒酵母表达的rh-UTI分子的N-端有严重的不均一性问题：60％rh-UTI具有天然的N-端，而40％的N-端少一个丙氨酸(Ala)。之后，有许多研究都表明，E.coli重组表达的rh-UTI同样具对胰蛋白酶等酶抑制作用(Brinkmann，T.，etal J Biol Chem.，272(17)：11171～11175，1997)，很明显，糖基化修饰在h-UTI分子中的作用需要重新审视。不过用现有的酵母或大肠杆菌生产rh-UTI的产量太低，加之蛋白的均一性不能保证，虽有一些研究报道，但是一直没有规模化生产和动物模型试验方面的研究报道，因此，有关rh-UTI的临床价值仍然十分难以确定。

我们将人的h-UTI基因插入到专门的表达载体PICZa-DoI中，就成功地解决了酵母中表达h-UTI均一性以及表达产量不高等技术难题。在酵母中表达的rh-UTI的氨基酸序列(见SEQ-2)、糖基化位点以及二硫键连接次序如图1所示。有关表达载体PICZa-DoI的详细资料请参考本人2004年4月23日提交的题为“一种利用甲醇酵母系统高效表达tPA等外源蛋白的方法及其表达产物的纯化制备技术”(申请号：200410017881.4)的专利。

发明内容

1.重组人尿胰蛋白酶抑制剂高表达工程菌株的获得

在甲醇酵母(Pichia pastoris，Pichia methanolica)中我们了进行直接表达rh-UTI的实验研究，但是表达产量很低，所以将h-UTI基因导入我们申请过专利的融合型表达载体PICZa-DoI的多克隆位点KpnI和NotI之间，得到PICZa-DoI-UTI融合表达载体(见图2)。有关该融合型表达载体的详细情况请参见中国专利(申请号：200410017881.4)。

表达载体PICZa-DoI-UTI经测序确证序列正确无误后，按Invitrogen公司的操作手册中的方法进行转化、表达筛选就可以得到能表达DoI-UTI融合蛋白的菌株。为能获得高拷贝的转化子，采取了特殊的转化方式将PICZa-DoI-UTI中的DoI-UTI基因用XhoI-NotI双切出来亚克隆至载体pPIC9和载体pMETaA的XhoI-NotI之间，构造出融合表达载体pPIC9-DoI-UTI和pMETa-DoI-UTI。线性化pPIC9-DoI-UTI表达载体，转化筛选出GS115型高表达菌株，用线性化pMETa-DoI-UTI表达载体转化PMAD11型菌株，筛选出高表达的PMAD11型菌株。最后，再用线性化的PICZa-DoI-UTI表达载体电转化由筛选出的GS115型和PMAD11型高表达菌株制备的感受态，分别铺板在高Zeocin(≥500ug/ml)的YPD板筛选高抗性克隆，通过这种两级转化，就使最终的转化子的基因拷贝数不断增加，从理论上说，如此筛选出的工程菌种，GS115型和PMAD11型菌株比X33型菌株的拷贝数要高的多，最终我们根据表达产量的高低，筛选确定了三株GS115-UTI(GS115/pPIC9-pPICZa-DoI-UTI)、X33-UTI(X33/pPICZaDoI-UTI)和PMAD11-UTI(PMAD11/pMETa-pPICZa-DoI-UTI)三个菌株，它们是可以高效表达rh-UTI融合蛋白，具体实现过程见实施例1。

2.重组人尿胰蛋白酶抑制剂的发酵、纯化过程研究

构造的工程菌种按造Invitrogen的发酵操作手册中的程序，在30L发酵罐(BioengineeringAG)中进行中试规模的盐培养基发酵，其中发酵过程的关键性参数是pH6.0、30℃、溶氧在20％～30％之间，诱导时间为50小时。诱导结束后离心收集发酵上清液，添加NaCl，用NaOH调节发酵上清液的pH至7.4，添加磷酸盐至终浓度为50mM，膜过滤即得可用于Ni²⁺-螯合层析上样的发酵液。50mM咪唑洗脱下DoI-UTI融合蛋白，脱盐并将DoI-UTI转换到肠激酶的酶切缓冲溶液中，酶切完成后再过螯合层析介质和离子交换介质就可以得到纯度合乎要求的rh-UTI。

3.重组人尿胰蛋白酶抑制剂的性质确证

在甲醇酵母中以融合分泌表达的DoI-UTI，在SDS-PAGE电泳时的表观分子量约45kDa，这同DoI-UTI融合蛋白的理论分子量40.2kDa相差5kDa左右，大量研究证明DoI分子没有糖基化修饰等蛋白后修饰发生，所以融合蛋白DoI-UTI分子中增加的5kDa是N-糖基化和O-糖基化等修饰后糖链部分。将融合蛋白DoI-UTI酶切，再经过一系列的纯化步骤就获得了143个氨基酸残基组成糖蛋白分子rh-UTI，其蛋白质部分的理论分子量是15.47kDa，理论等电点pI约为4.545，但是我们在酵母中获得的rh-UTI分子的MW在23～24kDa之间，实际测定的pI为4.5～5.0之间。虽然大量的实验研究证明天然和重组的h-UTI对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶、精子酵素(Acrosin)、组织蛋白酶B(Cathepsin)、组织蛋白酶H、溶酶体硫醇蛋白酶(Lysosomalthiol protease)等都有很强的抑制作用，但是我们试验研究发现天然的h-UTI对肠激酶和凝血酶均不具有抑制作用，这也正是采用融合表达并用肠激酶切割融合蛋白的这一设计思路的实验基础。用天普公司生物提取的UTI(注射用乌司他丁)作对照，采用Iketa等方法(Iketa，K.，Agric Biol Chem，42(4)：309～312，1978)测定rh-UTI的活性，发现rh-UTI同天然的h-UTI没有明显区别。

4.重组人尿胰蛋白酶抑制剂的药效学试验

rh-UTI具有天然h-UTI的全部功能，它可以抑制许多丝氨酸蛋白酶的活性。具有广泛的临床用途，用急性胰腺炎动物模型试验结果表明，rh-UTI同天然的h-UTI一样，对急性胰腺炎的诊断、防治和预后应该具有重要意义。

有关缩写的说明

h-UTI是人尿胰蛋白酶抑制剂的英文名Human urinary trypsin inhibitor的缩写，根据上下文可以是指人尿胰蛋白酶抑制剂蛋白或其基因，本专利中的h-UTI作蛋白含义时特指源于人尿的胰蛋白酶抑制剂，它具有特别的人源性糖基化修饰；DoI是特指人血白蛋白的三个结构域(Domain)中的第一个结构域，所以DoI实质是HSA Domain I的简写，是一段多肽，如果是HSA Domain I的基因序列一般会描述为DoI基因或基因片段；DoI-UTI特指由DoI基因和h-UTI基因片段通过连接肽连接而成的融合基因或融合基因表达出的DoI-UTI融合蛋白，一旦切开DoI-UTI融合蛋白后，释放出来的h-UTI部分就特称rh-UTI，以区别从尿中提取的天然的h-UTI；rh-UTI是指通过重组DNA技术在非哺乳动物细胞(如E.coli、酵母、昆虫细胞等)中直接或间接表达出来的有糖基化或没有糖基化修饰，但具有同天然h-UTI或Bikunin相同或相近的氨基酸序列组成，并且生物学功能也相当的一类基因重组人尿胰蛋白酶抑制剂蛋白分子的通称，在本专利中rh-UTI特指我们在甲醇酵母中制备的h-UTI，其糖基化修饰具有酵母的特征。

附图说明

图1.rh-UTI蛋白的一级结构

☆代表可能的O-糖基化修饰，★代表可能的N-糖基化修饰。

图2.表达载体PICZa-DoI-UTI

图3.工程菌株在试管中诱导48小时DoI-UTI表达量

A.X33-UTI/pPICZaDoI-UTI菌株；B.GS 115-UTI/pPIC9-pPICZaDoI-UTI；

C.PMAD11-UTI/pMETa-pPICZaDoI-UTI；M.Pharmacia蛋白标准97kDa、67kDa、45kDa、

30kDa、20.1kDa和14.4kDa。

图4.DoI-UTI的纯化和酶切

4-1.DoI-UTI融合蛋白的纯化

a.发酵液；b.螯合层析上样流出液；c.50mM PB，0.3M NaCl，pH7.4，10mM咪唑；

d.50mM PB；e.50mM PB，50mM咪唑；f.50mM PB，100mM咪唑；g.50mM PB，

20mM EDTANa₂

4-2.肠激酶切割DoI-UTI融合蛋白

0～12hrs代表不同时间取样

图5.rh-UTI纯品的SDS-PAGE电泳

A为还原电泳；B为非还原电泳

1～6泳道的上样量依次为2.4ug、4.8ug、7.2ug、9.6ug、12ug和14.4ug。

具体实施方式

实施例1：重组人尿胰蛋白酶抑制剂(rh-UTI)工程菌种的构造

1.rh-UTI基因的获得和表达载体PICZa-DoI-UTI的构造

参考Genbank中人Bikunin基因序列，合成hBIK5和hBIK3两条引物：

hBIK5：5`-cat  ggtacc gat gat gat gac aaa gct gtg cta ccc caa gaa gag-3`

hBIK3：5`-cat  gcggccgc tta cag cag ctc ctc atc acc-3`

以人正常胎肝组织cDNA(Lot：A604235，Biochain Institute，Inc)的为模板，按下述体系及条件PCR出人的Bikunin基因片段(见SEQ-1)。

50ul PCR体系：

cDNA(模板)--------------------------2.0ul

hBIK5(正向引物)---------------------5.0ul

hBIK3(反向引物)---------------------5.0ul

dNTP--------------------------------2.5ul

10XPfu缓冲液------------------------5.0ul

Pfu酶-------------------------------0.5ul

dH2O-------------------------------30ul

                                        合计50ul

PCR条件：94℃-40秒、54.5℃-40秒、73℃-50秒，30轮循环。

PCR结束后取样电泳可见有约500bp片段(474bp)特征性片段产生，柱回收PCR产物、KpnI-NotI双切、1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收470bp的h-UTI基因片段备用。将PICZa-DoI载体用KpnI-NotI双切并进行胶回收，作插入用载体。将h-UTI基因片段和PICZa-DoI连接，转化Novagen公司的大肠杆菌NovaBlue感受态，在LB+25ug/ml Zeocin平板上筛选插入h-UTI基因的阳性克隆，用α-Signal Factor和3AOX1引物进行全基因测序，由表达载体中的DoI基因片段和插入的h-UTI基因构成一个融合基因DoI-UTI，该融合基因表达出的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ-1和SEQ-3所述，我们特将此表达载体命名为PICZa-DoI-UTI，其结构如图2。

2.表达载体pPIC9-DoI-UTI和pMETa-DoI-UTI的构造

将上述经测序确证的PICZa-DoI-UTI载体用XhoI和NotI双切，胶回收DoI-UTI基因片段。同时，用XhoI/NotI分别双切pPIC9和pMETaA并胶回收载体作插入之用，将DoI-UTI和pPIC9或pMETaA分别建立连接反应，筛选插入DoI-UTI基因的克隆，测序确证，得到表达载体pPIC9-DoI-UTI和pMETa-DoI-UTI。

3.转化筛选高表达的工程菌株

DNA限制性内切酶SacI线性处理表达载体PICZa-DoI-UTI，电转化甲醇酵母(Pichiapastoris)宿主菌X33，铺板至YPD+500ug/ml Zeocin，30℃培养3天，挑单克隆培养于含有500ug/ml Zeocin的24孔板中，共筛选了96个克隆，30℃培养10小时，肉眼观察有5个培养孔中的菌生长迅速，密度甚高，这就是高抗性克隆。将这5个孔中的菌液转入试管中，补加YPD至3ml，继续培养4小时，按操作手册中的方法留种，BMMY培养基诱导，每24小时补加甲醇，48小时后终止诱导，取上清SDS-PAGE电泳查看表达量。同非高抗性克隆相比，高抗性的克隆的表达产量明显高。DoI-UTI表达时的基因剂量效应很明显。我们将PICZa-DoI-UTI转化X33得到的高表达菌种称为X33/pPICZaDoI-UTI，简称X33-UTI(见图3)。

用SacI线性化后的pPIC9-DoI-UTI电转化GS115His-，铺MD平板，筛选阳性克隆，常规筛选，电泳检测表达量高的克隆，共筛选6个克隆，其中有2个克隆表达量比较高，取其中一个克隆，YPD培养制备，将其制备成电转化用的感受态，按照上述PICZa-DoI-UTI转化X33类似的方法，用线性化过的PICZa-DoI-UTI载体，对其进行再转化，将转化液铺于含500ug/ml Zeocin的YPD平板上，筛选高抗克隆，这样就得到整合了更多目的融合基因DoI-UTI的克隆，如此一来，该酵母GS115株就含有pPIC9和PICZa-DoI质粒载体带入的两组基因，特将此法筛选出的高表达菌株简称GS115-UTI。依此类推，可以筛选出PMAD11-UTI高表达菌株，有关他们的表达情况参见图3。

实施例2：重组人尿胰蛋白酶抑制剂的发酵、纯化制备

中试发酵纯化过程选用了GS115-UTI菌种，按照Invitrogen发酵操作指南中的描述，在30L发酵罐中进行，发酵和纯化的全过程(参见图4和图5)可简述为：

1.种子液的准备

菌种划线于YPD平板上，倒置于30℃培养箱中48小时后，挑一单克隆转接入装有25mlYPD培养液的250ml摇瓶中，30℃、280rpm培养18小时至OD₆₀₀在4～6时，镜检酵母形态正常且无杂菌污染后，按1∶500的比例再转接入一瓶装有500ml YPD培养液1L摇瓶中，30℃、280rpm培养18小时，OD₆₀₀达5-7，镜检酵母形态正常且无杂菌污染后，作为上罐用种子液。

2.增殖及诱导表达阶段

将上述种子液按1∶20接种至已灭菌后的罐培养基中，进行菌体增殖培养，此阶段为菌体增殖阶段。当罐培养基中的碳源耗尽后，溶氧(DO)值会在1分钟内急剧上升，此时继续流加甘油，流加速率以维持DO值不低于20％为限。此阶段称限速生长阶段。当菌体湿重为180～200g/L时停止补料为诱导做准备，待碳源耗尽出现DO急剧上升后，就可以开始补入甲醇，此时转换成以甲醇为碳源继续发酵，进入了甲醇酵母发酵的诱导表达阶段，通过调节搅拌转速、罐压、空气流量、通氧和流加甲醇速率使溶氧不低于20％，并保持此状态至发酵结束。由于甲醇酵母发酵过程中能产生较多的酸性物质，所以PH呈下降趋势，可以通过补加氨水将pH保持在6.0左右，此一过程达到调节pH并补充氮源的双重目的。

3.发酵上清的获得及后处理

发酵结束后，4,000rpm转速离心收集发酵上清，用5.0M的NaCl加入发酵液中，使终浓度约为0.3M，用1N NaOH调节发酵液的pH至7.4，再加入1.0M的PB(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH7.4)到终浓度为50mM。Φ0.45nm的膜过滤后即成可以上样发酵液

5.螯合层析从发酵液中直接捕获DoI-UTI融合蛋白

将上述处理好的发酵上清液上样至经过缓冲液A(50mM PB，0.3M NaCl，pH7.4)平衡过的Chelating Sepharose Fast Flow介质，上样结束后再用缓冲液A平衡至基线，先用10mM咪唑+缓冲液A洗脱除去吸附的杂质，再用缓冲液B(50mM PB，pH7.4)冲洗3～4个柱体积，将缓冲体系变换成无NaCl的体系，用50mM咪唑+缓冲液B洗脱出DoI-UTI融合蛋白。

6.DoI-UTI的脱盐处理

50mM Tris-HCl，0.2mM CaCl₂，pH7.4平衡Sephadex G25柱，每次脱盐时的上样体积不超过柱体积的20％。如果规模放大，处理体积大，则用Millipore超滤系统将螯合层析步骤中的目的洗脱峰缓冲液替换成50mM Tris-HCl，0.2mM，CaCl₂，pH8.0的缓冲液，便于使用肠激酶进行酶切。

7.肠激酶酶切DoI-UTI融合蛋白释放rh-UTI分子

由于DoI-UTI具有rh-UTI的生物学活性，肠激酶切割融合蛋白后产生的rh-UTI都能够抑制发酵液和粗纯品中的其他蛋白水解酶的活性，所以加大肠激酶的用量也不会产生异常的切割活性。所以DoI-UTI的切割条件对酶量和温度都没有特别的要求，在达到酶切效果的前提下，使用最小的酶量，一般按1单位(U)的肠激酶切割40ug的DoI-UTI融合蛋白的比例向融合蛋白溶液中加入重组肠激酶。

8.螯合层析除去酶切混合物中的杂蛋白

将酶切后的DoI-UTI溶液过经过20mM PB，pH7.4平衡后的Chelating SepharoseFast Flow介质，收集流出液，其中的没有完全切割的DoI-UTI融合蛋白和切割释放出来的DoI等结合到介质上，切割出的rh-UTI就直接流出。

9.阳离子层析浓缩并精纯化rh-UTI

将上述rh-UTI流出液用冰醋酸下调pH至3.8，上经过50mM的醋酸-醋酸钠，pH3.8平衡后的SP-Sepharose FF或CM-Sepharose FF，增加NaCl浓度至0.6M，就可以洗脱出介质上结合的rh-UTI蛋白，此步获得的rh-UTI纯度不低于98.7％。

实施例3：重组人尿胰蛋白酶抑制剂的性质确证

按照实施例2中的方法制备的rh-UTI依据SFDA的质检标准要求进行了蛋白酶抑制活性、比活性、蛋白纯度、分子量测定、等电点、N-端-C-端测序等方面的研究检测，以确定其基本性质。

1.h-UTI的蛋白酶抑制活性-比活性测定

1.1.对胰蛋白酶抑制作用的分析

用benzoyl-L-arg-p-NA作底物，按照Geiger等的方法(Geige&Fritz，Methods ofEnzymatic Analysis，Vol V，3^rded.，Bergmeyer(ed.)，Verlag Chemie，Weinheim，p.121，1984)进行，释放出的p-NA用分光光度计在405nm波长检测。酶和抑制剂在添加底物之前预温15分钟。结果表明rh-UTI能有效抑制胰蛋白酶的活性。

1.2.对弹性蛋白酶抑制作用的分析

人的弹性蛋白酶购自上海生物工程公司，底物选择MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(Sigma)，按照Nakajima等描述的方法(Nakajima etal.，J.Biol.Chem.，254，4027，1979)，测定rh-UTI对弹性蛋白酶的抑制率达到95％。

1.3.对肠激酶抑制作用的分析

肠激酶有识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X-R序列，其中的X是目的蛋白(X-R)的N-端第一个氨基酸残基，可以是除Pro外的任意氨基酸。我们用pET32a载体表达的硫氧环蛋白-人睫神经营养因子(Trx-CNTF)融合蛋白作为底物，该融合蛋白的Trx和CNTF之间插入有肠激酶识别序列。购买天普公司的商品化注射用乌司他丁，按0.5万、4万和8万位添加到酶切反应液中，每隔4小时取样，电泳检测Trx-CNTF融合蛋白被肠激酶切割的情况，电泳结果表明，天然的UTI对肠激酶的活性没有任何抑制作用，甚至高达8万单位的UTI也没有抑制作用，这正是本项目采用融合表达，并选择肠激酶切割融合蛋白这一设计思路的基础。

1.4凝血酶抑制作用的分析

首先配制浓度为0.2mg/ml的人纤维蛋白原，5ATU/ul的人凝血酶作测定用。人凝血酶为丝氨酸蛋白酶，添加至人纤维蛋白原中可以切割纤维蛋白原，将其转变成纤维蛋白，进而聚集凝固成纤维蛋白凝块。向人纤维蛋白原溶液中分别添加1万、3万、6万和10万单位的乌司他丁或rh-UTI后，再加入人凝血酶，发现纤维蛋白原均在1～2分钟内凝固。可见，乌司他丁和rh-UTI对凝血酶没有抑制作用。

1.5.rh-UTI的比活性测定

参照Iketa等测定方法(Iketa，K.，Agric Biol Chem，42(4)：309～312，1978)测定，用注射用乌司他丁作药品作对照品，最终测得rh-UTI的比活为2,500U/mg，同天然乌司他丁(2,000～3,000U/ml)没有明显区别。

2.蛋白纯度、分子量测定、等电点以及N-端-C-端测序测定

采用HPLC法和SDS-PAGE还原和非还原电泳的方法检定纯度，通过本专利中描述的工艺制备出的rh-UTI的纯度不低于98.7％。HPLC的采用十八烷基键合硅胶为填充剂，理论塔板数不低于2000的色谱柱。以A相(0.1％三氟醋酸-水溶液)、B相(0.1％三氟醋酸-乙腈溶液)为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱(0～70％B相)，检测波长280nm。按归一化法计算，主峰面积显示纯度达99.92％，保留时间为10.49分钟；SDS-PAGE电泳显示分子量约为23～24kDa，质谱测定分子量为24kDa；等电聚焦测定pI为4.4～5.0之间。N-端测序结果为：Ala-Val-Leu-Pro-Gln-Glu-Glu-Glu-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gln-Leu-，C-端测序结果为--Glu-Leu-Leu。

实施4：重组人尿胰蛋白酶抑制剂的活性测定和药效试验

根据李涛等建立急性胰腺炎动物模型的方法(中国比较医学杂志13(6)：358～361，2003)，采用胆总管末端结扎法建立Wistar大鼠急性胰腺炎模型，具体过程如下：

1.方法：Wistar大鼠66只，随机挑6只为正常组，其余60只在手术显微镜下进行胆总管末端结扎，建立实验性急性胰腺炎动物模型，将60只模型动物随机均分为三组：rh-UTI治疗组、乌司他丁治疗组和非治疗组。观察组织病理变化，并检测血清淀粉酶和血糖的变化。

2.实验结果：

血清淀粉酶和血糖变化比较(x±S)(与正常组比P＜0.05，治疗组间P＜0.01)

组别	时间(h)	血清淀粉酶(U/ml)	血糖(mmol/ml)
				正常组(n＝6)		800.23±118.0	4.94±0.51
rh-UTI治疗组(n＝20)	12	1325.31±156.37	4.91±0.71
				48	1134.57±102.25	4.81±0.92
	96	863.11±113.57	4.92±0.52
				乌司他丁治疗组(n＝20)	12	1362.21±186.44	4.79±0.34
48	1054.77±122.50	4.89±0.72
			96		879.11±103.17	4.88±0.78
非治疗组(n＝20)	12	1774.75±206.21					4.83±0.79
			48	4757.38±683.61	4.82±0.84
	96	14579.75±1286.96				3.69±0.68

3.结论：rh-UTI组的治疗效果同乌司他丁组没有显著差异，实验急性胰腺炎模型的血糖在前48小时仍在正常范围，但96小时后未治疗组的血糖受影响显著，而rh-UTI和乌司他丁治疗组动物的血清胰淀粉酶和血糖均接近正常值。

蛋白质和DNA序列描述

SEQ-1序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：461bp

b.类型：核苷酸

c.拓扑学：线性

(2).分子类型：人cDNA

(3).序列描述：SEQ-1

1  GGTACCGATG ATGATGACAA AGCTGTGCTA CCCCAAGAAG AGGAAGGATC

51 AGGGGGTGGG CAACTGGTAA CTGAAGTCAC CAAGAAAGAA GATTCCTGCC

101 AGCTGGGCTA CTCGGCCGGT CCCTGCATGG GAATGACCAG CAGGGTATTTC

151 TATAATGGTA CATCCATGGC CTGTGAGACT TTCCAGTACG GCGGCTGCAT

201 GGGCAACGGT AACAACTTCG TCACAGAAAA GGAGTGTCTG CAGACCTGCC

251 GAACTGTGGC GGCCTGCAAT CTCCCCATAG TCCGGGGCCC CTGCCGAGCC

301 TTCATCCAGC TCTGGGCATT TGATGCTGTC AAGGGGAAGT GCGTCCTCTT

351 CCCCTACGGG GGCTGCCAGG GCAACGGGAA CAAGTTCTAC TCAGAGAAGG

401 AGTGCAGAGA GTACTGCGGT GTCCCTGGTG ATGGTGATGA GGAGCTGCTG

451 TAAGCGGCCG C

SEQ-2序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：143氨基酸

b.类型：氨基酸

c.拓扑学：未知

(2).分子类型：蛋白质

(3).序列描述：SEQ-2

1   Ala Val Leu Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Gly Gly Gln Leu 15

16  Val Thr Glu Val Thr Lys Lys Glu Asp Ser Cys Gln Leu Gly Tyr 30

31  Ser Ala Gly Pro Cys Met Gly Met Thr Ser Arg Tyr Phe Tyr Asn 45

46  Gly Thr Ser Met Ala Cys Glu Thr Phe Gln Tyr Gly Gly Cys Met 60

61  Gly Asn Gly Asn Asn Phe Val Thr Glu Lys Glu Cys Leu Gln Thr 75

76  Cys Arg Thr Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro 90

91  Cys Arg Ala Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly 105

106 Lys Cys Val Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn 120

121 Lys Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro 135

136 Gly Asp Gly Asp Glu Glu Leu Leu                             143

SEQ-3序列的资料：

(1).序列特征：

a.长度：365基酸

b.类型：氨基酸

c.拓扑学：未知

(2).分子类型：蛋白质

(3).序列描述：SEQ-3

1   Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly 15

16  Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr 30

31  Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu 45

46  Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu 60

61  Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys 75

76  Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Lys Met Ala Asp Cys 90

91  Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln Leu 105

106 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 120

121 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Ash Glu Glu Thr Phe Leu 135

136 Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr 150

151 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe 165

166 Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro 180

181 Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Gly 195

196 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His 210

211 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Val Leu 225

226 Pro Gln Glu Glu Glu Gly Ser Gly Gly Gly Gln Leu Val Thr Glu 240

241 Val Thr Lys Lys Glu Asp Ser Cys Gln Leu Gly Tyr Ser Ala Gly 255

256 Pro Cys Met Gly Met Thr Ser Arg Tyr Phe Tyr Asn Gly Thr Ser 270

271 Met Ala Cys Glu Thr Phe Gln Tyr Gly Gly Cys Met Gly Asn Gly 285

286 Asn Asn Phe Val Thr Glu Lys Glu Cys Leu Gln Thr Cys Arg Thr 300

301 Val Ala Ala Cys Asn Leu Pro Ile Val Arg Gly Pro Cys Arg Ala 315

316 Phe Ile Gln Leu Trp Ala Phe Asp Ala Val Lys Gly Lys Cys Val 330

331 Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Gly Asn Lys Phe Tyr 345

346 Ser Glu Lys Glu Cys Arg Glu Tyr Cys Gly Val Pro Gly Asp Gly 360

361 Asp Glu Glu Leu Leu                                         365

Claims (10)

1.一种由基因工程酵母菌株分泌的融合蛋白，通过纯化制备过程后得到具有医药用途的重组人尿胰蛋白酶抑制剂(rh-UTI)分子，该分子具有生物学活性、特定的酵母糖基化修饰以及SEQ-2所描述的氨基酸序列组成等特征；

2.权利要求1中的所述的基因工程酵母菌株可以是Pichia pastoris、Pichia methanolica、Hansenula polymorpha和Saccharomyces cerevisiae等；

3.权利要求1中所述的融合蛋白是由人血白蛋白(HSA)的第一结构域通过含有(His)₆和肠激酶切点等序列的肽段与rh-UTI连接形成，其氨基酸序列组成如SEQ-3所描述；

4.权利要求1中所述的纯化制备过程具体包括螯合亲和层析捕获、肠激酶酶切融合蛋白和阳离子交换层析精纯化等步骤；

5.根据权利要求4，其螯合亲和层析介质为Chelating Sepharose FF，捕获融合蛋白时首选金属离子Ni²⁺、Zn²⁺，最后使用含咪唑的缓冲液选择性的洗脱目的蛋白；

6.权利要求5中的洗脱缓冲液由20～100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄和20～100mM咪唑组成，pH6.8～8.0；

7.权利要求6中的最适合洗脱缓冲液为50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，50mM咪唑，pH7.4；

8.权利要求1中所述的特定的酵母糖基化修饰包括N-糖基化和O-糖基化等修饰方式，其糖基化修饰具有酵母的糖链特征和单糖组成；

9.根据权利要求1，rh-UTI不具有对肠激酶和凝血酶的有抑制活性；

10.权利要求1中所述的医药用途是指本方法制备的rh-UTI可以用于急性胰腺炎，慢性胰腺炎的急性发作，肿瘤、休克和外科手术中辅助用药以及防治顺铂化疗时对肾功能的损伤等。