CN1884542A - 一种真盐生植物细胞质膜水通道蛋白基因及其所编码的蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真盐生植物(Euhalophyte)细胞质膜水通道蛋白基因及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域。海蓬子(Salicornia bigeloii Torr.)细胞质膜水通道蛋白基因SbPIP1 cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.2。本发明基因为该属植物和真盐生植物中首次报道，参与正常和渗透胁迫下的水分吸收及运输，mRNA表达分析表明该基因受高盐和干旱的诱导。转基因实验证明该基因的超量表达提高了促进了拟南芥生长并提高了其耐旱和耐盐性。SbPIP1可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐或耐旱性。

Description

一种真盐生植物细胞质膜水通道蛋白基因及其所编码的蛋白质

技术领域

本发明公开了一种真盐生植物细胞质膜水通道蛋白基因及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域，具体地讲涉及植物中编码正常和渗透胁迫条件下水分吸收的关键蛋白水通道蛋白及其编码基因。

技术背景

干旱或高盐等对植物产生的胁迫为害主要是造成了细胞吸水的障碍，并由形成了离子毒害和代谢紊乱。1993年Maurel等人第一次从甜土植物拟南芥中克隆了液泡膜水通道蛋白。其后的研究表明水通道蛋白是植物大量吸取水分的主要通道，在水分吸收和运输方面发挥着重要的作用。细胞质膜水通道蛋白(PIP)是植物四种水通道蛋白之一，也是在水分吸收方面最重要的一种水通道蛋白。盐生植物具有天然的强耐盐能力，典型的盐生植物海蓬子(Salicornia bigeloii Torr.)的最适生长条件要求200mMNaCl的高盐浓度，可以用海水直接灌溉种植，而大多数作物如水稻、玉米、小麦和拟南芥等均无法在此条件下生长，在盐生植物中海蓬子也属于强耐盐的种类型，即真盐生植物，因此其在水分和离子平衡方面的基因或蛋白可能不同于一般的甜土植物。分离和克隆海蓬子水分吸收和运输的相关基因并进行遗传转化，对提高植物抵御干旱、低温和高盐等非生物胁迫，培育抗旱植物新品种及保证粮食安全具有重要的意义。

发明内容

技术问题  本发明的目的在于公开一种真盐生植物水通道蛋白基因及其所编码的蛋白质，该基因来自海蓬子，可作为目的基因导入植物，提高植物耐干旱和耐盐性，进行植物品种改良。

技术方案

本发明海蓬子细胞质膜水通道蛋白基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

上述的细胞质膜水通道蛋白基(SbPIPl)基因来自盐生植物海蓬子，其编码的蛋白质，来自海蓬子(Salicornia bigeloii Torr.)，它具有如下所示的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。上述海蓬子细胞质膜水通道蛋白(SbPIP1)基因的应用，包括：

1)总RNA的提取和cDNA的合成

选用发芽后20天的海蓬子幼苗为材料，用200M NaCl处理后24h、48h和72h处理后的植株为Tester材料，以无NaCl处理材料为Dirver，分别收取各处理基因的整株幼苗300mg，在液氨下研磨放入7ml离心管，加入3ml Trizol RNA分离试剂盒分离液，室温静置10分钟，11000g4℃离心15分钟，收集上清液，分别用异丙醇和75％己醇沉淀和洗涤RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，用紫外分光光度计上测定RNA含量；以5μg总RNA为模板利用1μl反转录酶MMLV42℃50分钟合成单链cDNA；

2)植物表达载体的构建

根据SbPIP1基因的全长序列，见SEQ ID NO.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamH和SacI，设计引物为：

上游引物：5’-CTCAAGCTTTCAGTGACTG-3’

下游引物：5’-GATATGGATTACCTCGAAG-3’

以步骤1)中获得的单链cDNA为模板，经PCR扩增后获得可用于转化载体构建的SbPIP1基因，将SbPIP1克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121，在保证阅读框架正确的前提下鉴定表达载体；

3)转基因植株的获得

将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐盐性评价，在1.0％NaCl处理3天后能够在正常生长条件下恢复的T2代转基因烟草植株即为所获得的转基因植株。

有益效果

1、本发明公开了一种真盐生植物水通道蛋白基因(SbPIP1)及其所编码的蛋白质。为从该强耐盐属中克隆的第一个水通道基因/蛋白。该基因可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐性，以进行植物品种改良。所编码的蛋白质具有渗透胁迫功能。

2、本发明人提供的SbPIP1基因功能是海蓬子根系吸收水分的主要通道。Norhtern Blot分析表明SbPIP1基因在根系特异表达，在200mM NaCl处理24-72小时表达持续稳定.在处理组根系中表达相对于对照组(无NaCl处理)显著下降，表明其在渗透胁迫条件下通过表达降低来提高细胞和组织的持水能力和持水量.

3、本发明的SbPIP1基因来自强耐盐植物海蓬子，其基因工程受体植物适合大多数作物如如水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、烟草等。

4、利用本发明SbPIP1基因作为目的基因构建植物表达载体，可用多种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子。该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

具体实施方式

1)总RNA的提取和cDNA的合成

选用发芽后20天的海蓬子幼苗为材料，用200M NaCl处理后24h、48h和72h处理后的植株为Tester材料，以无NaCl处理材料为Dirver，分别收取各处理基因的整株幼苗300mg，在液氨下研磨放入7ml离心管，加入3ml Trizol RNA分离试剂盒分离液，室温静置10分钟，11000g4℃离心15分钟，收集上清液，分别用异丙醇和75％己醇沉淀和洗涤RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，用紫外分光光度计上测定RNA含量；以5μg总RNA为模板利用1μl反转录酶MMLV42℃50分钟合成单链cDNA；

2)海蓬子抑制消减杂交文库的构建及克隆筛选与测序

以盐生植物海蓬子(Salicornia bigelovii Torr.)发芽后20d天的幼苗为材料，以无NaCl处理为驱动组(Driver)，以200mM NaCl处理24h、48h和72h内的幼苗为检测组(Tester)，构建抑制消减杂交的cDNA文库：

cDNA第一链和第二链的合成及抑制消减杂交具体操作依照Clontech试剂盒PCR-Slect TMc DNA Subtraction Kit试剂盒进行，Tester双链cDNA经QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化和Rsa I消化后分成两部分，并分别连接粘端接头1和接头2：

接头1：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′

                                         3′-GGCCCGTCCA-5′

接头2：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′

                                       3′-GCCGGCTCCA-5′

两份Tester再分别与经Rsa I消化后双链Driver cDNA进行杂交。杂交产物混合后进行两次PCR扩增，第一次PCR扩增引物为：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，扩增条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性30s，56℃45s，72℃45s，36个循环后，72℃10min；第二次扩增引物为：5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′和5′-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′，扩增条件为94℃变性45s，57℃45s，72℃45s，35个循环后，72℃10min。反应体系均为24μl。为了提高载体连接效率，消减杂交产物按QIAGENPCR纯化试剂盒的方法进一步纯化，产物经纯化浓缩后与pGEM-T(Promega)载体连接，形成质粒文库；

从文库中随机挑取450个克隆进行单向测序，得到有效的差异表达序列标签(EST)363条，这些序列目前均可从NCBI dbEST数据库中查寻(序列标签363条代号为DY529734-DY530096)。

对其中代号为Sb360(GenBank Accession No.DY530090)的EST进行BLASTn/x分析表明其为细胞质膜水通道蛋白的部分序列。以5’-CGAGGGTGCCATTTGTGGTGC-3’为GSP引物，按3’RACEcDNA末端快速扩增试剂盒(System for Rapid Ampiification of cDNA Endskit，Invitrogen公司产品)方法扩增3’端序列。PCR程序如下：94℃45秒，72℃45秒，54℃45秒和72℃10分钟，35个循环。产物经电泳分析后由上海欧易生物科技有限公司双向重复2次测序。经DNAStar拼接后确认为该基因的790bp-1268bp部分。以5’-GAAAGCTTGAGTTTAAATC-3’和5’-GCAAGAATTTACATTTCC-3’为引物进行全编码区扩增，PCR程序如下：94℃3分钟，94℃45秒，72℃45秒，50℃45秒和72℃10分钟，36个循环。产物按QiagenPCR DNA片段纯化试剂盒纯化后与pGEM-T(Promega)载体连接。将连接后载体的电转化宿主菌在37℃下培养20min，加入5ml融化的LB/MgSO4琼脂，混匀后倒入37℃预热的LB/MgSO4平板上，冷却10min，37℃培养12h；取2ml融化的上层琼脂，依次加入50μl IPTG/X-Gal贮存液。将阳性克隆以pGEM-T载体上的3’-ATTATGCTGAGTGATATCCC-5’(T7)和3’-AAGATATCACAGTGGATTTA-5’(SP6)为测序引物，上海欧易生物科技有限公司完成双向重复3次测序，最终获得具有完整准确的海蓬子细胞质膜水通道蛋白基因SbPIP1的cDNA序列SEQ ID NO.1。

上述获得盐生植物海蓬子细胞质膜水通道蛋白基因SbPIP1的cDNA序列编码的蛋白质，来自盐生植物海蓬子(Salicornia bigeloii Torr.)，氨基酸序列为SEQ ID NO.2，经在数据库中比较它的编码蛋白与甜菜、冰花、拟南芥、玉米的水通道蛋白的相似性分别为92％、87％、86％、83％。SbPIP在细胞质膜上有6个跨膜区域，N端和C端均处于细胞质一侧，该蛋白含有完整的MIP保守区(major intrinsic protein)，含有两天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸(Asp-Pro-Ala)的水通道蛋白指示氨基酸序列。

以SbPIP1的cDNA为探针，分别与检测组和驱动组cDNA进行反向Northern杂交，结果表明，其在检测组中mRNA表达量与驱动组相比明显下降40％。说明SbPIP1的表达与渗透胁迫有关。

3)植物表达载体的构建

根据海蓬子细胞质膜水通道蛋白基因SbPIP1的cDNA序列，见SEQ ID NO.1的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamH和SacI，设计引物为：

上游引物：5’-CTCAAGCTTTCAGTGACTG-3’

下游引物：5’-GATATGGATTACCTCGAAG-3’

以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经93℃3min，93℃45sec，50℃45sec，72℃45sec，循环35次的PCR扩增后，经93℃3min，93℃45sec，50℃45sec，72℃45sec，循环35次的PCR扩增后，将SbPIP1的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121，在保证阅读框架正确的前提下鉴定的表达载体；

4)转基因植株的获得

将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入拟南芥，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐盐性评价，对获得的转基因植株进行PCR鉴定，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐盐和耐干旱性评价。将转基因植株的T2代和对照植株进行200mM-400mM NaCl的持续处理，观察他们的生长表现，结果表明转基因烟草在1.0％NaCl处理3天后能够在正常生长条件下恢复，而对照则死亡。在1.0％NaCl处理3天后能够在正常生长条件下恢复的T2代转基因烟草植株即为所获得的转基因植株。

根据实施例1得到SbPIP1的的全长序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物5’-GAAAGCTTGAGTTTAAATC-3’和5’-GCAAGAATTTACATTTCC-3’，并在上游和下游分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定，如插入pBI121载体的BamHI位点)，以便构建表达载体。将SbPIP1的cDNA克隆至中间载体pGEM-T和promega，进一步克隆到双元表达载体pBI121和改进的pCAMBIA1301，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，转入拟南芥和烟草。对获得的转基因植株进行PCR鉴定，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐盐和耐干旱性评价。将转基因植株的T2代和对照植株进行200mM-400mM NaCl的持续处理，观察他们的生长表现，结果表明转基因烟草在1.0％NaCl处理3天后能够在正常生长条件下恢复，而对照则死亡。

综上所述，本发明提供的盐生植物海蓬子细胞质膜水通道蛋白SbPIP1基因是首次在该强耐盐属中克隆的新基因，其功能参与正常和渗透胁迫下的水分吸收和运输。本发明所述的水通道蛋白(基因)可能存在于所有生物体包括植物、微生物、动物和人类等。SbPIP1为首个强耐盐海蓬子属水通道蛋白基因。可利用本发明SbPIP1基因进行引物设计发现更多多的该属植物或其近缘种植物的其它水通道蛋白基因，它也可以作为目的基因构建植物表达载体，除可以利用逆境诱导型启动子以外，也可以用其它种类的常规启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子和报告基因。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

本发明的基因来自双子叶盐生植物海蓬子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1262bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：285aa

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

                           序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>一种盐生植物细胞质膜水通道蛋白基因及其所编码的蛋白质

<141>2006-03-03

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID NO.1

<211>1262

<212>DNA

<213>海蓬子(Salicornia bigelovii Torr.)

<221>CDS

<222>(86)..(940)

<221>3′UTR

<222>(941)..(1262)

<221>mRNA

<222>(1)..(1262)

<221>polyA_site

<222>(1243)..(1262)

<221>5′UTR

<222>(1)..(85)

<400>1

1   gaattaaaaa aacctacaca aaacaacact cactctctct ctctcactaa aattcagtca

61  ctgaaagctt gagtttaaat caaaa

86  atg gaa gga aag gag gaa gat gta aga cta gga gca aac aaa ttc

    Met Glu Gly Lys Glu Glu Asp Val Arg Leu Gly Ala Asn Lys Phe

131 ggc gag aag caa ggg ttg ggg acg gtg gcg caa gac aga gac tac

     Gly Glu Lys Gln Gly Leu Gly Thr Val Ala Gln Asp Arg Asp Tyr

176  aag gag cca ccg cca gcg ccg ctg ttt gag cca ggg gag ctg acg

     Lys Glu Pro Pro Pro Ala Pro Leu Phe Glu Pro Gly Glu Leu Thr

221  tca tgg tcg ttt tac aga gca gga att gca gag ttt att gcg act

     Ser Trp Ser Phe Tyr Arg Ala Gly Ile Ala Glu Phe Ile Ala Thr

266  ttc ttg ttt ctt tac atc agt atc ttg act gtt atg ggg tat aac

     Phe Leu Phe Leu Tyr Ile Ser Ile Leu Thr Val Met Gly Tyr Asn

311  cgt gct acc aac aag tgt gct act gtt ggt att cag ggt att gct

     Arg Ala Thr Asn Lys Cys Ala Thr Val Gly Ile Gln Gly Ile Ala

356  tgg tct ttt ggt gga atg atc ttt gcc ctt gtt tac tgc act gct

     Trp Ser Phe Gly Gly Met Ile Phe Ala Leu Val Tyr Cys Thr Ala

401  gga att tct gga ggt cac att aac cca gca gtg aca ttg gga ctg

     Gly Ile Ser Gly Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Leu Gly Leu

446  ttc ttg gca agg aag tta tcc ttg aca agg gct gtt ttc tac atg

     Phe Leu Ala Arg Lys Leu Ser Leu Thr Arg Ala Val Phe Tyr Met

491  atc atg caa tgt ttg ggt gcc att tgt ggt gct ggt gta gtc aag

     Ile Met Gln Cys Leu Gly Ala Ile Cys Gly Ala Gly Val Val Lys

536  ggc ctc caa ccc acc cca ttc cag tcg act ggt ggt ggg gcc aac

     Gly Leu Gln Pro Thr Pro Phe Gln Ser Thr Gly Gly Gly Ala Asn

581  tac att cac cac ggt tac acc aag ggt gac ggt ctc ggt gct gag

     Tyr Ile His His Gly Tyr Thr Lys Gly Asp Gly Leu Gly Ala Glu

626  att gtc ggc acc ttc gtt ctc gtc tac acc gtc ttc tct gcc act

     Ile Val Gly Thr Phe Val Leu Val Tyr Thr Val Phe Ser Ala Thr

671  gac gcc aag cga agc gct agg gac tct cat gtt cct atc ttg gct

     Asp Ala Lys Arg Ser Ala Arg Asp Ser His Val Pro Ile Leu Ala

716  ccc ttg cct att gga ttc gcc gtg ttc ttg gtt cac ttg gcc acc

     Pro Leu Pro Ile Gly Phe Ala Val Phe Leu Val His Leu Ala Thr

761  atc ccc gtt act ggc acc ggt atc aac cct gct agg agt ctt ggt

     Ile Pro Val Thr Gly Thr Gly Ile Asn Pro Ala Arg Ser Leu Gly

806  act gcc atc atc tac aac agc gac ctt aac tct tgg aac gac cac

     Thr Ala Ile Ile Tyr Asn Ser Asp Leu Asn Ser Trp Asn Asp His

851  tgg gtg ttc tgg gtg gga ccc ttc att gga gca gca ctg gta gct

     Trp Val Phe Trp Val Gly Pro Phe Ile Gly Ala Ala Leu Val Ala

896  gta tac cat aca gtg gtg atc aga gca atc cca ttt aaa tcc aag

     Val Tyr His Thr Val Val Ile Arg Ala Ile Pro Phe Lys Ser Lys

941  tgatgatgat tgatcataat ataatataat ggatggatgt ttgattggat ttatctcatt

1001 agcctgtatt ttttatttta agctattgat gatggatgat aaattaatat gaaatcccat

1061 gtgccctttt ttttttcatt atttatcctt tttttttaat ttgtttggct atgtaagtta

1121 attgtactct ttaagatatg gattacctcg aagaatcctg agagggttgt ttgtggtttg

1181 cactgggtgt ggaaatgtaa attcttgcct tcatttttat gtttatgatg gtcattttgt

1241 agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa

<210>SEQ ID NO.2

<211>285

<212>PRT

<213>海蓬子(Salicornia bigelovii Torr.)

<400>2

Met Glu Gly Lys Glu Glu Asp Val Arg Leu Gly Ala Asn Lys Phe

                  5                   10                 15

Gly Glu Lys Gln Gly Leu Gly Thr Val Ala Gln Asp Arg Asp Tyr

                 20                   25                 30

Lys Glu Pro Pro Pro Ala Pro Leu Phe Glu Pro Gly Glu Leu Thr

                 25                   40                 45

Ser Trp Ser Phe Tyr Arg Ala Gly Ile Ala Glu Phe Ile Ala Thr

                 50                   55                 60

Phe Leu Phe Leu Tyr Ile Ser Ile Leu Thr Val Met Gly Tyr Asn

                 65                   70                 75

Arg Ala Thr Asn Lys Cys Ala Thr Val Gly Ile Gln Gly Ile Ala

                 80                   85                 90

Trp Ser Phe Gly Gly Met Ile Phe Ala Leu Val Tyr Cys Thr Ala

                 95                  100                105

Gly Ile Ser Gly Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Leu Gly Leu

                110                  115                120

Phe Leu Ala Arg Lys Leu Ser Leu Thr Arg Ala Val Phe Tyr Met

                125                  130                135

Ile Met Gln Cys Leu Gly Ala Ile Cys Gly Ala Gly Val Val Lys

                140                  145                150

Gly Leu Gln Pro Thr Pro Phe Gln Ser Thr Gly Gly Gly Ala Asn

                155                  160                165

Tyr Ile His His Gly Tyr Thr Lys Gly Asp Gly Leu Gly Ala Glu

                170                  175                180

Ile Val Gly Thr Phe Val Leu Val Tyr Thr Val Phe Ser Ala Thr

                185                  190                195

Asp Ala Lys Arg Ser Ala Arg Asp Ser His Val Pro Ile Leu Ala

                200                  205                210

Pro Leu Pro Ile Gly Phe Ala Val Phe Leu Val His Leu Ala Thr

                215                  220                225

Ile Pro Val Thr Gly Thr Gly Ile Asn Pro Ala Arg Ser Leu Gly

                230                  235                240

Thr Ala Ile Ile Tyr Asn Ser Asp Leu Asn Ser Trp Asn Asp His

                245                  250                255

Trp Val Phe Trp Val Gly Pro Phe Ile Gly Ala Ala Leu Val Ala

                260                  265                270

Val Tyr His Thr Val Val Ile Arg Ala Ile Pro Phe Lys Ser Lys

                275                  280                285

Claims (3)

1、一种真盐生植物细胞质膜水通道蛋白(SbPIP1)基因，来自海蓬子(Salicorniabigeloii Torr.)，命名为SbPIP1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2、权利要求1所述基因所编码的一种真盐生植物水通道蛋白，来自海蓬子(Salicornia bigeloii Torr.)，命名为SbPIP1蛋白质，它具有如下所示的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3、权利要求1所述海蓬子细胞质膜水通道蛋白(SbPIP1)基因的应用，包括：

1)总RNA的提取和cDNA的合成

选用发芽后20天的海蓬子幼苗为材料，用200MNaCl处理后24h、48h和72h处理后的植株为Tester材料，以无NaCl处理材料为Dirver，分别收取各处理基因的整株幼苗300mg，在液氨下研磨放入7ml离心管，加入3ml Trizol RNA分离试剂盒分离液，室温静置10分钟，11000g4℃离心15分钟，收集上清液，分别用异丙醇和75％己醇沉淀和洗涤RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，用紫外分光光度计上测定RNA含量；以5μg总RNA为模板利用1μl反转录酶MMLV42℃50分钟合成单链cDNA；

2)植物表达载体的构建

根据SbPIP1基因的全长序列，见SEQ ID NO.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamH和SacI，设计引物为：

上游引物：5’-CTCAAGCTTTCAGTGACTG-3’

下游引物：5’-GATATGGATTACCTCGAAG-3’

以步骤1)中获得的单链cDNA为模板，经PCR扩增后获得可用于转化载体构建的SbPIP1基因，将SbPIP1克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121，在保证阅读框架正确的前提下鉴定表达载体；

3)转基因植株的获得

将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐盐性评价，在1.0％NaCl处理3天后能够在正常生长条件下恢复的T2代转基因烟草植株即为所获得的转基因植株。